La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

Resumen

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

Resumen

Además de los métodos establecidos como Western blot, se necesitan nuevos métodos para cuantificar rápida y fácilmente asociado a la enfermedad α-sinucleína (aS ^D) en modelos experimentales de synucleopathies. Una línea de ratón transgénico (M83) sobre-expresión de los aS A53T humanos y desarrollar espontáneamente un fenotipo clínico dramática entre ocho y 22 meses de edad, que se caracterizan por síntomas que incluyen pérdida de peso, postración, y deterioro motor severa, se utilizó en este estudio. Para los análisis moleculares de aS ^D (aS asociado a la enfermedad) en estos ratones, un ELISA fue diseñado para cuantificar específicamente aS ^D en ratones enfermos. Análisis del sistema nervioso central en este modelo de ratón mostró la presencia de aS ^D principalmente en las regiones cerebrales caudal y la médula espinal. No hubo diferencias en la distribución aS ^D entre diferentes condiciones experimentales que conducen a la enfermedad clínica, es decir, en uninoculado y normalmente envejecimiento ratones transgénicos y en ratones inoculados con extractos de cerebro de ratones enfermos. La detección específica de aS ^D inmunorreactividad utilizando un anticuerpo contra la Ser129 fosforilada aS por ELISA esencialmente correlacionados con la obtenida por Western blot e inmunohistoquímica. Inesperadamente, se observaron resultados similares con varios otros anticuerpos contra la parte C-terminal de aS. La propagación de aS ^D, lo que sugiere la participación de un mecanismo de "-prión como", de este modo se puede monitorizar y cuantificar en este modelo de ratón utilizando un enfoque ELISA fácilmente.

Introducción

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

Protocolo

Todos los procedimientos y protocolos con animales estaban en conformidad con la Directiva 86/609 / CEE del Consejo y ratificado por venir, el Comité Nacional Francés para la consideración de la ética en la experimentación animal (protocolo de 11 a 0043) de la CE. Los animales fueron alojados y atendidos en ANSES aprobada de instalaciones experimentales en Lyon (aprobación B 69387 0801).

1. Preparación de ratones

1. La eutanasia a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de dosis letal de pentobarbital de sodio.
2. Recuperar todo el cerebro del cráneo del ratón y colocarlo en un 35 mm placa Petri de plástico en el hielo hasta la extracción.
3. Se extrae la médula espinal cervical.
   NOTA: aS Extraer ya sea desde una de las mitades del cerebro después de la sección sagital o de cerebros de ratón disecados, disponible después de los experimentos enumerados en la Tabla 1.

Experiment	Ratones Inóculo (cerebro equivalente)	Período de supervivencia (Dpi)	La mediana / supervivencia máxima (días de edad)	aS d detección por ELISA / BM / IHC
1	Los ratones inoculados	441 ± 166	419/736	8/8
2	Ratones inoculados (0,2 mg)	150 ± 52	140/241	9/9

Tabla 1. Lista de experimentos realizados en ratones M83. Las inoculaciones se realizaron a las 6 semanas para el experimento 2 en la zona cortical-estriado con 20 l de un homogeneizado de cerebro de un ratón enfermo (1% peso / vol en glucosa al 5%), después de anestesia de 6 semanas de edad ratones homocigotos M83 en un 3% la inhalación de isoflurano. dpi: días después inoculación.

2. aS Extracción de Brain Mitades

1. Sagitalmente cortó el cerebro para obtener dos mitades. Pesar cada mitad en un tubo que contiene ribolysis bolas de molienda.
2. Preparar elevado de sal (HS) tampón que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% de fosfatasa inhibidores de la proteasa y cócteles. Añadir tampón elevado de sal a las mitades del cerebro para obtener 20% (peso / volumen) homogeneizados.
3. Preparar las muestras de las mitades del cerebro utilizando un homogeneizador mecánico a 6,0 m / s para 23 seg dos veces. Después de la primera homogeneización 23 seg, colocar los tubos que contienen los homogeneizados en hielo durante 2 minutos antes de que el segundo ciclo de 23 seg.
4. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 5 min para eliminar fragmentos cerebrales no molidos. Recuperar los sobrenadantes, se dividen en 200 ml de alícuotas y mantenerlos a -80 ° C para el análisis ELISA posterior.

3. aS Extracción de diseccionado cerebrales Regiones

1. Diseccionar untodo el cerebro en un 35 mm placa Petri de plástico en el hielo con una lupa de baja potencia (ampliación 8X) utilizando dos forcipes cuyos extremos se mantienen juntos, excepto cuando la disección del hipocampo. No exceda de 10 minutos para preservar la integridad del cerebro. Coloque el cerebro boca arriba y recuperar las regiones cerebrales siguientes en este orden:
   1. Separar una de las dos bulbos olfatorios utilizando fórceps colocados justo detrás de la bombilla. Separe desde el cerebro por un movimiento hacia abajo. Repita esta operación para el segundo foco.
   2. Cuña suavemente las pinzas entre las dos cortezas y moverlo hacia delante para facilitar la disociación de las dos cortezas. Mantener el cerebro en su lugar con uno fórceps, utilizar otra para separar la corteza del hipocampo.
   3. Coloque la pinza 2 mm por debajo de la corteza. Mantener una presión suave sobre las pinzas hasta la parte superior del hipocampo es visible. Despegar la primera parte de la corteza, y repetir con la segunda parte. Utilice las pinzas para separar las dos cortezascomenzando en el hipocampo y moviéndose hacia la parte delantera del cerebro.
   4. Coloque las pinzas abiertas alrededor de uno de los hipocampos. Cierre la pinza en la parte inferior del hipocampo luego retire suavemente, recuperando tanto como sea posible. Repita el procedimiento para el segundo hipocampo.
   5. Coloque las pinzas abiertas debajo de uno de los cuerpos estriados y suavemente separarlo del cerebro. Utilice las pinzas para quitar cualquier corteza restante del cuerpo estriado. Repita este procedimiento para el segundo cuerpo estriado.
   6. Usa los fórceps para deprimir suavemente por 2 mm el contorno del cerebelo para facilitar la separación del cerebelo del cerebro. Coloque la pinza justo detrás del cerebelo y quitarlo moviendo la pinza hacia adelante.
   7. Utilice la parte ancha de las pinzas para levantar el mesencéfalo con el fin de ver claramente donde se une con el tallo cerebral. Hacer una incisión vertical en la unión luego retire el tallo cerebral.
   8. Coloque la pinza detrás del mesencéfalo, que is compuesta de cuatro estructuras redondeadas. Una incisión vertical hasta el mesencéfalo ha sido completamente separado del cerebro restante.
2. Preparar homogeneizados de% variable (peso / volumen) en tampón HS, dependiendo de la cantidad de tejidos disponibles, es decir, 5% homogeneizado para un peso entre 10 y 30 mg, 10% para un peso entre 30 y 80 mg, y 20% para un peso por encima de 80 mg.
   1. Añadir un volumen adecuado de tampón HS a las regiones cerebrales disecadas para obtener el% esperado de homogeneizado.
   2. Vortex y comprobar que los tejidos están completamente inmersos en el búfer HS.
   3. Homogeneizar las muestras preparadas a partir de las regiones cerebrales disecadas o la médula espinal cervical con un triturador de tejidos compuesta de un tubo de vidrio de borosilicato y dos manos de mortero, A y B.
   4. Verter cada región del cerebro de ser aplastado directamente en el tubo. Inserte mano de mortero A en el tubo y retraerlo. Repita este movimiento alrededor de diez veces para disociar el tejido. A continuación, utilice la maja B para continuac moliendo el tejido con 20 movimientos. La transferencia de los homogeneizados en un tubo de 1,5 ml con una pipeta de transferencia 1 ml.
3. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar cualquier fragmento cerebrales no molidos. Recuperar los sobrenadantes, dividirlos en 200 ml de alícuotas y mantenerlos a -80 ° C para el análisis ELISA posterior.

4. Detección de aS por ELISA

1. Diluir los anticuerpos de recubrimiento de 0,01 ng / ml. Utilice-aS policlonal anti conejo o monoclonal clon 42 de anticuerpos en 50 mM Na ₂ CO ₃ / _NaHCO3 (pH 9,6).
2. Escudo del microplacas de 96 pocillos con 100 l por pocillo de esta solución de revestimiento, y dejar a 4 ° CO / N. Utilice el anticuerpo policlonal de conejo anti-aS en la solución de recubrimiento para ELISA utilizando anticuerpos de detección syn514, clonar 42, LB509, AS11, 4D6 o 8A5. Utilice el clon de anticuerpo monoclonal anti-aS 42 como una solución de revestimientoen combinación con el anticuerpo de detección anti-pSer129 aS.
   NOTA: Si es necesario, las placas pueden mantenerse a 4 ° C durante una semana antes de la prueba ELISA se lleva a cabo.
3. Utilice un lavador de placas para lavar las placas cinco veces con 300 l de solución salina tamponada con fosfato con 0,05% de Tween 20 (PBST) por pocillo. A partir de este paso hacia adelante, la incubación es a TA.
4. Añadir 200 l de PBS T20 tampón de bloqueo por pocillo. Agitar durante 1 hora a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
5. Diluir los homogeneizados de cerebro (dilución 1: 100 de los homogeneizados de 20%, 01:50 de los homogeneizados de 10% y 1:25 de los homogeneizados de 5% en PBST BSA 1%), y añadir 100 l a cada pocillo. A continuación se incuba durante 2 horas con agitación a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
6. Añadir los diferentes anticuerpos de detección aS en PBST con BSA 1% en las diluciones mencionadas en la Lista de materiales. Incubar durante 1 hora a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
7. Añadir o bien contra-Ratón o anti-conejo conjugados HRP IgG diluyeron 1: 8000 en PBST suplementado con BSA 1% durante 1 h con agitación a 150 rpm. Lavar las placas cinco veces con PBST.
8. Añadir 100 l de 3,3 ', solución de 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo e incubar durante 15 min en la oscuridad con agitación a 150 rpm.
9. Detener la reacción mediante la adición de 100 l de HCl 1 N por pocillo luego medir la absorbancia a 450 nm con el lector de microplacas.
10. Para el análisis de datos, restar el valor de DO obtenido en un pozo con todos los reactivos excepto las muestras de cerebro de ratón (así en blanco) de los valores de la DO medidos para cada una de las muestras analizadas.

5. Epitope Mapping

1. Realizar el mapeo de epítopos de acuerdo con el método descrito por Osman ^16. En pocas palabras, los péptidos del punto de la secuencia de α-sinucleína humana contiene 12 aminoácidos de nitrocelulosa con 10 aminoácidos que se solapan.
2. Bloque con 50 mM Tris / tampón NaCl 150 mM pH 10 que contiene 0,05% de Tween 20 y 5% de leche en polvo. Incubar el anticuerpo en solución de bloqueo a una concentración de 2 mg de anticuerpo por ml a 2-10 ° CO / N.
3. Se lava la membrana tres veces con 50 mM Tris / NaCl 150 mM pH del tampón 10 que contiene 0,05% de Tween 20. Incubar con el anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado HRP. Lavar la membrana otros cinco veces con el mismo tampón a continuación mancha usando un kit de tinción blot TMB occidental.

6. Análisis estadístico

1. Utilice el paquete de software de R y nlme para realizar regresiones de efectos mixtos para modelar OD. Para cada comparación, lleve a cabo un modelo de regresión efecto mixto. Use un efecto fijo para distinguir los síntomas de los grupos asintomáticos.
2. Utilice un efecto aleatorio para reflejar la variabilidad de repeticiones para un ratón dado. Compruebe homocedasticidad mediante el examen de los residuos y, si es necesario, utilice las funciones de varianza para modelar la estructura de la varianza de los errores dentro de los grupos de acuerdo con Pinheiro y Bates ¹7. Establecer 0,05 como el umbral de significación de P.

Resultados

En este estudio, las pruebas ELISA utilizadas específicamente identificados aS enfermedades asociadas (aS ^D) en homogeneizados de cerebro preparados en un tampón de alta sal de ratones enfermos M83. El uso de un anticuerpo que reconoce específicamente pSer129 aS (p = 0,0074), el ELISA distingue fácilmente de edad, ratones enfermos (> 8 meses de edad) de los jóvenes (2-5 meses de edad), los ratones sanos M83 (Figura 1). Varios otros anticuerpos mostraron igualmente altos señales (>...

Discusión

El uso de un ELISA se demostró para detectar específicamente aS ^D directamente a partir de homogeneizados de cerebro de ratón durante la enfermedad en el modelo de ratón transgénico M83. De hecho, este ELISA podría distinguir fácilmente los ratones M83 enfermos de ratones sanos M83 utilizando homogeneizados de cerebro solamente enteros en tampón elevado de sal.

Los pasos más importantes para los resultados exitosos que utilizan este ELISA son: disección correctamente las...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290