成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

要約

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

要約

成体ラットおよび増殖因子に富む培地中で培養したヒト脊髄神経幹/前駆細胞（NSPCs）は、自己再生、及び拡張可能な神経幹細胞の多能性の増殖を可能にします。血清条件では、これらの多能NSPCsは、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトを生成し、差別化されます。採取した組織は、酵素パパイン-EDTA溶液中で解離した後、機械的に上皮成長因子（EGF）を補充した神経基礎培地中に播種された単一細胞懸濁液を、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGFを得るために、不連続密度勾配を介して分離し、分離されています）、およびヘパリン。成体ラットの脊髄NSPCsは、接着培養として成長させた自由浮動ニューロスフェアと成人の脊髄NSPCsとして培養されます。これらの条件下では、成人脊髄NSPCsは、前駆細胞のマーカーを発現し、増殖し、連続的に通過時に拡張することができます。これらの細胞は、bはできeは、様々な刺激に応答してインビトロで研究され、外因性因子は、神経幹細胞の分化を調べるために系統限定を促進するために使用することができます。多能NSPCsまたはそれらの子孫はまた、再生修復を評価するために種々の動物モデルに移植することができます。

概要

NSPCsは自己更新し、容易にin vitroで拡大することができる神経系統にコミット多能性細胞です。彼らは自己複製多能性幹細胞、より制限された前駆細胞のプロパティを表示するので、我々は、神経幹/前駆細胞の混合集団として、これらの細胞を指します。 NSPCsは胎児および成人の脳と脊髄の^1,2の両方で発見されています。成人では、NSPCsは通常、静止状態であり、側脳室^2-4を裏打ちする脳室下帯、及び脊髄^5,6の中心管の周囲の脳室周囲領域を含む特定のニッチ内に存在します。

一般的に、NSPCsは、EGFおよびbFGFを添加した無血清培地中で自由に浮遊ニューロスフェアとして、または接着性単層、幹細胞/前駆細胞集団を選択マイトジェンとして培養されます。もともとレイノルズとワイス²によって開発されたニューロスフェアアッセイは、最も一般的に培養するために使用され、神経幹細胞を展開します。それらは血清を含む成長因子を含まない培地にプレーティングされている場合NSPCsは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化、多分化を示します。培養組織は、中心管^6,7の領域を含む場合には、多能、自己複製NSPCsは、成体齧歯類脊髄から単離し、培養することができます。他の地域からの細胞を生成するのではなく、成人の脊髄から生成NSPCsを使用する際の潜在的な利点は、これらの組織特異的細胞が最も密接に損傷または疾患、次の紛失または損傷した脊髄の細胞に似ているということです。

以前の研究は、成人の脊髄から派生した神経球は、長期的に伝播またはセル^8,9の十分な数を生成するために、継代することができなかったことを示しました。しかし、培養条件の変更を加えて、我々は、その自己再生を実証、成人の脊髄由来NSPCsの拡大と移植を報告しましたそして多能NSPCsは臓器移植ドナー¹⁰の成人の脊髄から単離することができます。主に、解剖時の白質の大部分を除去し、成人脊髄NSPCsの増殖のために選択され、増殖因子に富む培地中で接着性基板上にこれらの細胞を培養します。このプロトコルでは、成体ラットからと人間の臓器移植ドナーからの脊髄の収穫、脳室周囲組織の切開、および分離、文化、NSPCsの拡張について説明します。

プロトコル

全ての動物手順は、カナダ、トロントは、動物ケアのカナダの評議会によって調製実験動物の管理と使用にガイドで設定したポリシーに基づいて、大学健康ネットワークの動物実験委員会によって承認されています。人間の脊髄組織の収穫のために、承認が大学健康ネットワーク研究倫理委員会からとオンタリオ州、カナダの臓器提供を監督ライフ財団のリアム·ギフトから入手しました。

解剖緩衝液および培養培地の調製

1. ラットの脊髄の単離のために、100ミリリットル解剖バッファー（1×PBS + 0.6％グルコース+ 2％ペニシリン - ストレプトマイシン）と冷蔵を準備します。人間の脊髄100mlの解剖緩衝液（1×HBSS + 0.6％グルコース+ 2％ペニシリン - ストレプトマイシン）と冷蔵を準備します。
2. 37℃で100ミリリットルの無血清培地（SFM）と暖かいを準備します。 SFMを調製するために、2mMのL-グルタミンを追加し、100μgの/ mLのペニシリン - ストレプトマイシン、2％のB27とするNeurobasal培地に10％のホルモンミックス。ホルモンミックスを調製するために、1にする：0.6％グルコースを含有する1 DMEM / F12培地を、3 mMの_炭酸水素ナトリウム、5mMのHEPES、25 / mlのインスリン、100μg/ mlのアポトランスフェリン、10μMのプトレシン、30 nMのセレン、および20 nMのプロゲステロン。
3. EFH増殖因子に富むメッキメディアを準備し、37℃で、温かい（SFMに20 ngの/ mlのEGF、20 ngの/ mlのbFGF、および2 / mlのヘパリンを追加します）。人間EFHは、ヒト組換え成長因子を（材料の表を参照）が含まれていることを確認します。

2.収穫と成体ラット脳室周囲脊髄組織の解剖

1. エタノールで解剖器具を滅菌し、予め滅菌生理食塩水、またはオートクレーブ楽器ですすいでください。ラットを与える- 1の機関によると（6〜8週齢）をペントバルビタールナトリウム（65 mg / mlの時1 CC）または麻酔薬（ すなわち 、4％イソフルラン）の過剰摂取の薬物注射は、動物プロトコルを承認しました。 D70％エタノールでラットの背中をウーズと大解剖ハサミで背側表面に皮膚を削除します。
2. 背面に垂直なハサミを持って、横方向に後肢上記の脊柱を切りました。縦方向に棘突起を露出させるために吻側方向に脊柱を覆う背側の筋肉をカットするより小さなハサミを使用してください。
3. 露出された尾方端から開始して、脊髄と脊柱の間の空間に脊柱管の外側面に硬膜外鉗子や小鈍骨切断器具を挿入します。ラミナに小さな切り傷を作る（骨アーチは左椎骨の各側の棘突起の右）と慎重に脊髄（ 図1A-D）を露出する薄片を剥がします。根底にある脊髄が損傷しないように、ブレードの角度が浅いと、コードに平行であることを確認してください。
4. 博覧会への吻側方向に椎弓切除を続けます胸部と頸髄を電子。
5. 静か鈍組織鉗子で脊柱から脊髄を切除し、慎重にコードをリリースする根を切断するmicroscissorsを使用しています。 （1.1で前述）、4℃の無菌ラットの解剖緩衝液を含むペトリ皿に切除し、脊髄を置きます。バッファを解剖し、ハサミを用いて新たに調製し、4℃で組織をすすぐ横1cmのセグメント（ 図1E）に脊髄を切りました。
6. 組織の各セグメントについて、微細な鉗子で組織を保持するために1つの手を使用しています。もう一方の手で、慎重に解剖スコープの助けにより覆う髄膜、白質、および灰白質の大部分を除去するためにmicroscissorsを使用しています。あるいは、（デュモン＃4）上衣と周囲灰白質（ 図1F-H）の少量を含む脊髄の脳室周囲の領域のみを残し、グレーと白質の大部分をはがすために微細な鉗子を使用しています。
7. 冷たいラット解剖緩衝液を含む10センチメートル滅菌ペトリ皿に解剖脳室周囲の組織をプール。

3.成人の脳室周囲脊髄組織の収穫と解剖

注：他の臓器は、臓器移植のために削除された後のヒト脊髄組織は、（ドナーが2から60歳までの年齢の範囲であった）成人臓器移植ドナーから採取されます。ライフ·プログラムのリアム·ギフトは、患者の家族から研究目的のための組織を除去するための同意を得て、我々は、大動脈のクロスクランプの2時間以内にコードを収穫することができたようにタイムリーに私たちの収穫チームに通知します。負の血清学的検査なし感染症の男性と女性の成人ドナーは受け入れられています。

1. 同じ前方の露出を使用して前方アプローチを介して、手術室内の無菌様式で収穫組織はすでに臓器TRANSPによる臓器摘出のための解剖しますLANT収穫チーム。
2. 大きなリブスプレッダーと大血管を含む残りの組織や臓器の大きなパドルリトラクターに後退を通して前方脊柱を公開します。
3. 切除する脊柱の所望の長さの頭側と尾側端部の椎間板を切断するのに長い翼を搭載した胸骨鋸を使用してください。角度鋸は、約45°内側に脊柱管のすぐ停止する椎体の側面部分から三角形のトラフをカットします。
4. 一括硬膜を切開ないように注意しながら、湾曲オステオトームとマレットの助けを借りて、所望のセグメントの椎体の内側の面を削除します。そして、そっと歯付き鉗子で硬膜覆われた脊髄を持ち上げ、急激コードの吻側および尾側の端部を切開。左右個別の根を横断する長いはさみとピンセットを使用してください。
5. 4°で脊髄の切除されたセグメントを配置します; C滅菌緩衝液（1×HBSS + 0.6％グルコース+ 2％ペニシリン - ストレプトマイシン）組織培養室への輸送のための大きな試験管内。


6. 注意：一般的に、3 -上部胸部から脊髄の6cmのセグメントおよび/ ​​または半ばから低胸部レベルが循環の停止後できるだけ早く無菌条件下で手術室で除去し、冷滅菌バッファに配置されています。循環の停止および脊髄の除去の間の経過時間は、寄付のために標的器官を採取するのに必要な時間に応じて変化し、45分〜2時間の範囲でした。心臓や肺にも削除されている場合は、解剖は、同様に下頸髄の一部を採取するためにはるかに吻側撮影することができます。
7. 3時間以内、一般的に、収穫後できるだけ早く人間の脊髄組織を解剖。鉗子で硬膜およびその他の髄膜を削除します。作りたての4℃の解剖緩衝液中の脊髄組織をすすぎ、1cmのセグメントに横方向に切断しました。
8. 解剖スコープの助けを借りて、各組織のセグメントのために組織鉗子、細かい鉗子とmicroscissorsを使用して上に髄膜、白質および灰白質の大部分を切除。プール冷たい人間の解剖緩衝液を含む10センチメートル滅菌シャーレに、上衣と周囲灰白質の少量を含む解剖脳室周囲の組織、。

成体ラットおよびヒト脊髄NSPCsの4単離および培養

1. 層流フード内で無菌的に次の手順を実行します。
   1. microscissorsで1mm ³の小片に解剖ラットまたはヒト脳室周囲の組織をミンチ。
   2. 酵素的に物質/試薬の表に示すようにパパイン解離キットを使用して、タンパク質分解酵素を用いて細分化した組織を解離させます。注：試薬の成分は、4つのバイアルを含みます。バイアル1：アールの平衡塩溶液（EBSS）、バイアル2：パパインcontaininG Lシステイン及びEDTA、バイアル3：デオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼ）、バイアル4：ウシ血清アルブミン（BSA）とオボムコイドプロテアーゼ阻害剤。
      注：注 ：パパインは、タンパク質基質のための広い特異性を有するスルフヒドリルプロテアーゼです。パパインは、本明細書カリカパパイヤ植物からのラテックスから誘導され、より広範膵臓のプロテアーゼよりも、ほとんどのタンパク質基質を分解する。分離プロセスの間DNAは粘度を増加させ、困難なピペット作る解離培地中に放出させるいくつかの細胞損傷があります。したがって、DNアーゼは、インタクトな細胞を損傷することなくDNAを消化するために、細胞単離手順に含まれています。 Ovomucoids解離工程後パパイン活性を阻害するために使用されるプロテアーゼ阻害剤糖タンパク質ています。
2. 最初の使用時に、EBSSの32ミリリットル（1バイアル）でアルブミンオボムコイド阻害剤混合物（バイアル4）を再構成し、次いで4℃で保存し、その後の単離のために使用します。注：これは、オボムコイド阻害剤、10mgのと1mlあたりアルブミン10mgのの有効濃度の溶液が得られます。
3. 0.5 mMのEDTAを1 mMのL-システインmlのパパイン/ 20単位での溶液を得、パパインバイアル（バイアル2）にEBSSの5ミリリットル（バイアル1）を追加します。パパインを完全に酵素の完全な活性を確実にするために溶解されるまで、それ以外の場合は10分間37℃の水浴中にバイアルを配置し、完全に溶解したときにパパイン溶液が透明に表示されていることを確認してください。
4. DNアーゼバイアル（バイアル3）にEBSS（バイアル1）の500μlを添加して、DNアーゼを変性せん断に敏感であるように穏やかに混合します。約20単位/ mlの最終濃度パパインおよび0.005％DNアーゼで、その結果、パパインを含むバイアルにDNase溶液250μlのを追加します。後で使用するためのDNaseバイアルのバランスを保存します。
5. 上記のステップ4.4で調製されたパパイン溶液中のみじん切りラットまたはヒト組織を配置します。ヒト組織分離のために、2つの間で均等に細分化した組織を分割パパインバイアル（約0.2グラム/バイアル）。
6. 活性化したパパイン溶液に組織を解離するためにロッカープラットフォーム上で一定に撹拌しながら37℃でインキュベートします。それぞれ0.4gの - 45 1時間に分し、細分化した組織の量に応じて1〜2時間、約0.2のためのヒトの組織のためのラット組織をインキュベートします。
7. 濁った細胞懸濁液を得るために残りの組織片を解離するために10mLのピ​​ペットを用いて混合物を粉砕します。室温で5分間、300×gで滅菌15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に（解離していない組織の任意の部分を含まない）の細胞懸濁液を転送します。
8. オボムコイド、パパイン阻害剤を含む培地中でペレット化した細胞を再懸濁します。
   1. 15ミリリットルコニカルチューブに再構成されたアルブミン - オボムコイド阻害剤溶液（バイアル4）300μlの2.7ミリリットルEBSS（バイアル1）を混合することにより、オボムコイド溶液を調製します。上記のステップ4.4で保存した（3バイアル）DNase溶液150μlのを追加します。
   2. からの上清を捨て、ペレット化した細胞と、すぐには希釈されたDNアーゼアルブミン阻害剤混合物中の細胞ペレットを再懸濁します。
9. シングルステップ不連続密度勾配を介して遠心分離により細胞膜から分離し、無傷の細胞。
   1. の上に（ステップ4.8に記載のように調製）15mlチューブにアルブミン阻害剤溶液5ml（バイアル4）を添加し、細胞懸濁液を層優しく、ゆっくりと、5mLのピペットを使用して、不連続密度勾配を準備アルブミン阻害剤溶液。
   2. 室温で6分間、70×gで遠心分離します。
   3. 注：この境界での最小限の混合は、結果には影響しませんが、勾配の2つの層の間のインタフェースは、明確に表示される必要があります。膜フラグメントは、界面に留まり、解離した細胞は、チューブの底にペレット。
10. ラット細胞については、上清を廃棄し、ラットEFH培地1mlで細胞ペレットを再懸濁し（37℃で予熱しました）。血球計数器で生細胞密度をカウントし、EFHで/μlの10細胞の密度でT25培養フラスコに細胞をプレー。ラット組織からの細胞の典型的な収率は/μlの10未満の細胞密度で、所望される約80％viability.Ifクローン培養、種細胞と約2×10 ^6個の細胞です。 5％CO ₂中37℃でフラスコをインキュベートし、文化は球の凝集を回避するために、1週間静かに成長することができます。
11. ヒト細胞については、上清を廃棄し、ヒトEFH培地10ml中に細胞ペレットを再懸濁し（37℃で予熱しました）。 40μmのナイロン細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過し、ミエリンの細胞膜断片を除去するためにEFH 30mlで行いました。 5分間、300×gで遠心しEFH培地1ml中の細胞ペレットを再懸濁します。
12. 血球計数器を用いて生細胞密度を計数し、総容量/ウェルで10 ⁵細胞の密度で6ウェル培養プレートへのヒト細胞をプレート5ミリリットルのEFH /ウェル。ヒト組織からの細胞の典型的な収率は約70％の生存率で約1×10 ^6個の細胞です。例えば、マトリゲルなどの付着基質とのプレコートウェル（下記注参照）。 1ミリリットルSFM：40μlのマトリゲルの割合で希釈します。
13. 注：あるいは、ポリ-D-リジン/ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンのような他の付着基材を使用することができます。
14. 5％CO ₂中37℃で培養すると、培養物は1週間静かに成長することができます。

成体ラットおよびヒトの脊髄NSPCsの5継代

1. ラットNSPCsは、最初の播種の1週間以内に約70ミクロンの直径の小さい神経球を形成することになります。細胞懸濁液を採取5分間300×gで遠心分離し、そして機械的にニューロスフェアを解離するために、細胞ペレットを粉砕することによって毎週継代ラットNSPCs。
2. 新鮮なラットEFH培地を含むT25フラスコに解離細胞をシード。あるいは、継代のために、50％馴化ラット媒体を使用しています。継代でラットNSPCsの典型的な収量は、通路の数に対して指数関数的に増加し、約5×10 ^6個の細胞です。
3. 人間の文化のために、一週間最初のプレーティングした後、細胞を基板に接着することを可能にするために毎週二回、新鮮なEFHで培地の半分を交換してください。一般的に、1 - 2週間後、細胞を基板に付着した後、新鮮なEFHで週に2回培地のボリューム全体を交換してください。
4. 8週間 - 4との間にコンフルエンスに達する前に継代培養細胞。
   1. ウェルを37℃で約10分間インキュベート当たり酵素基質から細胞を剥離することにより継代培養細胞は、酵素の2mlの（材料の表を参照のこと）。細胞懸濁液を、5分間、300×gで遠心分離し、静かにたてEFH培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁を収集します。
   2. プレコ（血球計を用いて生細胞をカウントし、6ウェル培養プレートに細胞をプレー上記のようにステップ4.12）に10 ⁵細胞/ウェルの密度で/ウェル5ミリリットルEFHの総体積でated。継代での人間NSPCsの典型的な収率は約2×10 ^6個の細胞であり、一般的にこれは、通路に倍になります。継代の間に週3回 - 一般的に、50％馴化EFH培地で2培養を維持します。

結果

EFH培地で懸濁培養で増殖した成体ラットの脊髄の細胞は最初のプレーティングの1週間以内の小さな神経球（未分化細胞のコロニー）を形成します。初代培養では、播種した細胞のほとんどが死んでしまうと成長因子応答性幹細胞は増殖し、EFH培地中でのために選択されます。通路3により、直径100ミクロン（ 図2A）について、多数の自由に浮遊神経球が存在することになります?...

ディスカッション

ラットの脊髄組織のケアの解剖時の椎弓切除を行いながら、脊髄を損傷しないように注意してください。これは、脊髄セグメントが完全であるときに脳室周囲の組織を分離する方が簡単です。組織セグメントは、完全に解剖バッファーに浸漬する必要があり、上に髄膜および白質はmicroscissorsと縦ストリップとして離れて切断することができます。また、微細な組織鉗子離れ白質を剥離するた...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM