Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

Résumé

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Résumé

Rat adulte et les cellules humaines de la moelle épinière neurales souches / progénitrices (NSPCs) cultivées dans un milieu de croissance enrichi en facteur permet la prolifération des multipotentes, et les cellules souches neurales expansibles auto-renouvellement. Dans des conditions sérum, ces NSPCs multipotentes seront différencier, générer des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes,. Le tissu prélevé est enzymatiquement dissocié dans une solution de papaïne-EDTA et ensuite dissocié mécaniquement et séparés par un gradient de densité discontinu pour obtenir une suspension cellulaire unique, qui est plaqué dans un milieu neurobasal additionné de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), et de l'héparine. Rats adultes de la moelle épinière NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants et adultes humains NSPCs de la moelle épinière sont cultivées comme cultures adhérentes. Dans ces conditions, adultes de la moelle épinière NSPCs prolifèrent, marqueurs expresses de cellules précurseurs, et peuvent être élargies en permanence lors du passage. Ces cellules peuvent be étudiée in vitro en réponse à divers stimuli, et des facteurs exogènes peuvent être utilisés pour promouvoir restriction de la lignée d'examiner la différenciation des cellules souches neurales. Multipotentes NSPCs ou leur progéniture peuvent également être transplantées dans divers modèles animaux pour évaluer la réparation régénérative.

Introduction

NSPCs cellules multipotentes sont commis à la lignée de neurones qui peut auto renouveler et élargir facilement in vitro. Nous nous référons à ces cellules comme une population mixte de cellules souches / progénitrices neurales car ils présentent des propriétés de cellules souches multipotentes auto-renouvellement et les progéniteurs plus restreints. NSPCs se trouvent à la fois dans le cerveau du fœtus et de l'adulte et la moelle épinière ^1,2. Chez l'adulte, NSPCs sont normalement repos et résident dans des niches spécifiques, y compris la zone sous-ventriculaire qui tapisse les ventricules latéraux ^2-4, et dans la région périventriculaire entourant le canal central de la moelle épinière de ^5,6.

Typiquement, NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants ou comme monocouches adhérentes dans un milieu sans sérum supplémenté avec de l'EGF et bFGF, qui sélectionnent mitogenes pour les populations de cellules souches / progénitrices. Le dosage de neurosphère initialement développé par Reynolds et Weiss ^2, est le plus couramment utilisé pour la culture etdévelopper des cellules souches neurales. NSPCs montrent multipotence quand ils sont étalées dans un milieu contenant du sérum exempt de facteur de croissance, se différencier en neurones, astrocytes, oligodendrocytes et. Multipotentes, NSPCs d'auto-renouvellement peuvent être isolés et mis en culture à partir du rongeur adulte moelle épinière lorsque le tissu en culture comprend les régions du canal central ^6,7. Un avantage potentiel dans l'utilisation de NSPCs générées lors de la moelle épinière adulte, par opposition à générer des cellules provenant d'autres régions est que ces cellules spécifiques d'un tissu ressemblent plus étroitement les cellules de la moelle épinière qui sont perdues ou endommagées après une blessure ou d'une maladie.

Des travaux antérieurs ont montré que neurosphères dérivées de la moelle épinière adulte humaine ne pouvaient pas être propagées à long terme ou des passages pour générer un nombre suffisant de cellules ^8,9. Cependant, avec des modifications dans des conditions de culture, nous avons signalé l'expansion et la transplantation de NSPCs adultes de la moelle épinière humaine dérivés, ce qui démontre que l'auto-renouvellementNSPCs multipotentes et peuvent être isolées à partir de moelle épinière de l'adulte humain de donneurs de transplantation d'organes ^10. En premier lieu, l'élimination de la majeure partie de la matière blanche au cours de la dissection et la culture de ces cellules adhérentes sur un substrat dans un milieu de croissance enrichi en facteur choisi pour adultes humains en prolifération NSPCs de la moelle épinière. Dans ce protocole, nous décrivons la récolte de la moelle épinière de rats adultes et à partir de donneurs humains de transplantation d'organes, la dissection du tissu péri-ventriculaire, et l'isolement, la culture et l'expansion de NSPCs.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux sont approuvés par le Comité de protection des animaux de l'University Health Network, Toronto ON Canada, en conformité avec les politiques établies dans le Manuel sur le soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation préparés par le Conseil canadien de protection des animaux. Pour la récolte de tissus de la moelle épinière humaine, l'approbation a été obtenue du comité d'éthique de la recherche du University Health Network et de la Trillium-cadeau Life Foundation qui supervise le don d'organes en Ontario, Canada.

1. Préparation de dissection tampons et de la culture des médias

1. Pour l'isolement de moelle épinière de rat, de préparer 100 ml de tampon de dissection (PBS 1x + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer. Pour moelle épinière humaine préparer 100 ml de tampon de dissection (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer.
2. Préparez 100 ml de milieu sans sérum (SFM) et chaude à 37 ° C. Pour préparer la GFD, ajouter 2 mM de L-glutamine, 100 ug / ml pénicilline-streptomycine, B27 2%, et 10% à l'hormone mélange Neurobasal-A milieu. Pour préparer hormone mélange, faire un rapport 1: milieu / F12 1 DMEM contenant 0,6% de glucose, 3 mM de NaHCO _3, HEPES 5 mM, 25 ug / ml d'insuline, 100 ug / ml d'apo-transferrine, 10 uM de putrescine, 30 nM de sélénium, et 20 nM progestérone.
3. Préparez le support de placage de croissance EFH facteur enrichi (à la GDF ajouter 20 ng / ml d'EGF, 20 ng / ml de bFGF, et 2 pg / ml d'héparine) et chaude à 37 ° C. Assurez-vous que EFH humain contient des facteurs de croissance recombinants humains (voir le tableau des matériaux).

2. La récolte et la dissection des adultes Rat périventriculaire moelle épinière Tissue

1. Stériliser les instruments de dissection dans l'éthanol et rincer dans une solution saline stérile ou instruments autoclave à l'avance. Donnez rat (6 - 8 semaines) une injection létale de pentobarbital de sodium (1 cc à 65 mg / ml) ou de surdose d'anesthésique (c.-à 4% isofluorane) selon son institution a approuvé le protocole de l'animal. RÉOuse le dos du rat avec 70% d'éthanol et enlever la peau sur la surface dorsale avec de grands ciseaux de dissection.
2. Tenir les ciseaux perpendiculaires à la surface dorsale, coupée transversalement la colonne vertébrale au-dessus des membres postérieurs. Utilisez de petits ciseaux pour couper longitudinalement le muscle dorsal recouvrant la colonne vertébrale dans une direction rostrale pour exposer les apophyses épineuses.
3. À partir de l'extrémité caudale exposée, insérez rongeurs ou d'un petit instrument de coupe osseuse émoussée extradurally dans la face latérale du canal rachidien dans l'espace entre la moelle épinière et la colonne vertébrale. Faire de petites coupures dans la lame (arcs osseux gauche et à droite des apophyses épineuses de chaque côté des vertèbres) et soigneusement décoller la lame pour exposer la moelle épinière (figure 1A-D). Assurez l'angle des pales est peu profonde et parallèle à la corde afin de la moelle épinière sous-jacente ne soit pas endommagé.
4. Continuer laminectomie en direction rostrale aux Expose la moelle épinière thoracique et cervical.
5. Exciser doucement la moelle épinière de la colonne vertébrale avec une pince de tissus contondants et utilisation microciseaux à couper soigneusement les racines pour libérer le cordon. Placez la moelle épinière excisée dans une boîte de Pétri contenant 4 ° C tampon de dissection du rat stérile (décrit ci-dessus en 1.1). Rincez le tissu dans un tampon C à dissection 4 ° fraîchement préparé et l'aide de ciseaux coupent la moelle épinière transversalement en segments de 1 cm (figure 1E).
6. Pour chaque segment de tissu, utiliser une main pour tenir le tissu avec des pinces fines. Avec l'autre main, utiliser microciseaux à retirer soigneusement les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise à l'aide d'un microscope à dissection. Sinon, utilisez une pince fine (Dumont N ° 4) à se décoller plus de la matière grise et blanche, ne laissant que la région périventriculaire de la moelle épinière qui comprend l'épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris (figure 1F-H).
7. Mutualiser le tissu périventriculaire disséqué dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant un tampon de dissection du rat froid.

3. La récolte et la dissection des adultes de la moelle épinière humaine périventriculaire Tissue

Remarque: les tissus de la moelle épinière humaine est récolté à partir de donneurs de greffes d'organes adultes (donateurs étaient âgés de 2 à 60 ans) après les autres organes ont été prélevés pour la transplantation d'organes. Le Trillium-cadeau Programme Life du obtient le consentement pour l'élimination des tissus à des fins de recherche de la famille du patient et informe notre équipe de récolte en temps opportun de sorte que nous avons été en mesure de récolter les cordons dans les 2 heures de clampage aortique. Donneurs adultes mâles et femelles ayant une sérologie négative et aucune infection sont acceptées.

1. Tissus récolte de façon stérile dans la salle d'opération par une approche antérieure en utilisant la même exposition antérieure déjà disséqué pour le prélèvement d'organes par le transp d'organeséquipe de récolte lant.
2. Exposer la colonne vertébrale antérieure par rétraction avec de grandes épandeurs de côtes et grands écarteurs de paddle des tissus et des organes restants, y compris les gros vaisseaux sanguins.
3. Utiliser une scie sternale monté avec une longue lame pour couper à travers les disques intervertébraux aux extrémités rostrale et caudale de la longueur désirée de la colonne vertébrale à réséquer. Angle de la scie environ 45 ° dedans pour couper un creux triangulaire de la partie latérale des corps vertébraux arrêt juste avant le canal rachidien.
4. Retirer en bloc les aspects médiaux des corps vertébraux des segments souhaités à l'aide d'ostéotomes courbes et un maillet en prenant soin d'éviter de couper à travers la dure-mère. Ensuite, soulevez délicatement la dure recouvert la moelle épinière avec une pince à griffes et fortement inciser les extrémités rostrale et caudale de la moelle. Utilisez longs ciseaux et des pinces à sectionner bilatéralement les racines individuelles.
5. Placer le segment excisé de la moelle épinière dans 4 °; Tampon stérile C (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) dans un grand tube à essai pour le transport vers la chambre de culture de tissu.


6. Remarque: En règle générale, un 3 - segment de 6 cm de la moelle épinière de la colonne thoracique supérieure et / ou la mi-à-faible niveau thoracique est enlevé dans la salle d'opération dans des conditions stériles dès que possible après l'arrêt de la circulation et placé dans un tampon stérile froide . Le temps écoulé entre la cessation de la circulation et la suppression de la moelle épinière varie avec le temps nécessaire pour récolter les organes ciblés pour don et a varié de 45 min à 2 h. Si le cœur et les poumons ont également été enlevés, la dissection peut être pris loin rostralement de récolter une partie de la moelle cervicale inférieure ainsi.
7. Disséquer les tissus de la moelle épinière humaine dès que possible après la récolte, généralement dans les 3 heures. Retirer la dure-mère et les méninges autres avec une pince. Rincer le tissu de la moelle épinière fraîchement préparé dans du tampon de dissection C à 4 ° C etcouper transversalement en segments de 1 cm.
8. Avec l'aide d'un microscope à dissection, exciser les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise en utilisant des pinces de tissus, pinces fines et microciseaux pour chaque segment de tissu. Mutualiser le tissu disséqué périventriculaire, qui comprend l'épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris, dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant tampon froid de dissection humaine.

4. Isolement et culture des adultes et Rat NSPCs de la moelle épinière de l'homme

1. Effectuez les étapes suivantes de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire.
   1. Émincer le rat ou le tissu disséqué périventriculaire humain dans 1 mm ³ pièces avec microciseaux.
   2. Enzymatique dissocier le tissu haché avec des enzymes protéolytiques en utilisant le kit de dissociation papaïne comme indiqué dans le tableau des matériaux / réactifs. Note: les composants réactifs comprennent 4 flacons; Vial 1: solution saline équilibrée de Earle (EBSS), Vial 2: containin Papaing L-cystéine et de l'EDTA, Vial 3: désoxyribonucléase I (DNase), Vial 4: inhibiteur ovomucoïde protease avec de l'albumine de sérum bovin (BSA).
      Remarque: Remarque: La papaïne est une protéase sulfhydryle qui a une large spécificité pour des substrats protéiques. La papaïne ici est dérivé du latex à partir de la plante de papaye Carica et dégrade la plupart des substrats protéiques plus largement que les protéases pancréatiques. Pendant le processus de dissociation, il ya de l'ADN causant des dommages aux cellules d'être libérés dans le milieu de dissociation qui va augmenter la viscosité et de faire pipetage difficile. Ainsi, la DNase est inclus dans la procédure d'isolement des cellules à digérer l'ADN sans endommager les cellules intactes. Ovomucoïdes glycoprotéine sont des inhibiteurs de protéase utilisés pour inhiber l'activité de la papaïne après l'étape de dissociation.
2. À la première utilisation, reconstituer le mélange inhibiteur albumine ovomucoïde (flacon 4) avec 32 ml d'EBSS (1 flacon), puis stocker à 4 ° C et à utiliser pour les isolements ultérieures.Remarque: On obtient ainsi une solution à une concentration efficace de 10 mg d'inhibiteur ovomucoïde et 10 mg d'albumine par ml.
3. Ajouter 5 ml d'EBSS (flacon 1) de la papaïne un flacon (flacon 2), ce qui donne une solution à 20 unités de papaïne / ml dans 1 mM de L-cystéine avec 0,5 mM d'EDTA. Vérifier que la solution de papaïne semble clair quand il est complètement dissous, sinon placer le flacon dans un bain d'eau à 37 C ° d'une dizaine de minutes jusqu'à ce que la papaïne est complètement dissous pour assurer la pleine activité de l'enzyme.
4. Ajouter 500 ul d'EBSS (flacon 1) dans un flacon de DNase (flacon 3) et mélanger doucement DNase est sensible à la dénaturation par cisaillement. Ajouter 250 ul de la solution de DNase dans le flacon contenant la papaïne, ce qui entraîne une concentration finale d'environ 20 unités / ml de papaïne et 0,005% de DNase. Sauvegardez l'équilibre de la fiole de DNase à utiliser plus tard.
5. Placez le rat hachée ou un tissu humain dans la solution de papaïne tel que préparé à l'étape 4.4 ci-dessus. Pour l'isolement de tissu humain, diviser le tissu haché à parts égales entre deuxflacons de papaïne (environ 0,2 g / fiole).
6. Incuber à 37 ° C avec agitation constante sur une plate-forme à bascule pour dissocier le tissu dans la solution de papaïne activée. Incuber tissu de rat pendant 45 minutes à 1 heure, et le tissu humain pendant 1 à 2 heures en fonction de la quantité de tissu haché, environ 0,2 à 0,4 g respectivement.
7. Triturer le mélange avec une pipette 10 ml de dissocier les morceaux de tissu restants pour donner une suspension de cellules trouble. Transférer la suspension cellulaire (ne pas inclure tous les morceaux de tissu non dissocié) dans un tube stérile conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du milieu contenant de l'ovomucoïde, un inhibiteur de la papaïne.
   1. Préparer la solution par mélange de l'ovomucoïde 2,7 ml EBSS (flacon 1) avec 300 ul de la solution d'inhibiteur de l'albumine ovomucoïde reconstituée (flacon 4) dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 150 pi de solution de DNase (flacon 3) enregistrés à l'étape 4.4 ci-dessus.
   2. Jeter le surnageant deles cellules en culot et immédiatement remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d'albumine d'inhibiteur dilué DNase.
9. Séparer les cellules intactes les membranes cellulaires par centrifugation à travers une seule étape à gradient de densité discontinu.
   1. Préparer le gradient de densité discontinu par addition de 5 ml de solution d'albumine-inhibiteur (flacon 4) à un tube de 15 ml, et en utilisant une pipette de 5 ml, doucement et la couche lentement la suspension cellulaire (préparé comme décrit ci-dessus à l'étape 4.8) au-dessus de la solution d'albumine-inhibiteur.
   2. Centrifuger à 70 g pendant 6 min à température ambiante.
   3. Remarque: L'interface entre les deux couches de la pente doit être clairement visible, bien que le mélange à cette limite minimal n'a aucune incidence sur le résultat. Fragments membranaires restent à l'interface et cellules dissociées culot au fond du tube.
10. Pour les cellules de rat, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de rat moyenne EFH (pré-chauffé à 37 ° C).Compter densité cellulaire en temps réel avec un hémocytomètre et la plaque les cellules dans un flacon de culture T25 à une densité de 10 cellules / ul dans EFH. Le rendement typique de cellules provenant de tissu de rat est d'environ 2 x 10 ⁶ cellules avec environ 80% viability.If cultures clonales sont désirés, les cellules de semence à une densité inférieure à 10 cellules / ul. Incuber les flacons à 37 ° C dans 5% de CO ₂ et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine pour éviter l'agrégation des sphères.
11. Pour les cellules humaines, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu EFH humaine (pré-chauffé à 37 ° C). On filtre la suspension de cellules à travers un filtre cellulaire en nylon de 40 pm a suivi avec 30 ml d'EFH pour éliminer les fragments de myéline et la membrane cellulaire. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 minutes et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu EFH.
12. Comptez densité de cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules humaines dans des plaques de culture à 6 puits à une densité de 10 ⁵ cellules / puits dans un volume total5 ml EFH / puits. Le rendement typique de cellules provenant de tissu humain est d'environ 1 x 10 ⁶ cellules avec environ 70% de viabilité. Puits pré-manteau avec un substrat adhérente comme Matrigel (voir note ci-dessous). Diluer à un ratio de 40 ul Matrigel: 1 ml GDF.
13. Remarque: En variante, d'autres substrats tels que adhérentes poly-D-lysine / laminine, la fibronectine, le collagène ou peuvent être utilisés.
14. Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO ₂ et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine.

5. Le repiquage du rat adulte et NSPCs de la moelle épinière humains

1. NSPCs Rat formeront de petits neurosphères environ 70 m de diamètre à 1 semaine d'ensemencement initial; NSPCs hebdomadaires par la collecte de la suspension cellulaire, la centrifugation à 300 xg pendant 5 min, et trituration mécanique de la boulette de cellules de neurosphères passage dissocier les rats.
2. Ensemencer les cellules dissociées dans des flacons T25 contenant rat milieu frais EFH. Alternativement,utiliser milieu de rat climatisé de 50% pour les passages. Le rendement typique de NSPCs de rats à des passages est d'environ 5 x 10 ⁶ cellules qui augmente de façon exponentielle avec le nombre de passages.
3. Pour les cultures humaines, une semaine après le dépôt initial, remplacer la moitié du milieu de culture frais avec EFH deux fois par semaine pour permettre aux cellules d'adhérer au substrat. En général, 1 à 2 semaines plus tard, une fois que les cellules ont fixé au substrat, remplacer l'ensemble du volume du milieu de culture deux fois par semaine avec EFH frais.
4. cellules Subculture avant d'atteindre la confluence entre 4 - 8 semaines.
   1. des cellules de sous-culture de cellules détacher du substrat enzymatique (voir le tableau des matériaux) avec 2 ml d'enzyme par puits incubés pendant environ 10 min à 37 ° C. Recueillir suspension cellulaire, centrifuger à 300 g pendant 5 min, et remettre doucement le culot cellulaire dans 1 ml de milieu fraîchement préparé EFH.
   2. Compter les cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules dans des plaques de culture à 6 puits (pré-coATED comme ci-dessus à l'étape 4.12) à une densité de 10 ⁵ cellules / puits dans un volume total de 5 ml EFH / puits. Le rendement typique de NSPCs humaines à des passages est d'environ 2 x 10 ⁶ cellules et généralement cela va doubler avec le passage. Généralement, de maintenir les cultures avec 50% de milieu EFH conditionné 2 - 3 fois par semaine entre passages.

Résultats

Rats adultes de la moelle épinière cellules cultivées dans une culture en suspension dans un milieu EFH se former de petites neurosphères (colonies de cellules non différenciées) dans 1 semaine de placage initial. Dans les cultures primaires, la plupart des cellules étalées mourront et les cellules souches du facteur sensible croissance va proliférer et sont choisis dans le milieu EFH. Par passage 3, il y aura de nombreux neurosphères flottant librement à environ 100 m de diamètre (figure 2A).

Discussion

Au cours de la dissection de la moelle épinière soins de tissu de rat doivent être prises pour ne pas endommager la moelle épinière tout en effectuant la laminectomie. Il est plus facile d'isoler le tissu périventriculaire lorsque les segments de la moelle épinière sont intacts. Les segments de tissus devraient être complètement immergés dans un tampon de dissection et les méninges recouvrant la matière blanche et peuvent être découpées en bandes longitudinales avec microciseaux. Alternativement, for...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM