Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Özet

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Özet

Yetişkin sıçan ve büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş bir ortam içinde kültürlenmiş insan omurilik sinir kök / progenitör hücreleri (NSPCs) kendini yenileyen ve genişletilebilir nöral kök hücre multipotent çoğalması için izin verir. Serum koşullarda, bu multipotent NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrositleri üreten, ayırt edecektir. Hasat doku bFGF (enzimatik olarak papain EDTA çözeltisi içinde çözülmüş ve daha sonra mekanik olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş Neurobasal orta, temel fibroblast büyüme faktörü olduğu için kaplama, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için ayrılmış ve kesintili bir yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılır ) ve heparin. Yetişkin sıçan omurilik NSPCs yapışkan kültürler olarak büyütülür serbest yüzen neurospheres ve yetişkin insan omurilik NSPCs olarak kültürlenir. Bu koşullar altında, yetişkin omurilik NSPCs ön-madde hücreleri ifade belirteçleri, çoğalırlar ve sürekli geçmesi üzerine genişletilebilir. Bu hücreler olabilir bE, çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak, in vitro incelenmiştir ve dış faktörlerin nöral kök hücre farklılaşması incelemek için soy kısıtlama teşvik etmek için kullanılabilir. Multipotent NSPCs veya onların soyu rejeneratif onarım değerlendirmek için çeşitli hayvan modellerinde transplante edilebilir.

Giriş

NSPCs kendini yenilemek ve kolayca in vitro genişletebilirsiniz sinir soyu taahhüt multipotent hücrelerdir. Onlar kendini sürekli yenileyen multipotent kök hücreleri ve daha kısıtlı atalarıdır özelliklerini görüntülemek beri nöral kök / progenitör hücrelerin karışık bir nüfus olarak bu hücrelerin bakın. NSPCs fetus ve erişkin beyin ve omurilik ^1,2 hem de bulunabilir. Yetişkin olarak, NSPCs normalde sakin ve yan ventriküller ^2-4 astar subventriküler bölge ve spinal kord ^5,6 merkez kanal çevreleyen periventriküler bölge de dahil olmak üzere belirli niş içinde bulunur.

Tipik haliyle, NSPCs EGF ve bFGF ile takviye edilmiş serumsuz ortam içinde serbest yüzen neurospheres ya da yapışık mono tabakaları, kök / progenitör hücre popülasyonları için seçin Mitojenler gibi kültürlenmiştir. Başlangıçta Reynolds ve Weiss ² tarafından geliştirilen neurosphere deneyi, en yaygın olarak kültürlemek için kullanılan vesinir kök hücreleri genişletin. Bunlar büyüme faktörü içermeyen ortam serum içeren kaplama olduğunda NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrosit ayırma yöntemi, multipotency göstermektedir. Kültürlü doku, merkezi kanal ^6,7 bölgeleri içerdiğinde Multipotent, kendini yenileyen NSPCs yetişkin kemirgenden omurilik izole edilmiş ve kültürlenmiş edilebilir. Diğer bölgelerden gelen hücrelerin üretilmesi aksine yetişkin omurilikten kaynaklanan NSPCs kullanarak potansiyel avantajı, bu dokuya spesifik hücrelerin en yakın yaralanma ya da hastalık şu kayıp ya da hasarlı olan omurilik hücreleri benzer olmasıdır.

Önceki çalışma yetişkin insan omurilik türetilmiş neurospheres uzun vadeli yayılır veya hücre ^8,9 yeterli sayıda üretmek için geçişli olamazdı gösterdi. Ancak, kültür koşullarında değişikliklerle, biz göstererek, yetişkin insan omurilik kökenli NSPCs genişletilmesi ve nakli bildirdi kendini sürekli yenileyenve multipotent NSPCs, organ nakli donörlerinin ¹⁰ yetişkin insan omurilik izole edilebilir. Öncelikle, büyüme faktörü açısından zenginleştirilmiş bir ortam içinde bir alt-tabaka üzerine yapışık diseksiyon ve bu hücrelerin kültür içinde beyaz bir maddenin en çıkarılması, yetişkin insan omurilik NSPCs çoğalan için seçildi. Bu protokolde, yetişkin sıçan ve insan organ nakli donör, periventriküler doku diseksiyonu ve NSPCs izolasyonu, kültür ve genişlemesi omurilik hasat açıklar.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından hazırlanan Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuzu kurulan politikalarına uygun olarak, ON Canada Hayvan Bakım Üniversitesi Sağlık Ağı Komitesi, Toronto tarafından onaylanmıştır. İnsan omurilik dokusu hasat için onay Üniversitesi Sağlık Ağı Araştırma Etik Kurulu ve Ontario, Kanada'da organ bağışı denetleyen Hayat Vakfı Trillium-Hediyelik elde edilmiştir.

Diseksiyon Tamponlar ve Kültür Medya 1. Hazırlık

1. Sıçan omur iliği izolasyonu için, 100 mi diseksiyon tamponu (1 x PBS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) ile buzdolabında hazırlar. Insan omurilik için 100 mi diseksiyon tamponu (1 x HBSS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) ile buzdolabında hazırlar.
2. 37 ° C'de 100 mi, serum-içermeyen ortam (SFM) ve sıcak hazırlayın. SFM hazırlamak için, 2 mM L-glutamin ilave, 100 ug / mNeurobasal-A ortama l streptomisin penisilin,% 2 B27, ve% 10 hormonu karışımı. Hormon karışımı hazırlamak için, 1 olmak:% 0.6 glikoz ihtiva eden 1 DMEM / F12 ortamı, 3 mM NaHCO _3, 5 mM HEPES, 25 ng / ml insülin, 100 ug / ml apo-transferin, 10 uM putresin, 30 nM selenyum, ve 20 nM progesteron.
3. EFH büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş kaplama ortamı hazırlanması 37 ° C de ve sıcak (SFM 20 ng / ml, EGF, 20 ng / ml bFGF, 2 ug / ml heparin ekleme). İnsan EFH insan rekombinant büyüme faktörleri (Malzeme Tabloya bakınız) içerdiğinden emin olun.

2. Hasat ve Yetişkin Rat Periventriküler Omurilik Doku diseksiyonu

1. Etanol diseksiyon aletleri sterilize ve önceden steril tuzlu su veya otoklav aletleri durulayın. Sıçan ver - Kişinin kuruma göre (6 8 haftalık) sodyum pentobarbital (65 mg / ml 1 cc) ya da anestezi (yani,% 4 isofluorane) doz aşımı ölümcül enjeksiyon hayvan protokolü onayladı. D% 70 etanol ile sıçan arka OUSE ve geniş diseksiyon makas ile dorsal yüzeyinde deri kaldırmak.
2. Dorsal yüzeyine dik makas Holding, enine arka ayaklarında üstünde vertebra sütun kesti. Uzunlamasına spinöz süreçleri ortaya çıkarmak için bir Rostral yönde vertebra sütun örten dorsal kas kesmek için küçük makas kullanın.
3. Maruz kuyruk ucunda başlayarak, omurilik ve omurga arasındaki boşlukta spinal kanal lateral içine ekstradural rongeurs ya da küçük bir künt kemik kesme aleti takın. Lamina içine küçük kesikler (sol kemik kemerler ve omurları her tarafında spinöz proses hakkı) yapın ve dikkatlice omuriliği (Şekil 1A-D) maruz lamina uzakta soyun. Kanatlarının açısı sığ olduğundan emin olun ve altta yatan omurilik hasarlı olup böylece kordon paralel.
4. Tanitima rostralinde yönde laminektomi Devamtorakal ve servikal omurilik e.
5. Yavaşça dikkatle kabloyu serbest bırakmak için kökleri koparmaya künt doku forseps ve kullanım microscissors omurga gelen omurilik tüketim. (1,1 yukarıda tarif edilen), 4 ° C, steril sıçan diseksiyon tampon içeren bir Petri kabındaki eksize omurilik yerleştirin. Taze hazırlanmış, 4 ° C kesme tamponu içerisinde doku durulayın kullanarak makas 1 cm uzunluğundaki parçalara (Şekil 1E) içine enine omurilik kesti.
6. Doku her segment için, ince forseps ile doku tutmak için bir elinizi kullanın. Diğer elinizle, özenle diseksiyon kapsamı yardımıyla örten meninksler, beyaz cevher ve gri maddenin en kaldırmak için Microscissors kullanın. Alternatif olarak, ependima ve gri madde (Şekil 1F-H) çevreleyen küçük bir miktar içeren omurilik sadece periventriküler bölgeyi terk, beyaz ve gri maddenin en uzak soymak ince forseps (4 Dumont #) kullanın.
7. Soğuk sıçan diseksiyonu tampon içeren bir 10 cm steril Petri kabı içine disseke periventriküler doku Havuz.

3. Hasat ve Yetişkin İnsan Periventriküler Omurilik Doku diseksiyonu

Not: diğer organlar organ nakli için kaldırılmıştır sonra İnsan omurilik dokusu yetişkin organ nakli vericilerden hasat edilir (donörler yaş 2 ile 60 yaşları arasında değişiyordu). Hayat Programı Trillium-Hediyelik hastanın ailesi araştırma amaçlı dokusunun çıkarılması için onay alır ve biz aortik kros-klemp 2 saat içinde halatlar hasat mümkün olmuştur, öyle ki zamanında bizim hasat ekibi bildirir. Erkek ve kadın yetişkin serolojisi negatif olan donörler ve hiçbir enfeksiyon kabul edilir.

1. Aynı anterior poz kullanarak anterior yaklaşımla ameliyathanede steril bir şekilde Hasat doku zaten Organ Şeffaf tarafından organ için dissekelant hasat ekibi.
2. Büyük kaburga serpme ve büyük kan damarları dahil geri kalan doku ve organların büyük kürek Retraktörler ile geri çekilmesi yoluyla ön omuriliğe Açığa.
3. Rezeke edilecek omurganın istenilen uzunlukta rostral ve kaudal ucunda intervertebral diskler yoluyla kesmek için uzun bir bıçak ile monte edilmiş bir sternum testeresi kullanın. Açı testere yaklaşık 45 ° medial spinal kanal sadece kısa durdurma omurların yan kısmından üçgen çukur kesmek için.
4. En blok dura ile kesme önlemek için özen kavisli keskisi ve çekiç yardımı ile istenen kesimlerin vertebralarda medial yönlerini çıkarın. Sonra yavaşça dişli forseps ile dura kaplı omurilik kaldırın ve keskin kordon rostral ve kaudal uçları insizyon. Bilateral bireysel kökleri transect uzun makas ve forseps kullanın.
5. 4 ° spinal kord eksize segmenti yerleştirinC, steril tampon maddesi (1x HBSS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) doku kültürü oda taşınması için büyük bir test tüpü içinde.


6. Not: Genellikle, 3 - Üst torasik spinal kord 6 cm kısmın ve / veya orta-düşük torasik seviyesi mümkün olduğu kadar çabuk dolaşımda kesilmesinden sonra steril koşullar altında ameliyathanede çıkarıldı ve soğuk steril tampon yerleştirilir . dolaşımın kesilmesi ve omurilik çıkarılması arasında geçen süre bağışı için hedeflenen organlarını toplamak için gereken zamanla değişir ve 45 dakika ile 2 saat arasında değişmektedir. Kalp ve akciğerler de kaldırıldı varsa, diseksiyon yanı sıra alt servikal kord bir kısmını hasat için çok rostrally alınabilir.
7. 3 saat içinde genellikle hasattan sonra en kısa sürede insan omurilik dokusu parçalara ayır. Forseps ile dura ve diğer meninksler çıkarın. Taze yapılmış 4 ° C diseksiyon tamponunda omurilik dokusu durulayın ve1 cm'lik bölümler halinde enine kesilmiş.
8. Diseksiyon kapsamı yardımıyla, her doku kesimi için doku forseps, ince forseps ve microscissors kullanarak gri maddenin en örten meninksler, beyaz cevher tüketim ve. Soğuk insan diseksiyon tampon içeren 10 cm'lik bir steril Petri kabı içine ependima ve çevresindeki gri madde küçük bir miktar içerir parçalara periventriküler doku, havuz.

4. İzolasyon ve Kültürleme Yetişkin Rat ve İnsan Omurilik NSPCs arasında

1. Laminer akış kaputu aseptik aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. Microscissors 1 mm ³ parçaya disseke sıçan ya da insan periventriküler doku kıyma.
   2. Enzimatik malzemeler / reaktiflerin tabloda gösterildiği gibi papain ayrışma kiti kullanılarak proteolitik enzimlerle kıyılmış doku ayırmak. Not: Reaktif bileşenler 4 flakon içerir; Flakon 1: Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) Flakon 2: Papain containing L-sistein ve EDTA, Flakon 3: Deoksiribonükleaz I (DNase) Flakon 4: Sığır serum albümini (BSA) ile ovomukoid proteaz inhibitörü.
      Not: Not: Papain protein yüzeyler için geniş özgüllüğe sahip bir sülfhidril proteazdır. papain Burada Carica papaya bitkisinden elde edilen lateks ve çok protein alt tabakaları daha kapsamlı daha pankreas proteazlar parçalayan bir. Ayrışma işlemi sırasında viskozitesini arttırır ve zor bir pipetleme yapacak ayrışma ortamı içinde serbest bazı hücre hasarının neden DNA bulunmaktadır. Bu nedenle, DNaz sağlam hücrelere zarar vermeden DNA sindirimi hücre izolasyon prosedürü dahil edilir. Ovomukaidler ayrışma aşamasından sonra papain aktivitesini inhibe etmek için kullanılan proteaz inhibitörleri glikoprotein edilir.
2. İlk kullanımda, EBSS'ye (şişe 1) 32 ml 'si ile, albümin ovomukoid inhibitörü karışımı (şişe 4) tekrar oluşturmak ve daha sonra 4 ° C de saklamak ve daha sonra izolasyonların için kullanımı.Not: Bu ovomukoid inhibitörü 10 mg, ml başına albümin 10 mg etkin bir konsantrasyonda bir çözelti elde edilir.
3. 0.5 mM EDTA, 1 mM L-sistein papain / ml 20 birim bir çözelti elde edildi, Papain şişe (şişe 2) ila EBSS'ye (şişe 1) 5 ml ilave edilir. Papain tam enzimin tam aktivite sağlamak için eritilir gelinceye kadar on dakika için 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirin tamamen çözündüğünde papain çözelti berrak görünen kontrol edin.
4. (3 şişe), bir DNase flakon EBSS'ye (flakon 1) 500 ul ekleyin ve DNaz denatürasyonunu kesme duyarlı olarak hafifçe karıştırın. Yaklaşık 20 birim / ml papain ve% 0.005 DNase bir nihai konsantrasyonu elde papain ihtiva eden şişeye DNaz çözeltisi 250 ul ekle. Daha sonra kullanmak üzere DNaz flakonun dengesini kaydedin.
5. Yukarıda adım 4.4 gibi hazırlanan papain çözeltisi içinde kıyılmış sıçan veya insan dokusu yerleştirin. Insan dokusu izolasyonu için, ikisi arasında eşit olarak kıyılmış doku bölmekpapain küçük şişeler (yaklaşık 0.2 g / şişe).
6. Aktif papain çözeltisi içinde doku ayırmak ve bir rocker platformunda sabit bir ajitasyon ile 37 ° C'de inkübe edilir. 0.4 gr, sırasıyla - yaklaşık 0.2 kıyılmış doku miktarına bağlı olarak 1-2 st için 45 1 saat dakikadır ve insan doku için, sıçan dokusu inkübe edin.
7. Bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere geri kalan doku parçaları ayırmak için 10 ml'lik bir pipet ile karışım toz haline getirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de bir steril 15 ml konik tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu (çözünmemiş dokusunun herhangi parçaları dahil değildir) aktarın.
8. Orta içeren ovomukoid bir papain inhibitörü pelet hücreleri tekrar süspansiyon.
   1. 15 ml konik bir tüp içinde yeniden albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi (şişe 4) 300 | il 2.7 mi EBSS (şişe 1) karıştırılarak ovomukoid çözeltisi hazırlayın. Yukarıdaki adım 4.4 olarak kaydedildi (3 şişe) DNaz çözeltisi 150 ul ekleyin.
   2. Süpernatant atıntanelenmiş hücreler hemen seyreltildi DNaz albümin inhibitör karışımı içinde hücre pelletini.
9. Tek bir adım kesintili yoğunluk gradyan boyunca santrifüj hücre zarlarından ayrı sağlam hücreler.
   1. En yavaşça, 15 ml bir tüp (4 şişe), albümin-inhibitör çözeltisi 5 ml eklenmesi ve 5 ml'lik bir pipet kullanılarak, aralıklı yoğunluk gradyan hazırlamak ve yavaş hücre süspansiyonu tabaka (adım 4.8 olarak yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır), albümin inhibitör çözeltisi.
   2. Oda sıcaklığında 6 dakika için 70 x g'de santrifüjleyin.
   3. Not: Bu sınır en az bir karıştırma sonucu etkilemeyecektir gradyanın iki tabaka arasındaki ara yüz, açıkça görülmelidir. Membran fragmanları, ara yüzeyde kalır ve ayrışmış hücrelerinin, tüpün alt pelet.
10. Fare hücreleri için, süpernatan atılır ve sıçan EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini (37 ° C'de önceden ısıtılmış).Bir haemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve EFH bölgesindeki / ul 10 hücre yoğunluğunda bir T25 kültür şişesi içine hücreleri plaka. Sıçan dokudan hücrelerin tipik verim / ml den az 10 hücre yoğunluğunda arzu edilir yaklaşık% 80 viability.If klonal kültürleri, tohum hücreleri ile yaklaşık 2 x 10 ⁶ hücre olup. % 5 _CO2 içinde 37 ° C'de şişeler inkübe ve 1 hafta kürelerin bir araya toplanmasının engellenmesi için kültürler rahatsız büyümeye izin verir.
11. İnsan hücreleri için, süpernatan atılır ve insan EFH ortamı 10 ml hücre pelletini (37 ° C'de önceden ısıtılmış). 40 mikron naylon hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre miyelin ve hücre zarı parçalarını almak için EFH 30 ml izledi. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini.
12. Bir haemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve toplam hacim içinde / oyuk 10 ⁵ hücre yoğunluğunda 6 oyuklu kültür plakaları, insan hücreleri plaka5 ml EFH / oyuk. İnsan dokusundan gelen hücrelerin tipik bir verimi, yaklaşık% 70 canlılık ile yaklaşık 1 x 10 ⁶ hücre olup. Böyle Matrigel gibi yapışık alt tabaka ile Ön-ceket kuyuları (aşağıya Not bakınız). 1 mi SFM: 40 ul Matrigel bir oranda seyreltilir.
13. Not: Alternatif olarak, poli-D-lisin / laminin, fibronektin ya da kollajen gibi diğer yapışık alt tabakalar kullanılabilir.
14. % 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin ve kültürler 1 hafta için rahatsız büyümeye izin verir.

Yetişkin sıçan ve insan omurilik NSPCs 5. Pasajlanması

1. Sıçan NSPCs küçük neurospheres ilk tohumlama 1 hafta içinde çapı yaklaşık 70 mikron oluşturacaktır; , hücre süspansiyonu toplamak 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj ve mekanik neurospheres ayırmak için hücre pelet öğütülerek haftalık geçiş sıçan NSPCs.
2. Taze sıçan EFH ortamı içeren T25 şişeler içine ayrışmış hücreleri Tohum. Seçenek olarak ise,Pasajlanması% 50 şartına sıçan orta kullanın. Pasajlanması de sıçan NSPCs tipik verim geçişi numarası ile katlanarak artar yaklaşık 5 x 10 ⁶ hücre olduğunu.
3. İnsan kültürler, bir hafta sonra ilk kaplama, hücreler, alt-tabakaya yapışma sağlamak için haftada iki kez, taze EFH kültür ortamının yarısı değiştirin. Genel olarak, 1-2 hafta sonra hücreler, alt-tabakaya bağlanmış olan, bir kez taze EFH ile haftada iki kez kültür ortamının tüm hacmi değiştirin.
4. - 8 hafta 4 ila izdiham ulaşmadan Alt kültür hücreleri.
   1. De 37 ° C 'de yaklaşık olarak 10 dakika süre ile inkübe başına enzimatik substrat hücreleri ayırarak Alt kültür hücreleri, enzim 2 ml (Malzeme Tablo). 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu, santrifüj toplamak ve yavaşça taze yapılmış EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini.
   2. Bir haemositometre ile canlı hücre sayımı ve 6 oyuklu kültür plakaları içine hücreleri plaka (ön-koYukarıdaki adım 4.12), 10 ⁵ hücre yoğunluğunda / kuyuda / oyuk 5 mi EFH bir toplam hacimde konsantre edilir. Pasajlanması insan NSPCs tipik verim yaklaşık 2 x 10 ⁶ hücre ve genellikle bu pasajda ile iki katına çıkacak. Pasajlanması arasında haftada 3 kez - Genellikle% 50 şartına EFH orta 2 kültürleri korumak.

Sonuçlar

EFH ortam içinde süspansiyon kültürü içinde çoğaltıldığında Yetişkin sıçan omurilik hücreleri ilk kaplama 1 hafta içinde, küçük neurospheres (farklılaşmamış hücrelerin koloni) oluşturacaktır. Birincil kültürde kaplama, hücrelerin en ölür ve büyüme faktöre cevap veren bir kök hücreleri çoğalır ve EFH ortamında seçilir. Geçit 3 ile, bir çok serbest yüzen neurospheres yaklaşık 100 mikron çapında (Şekil 2A) 'de olacaktır. Neurospheres yuvarlak ve faz pa...

Tartışmalar

Sıçan omurilik dokusu bakım diseksiyonu sırasında laminektomi yaparken omurilik zarar vermemek için dikkat edilmelidir. Bu omurilik segmentleri sağlam olduğunda periventriküler doku izole etmek daha kolaydır. Doku parçaları tam olarak tahlil tamponuna daldırılmalıdır ve örten zarları ve beyaz madde microscissors boyuna şeritler gibi kesilebilir. Alternatif olarak, ince doku forseps uzakta beyaz cevher soymak için kullanılabilir.

NSPCs için izolasyon prosedürü için, s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM