인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

요약

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

초록

웨스턴 블롯 등의 설립 방법과 더불어, 새로운 방법을 쉽고 빠르게 synucleopathies의 실험 모델에서 질병 관련 α-synuclein의 (αS ^D)를 정량화하기 위해 필요하다. 과발현 인간 A53T의 αS를 자발적으로 체중 감소, 쇠약, 및 심각한 운동 장애 등의 증상을 특징으로 나이 여덟 22 개월 사이 극적인 임상 표현형을 개발하는 트랜스 제닉 마우스 선 (M83)는이 연구에 사용 하였다. 이 마우스 αS ^D (질병 관련 αS)의 분자 분석을 위해, ELISA 특별히 아픈 쥐에서 αS ^D를 정량화하기 위해 설계되었습니다. 이 마우스 모델에서 중추 신경계의 분석은 주로 꼬리 뇌 영역과 척수 αS ^D의 존재를 보여 주었다. 즉, 임상 질환으로 이어지는 다른 실험 조건 사이의 αS ^{D 분포의} 차이는 uninocul에 없었다ated 정상적으로 형질 전환 마우스를 노화와 병 마우스의 뇌 추출물 접종 생쥐에서. Ser129에 대한 항체를 사용하여 αS ^{D 면역} 반응의 구체적인 검출은 본질적으로 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학에 의해 얻어진 그 상관 관계를 ELISA로 αS를 인산화. 예기치 않게, 유사한 결과 αS의 C 말단 부위에 대해 여러 가지 다른 항체를 관찰 하였다. "프리온 같은"기구의 관련을 암시 αS ^D의 전파는, 쉽게 감시되고 따라서, ELISA 접근법을 사용하여이 마우스 모델에서 정량화 할 수있다.

서문

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

프로토콜

모든 절차와 동물을 포함하는 프로토콜은 EC 지침 609분의 86 / EEC 및 오는, 동물 실험 (프로토콜 11-0043)에서 윤리의 고려에 대한 프랑스의 국가위원회의 비준을 따라했다. 동물 보관 및 ANSES의가 (0801 69387 승인 B) 리옹에 실험 시설을 승인에 마음에 든다고했다.

마우스 1. 준비

1. 펜토 바르 비탈 나트륨의 치사량의 복강 내 주사하여 마우스를 안락사.
2. 마우스 두개골에서 뇌 전체를 검색 및 추출까지 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다.
3. 자궁 경부 척수의 압축을 풉니 다.
   참고 : 추출 αS 중 하나를 표 1에 나와있는 실험을 사용할 수 없습니다 시상 단면 후 또는 해부 마우스의 뇌에서 뇌 반쪽의 하나에서.

Experimen티	마우스 접종 (뇌에 해당)	생존 기간 수 (dpi)	중간 / 최대 생존 (일 이전)	엘리사에 의해 D 감지 αS / WB / IHC
1	Uninoculated 마우스	441 ± 166	736분의 419	8/8
(2)	접종 한 마우스 (0.2 mg)을	150 ± 52	241분의 140	9/9

M83 마우스에서 수행 실험 표 1. 목록은. 예방 접종은 후, (포도당 1 % 중량 / 권 5 %) 아픈 마우스의 뇌 균질의 20 μL와 striato - 대뇌 피질의 영역에서 실험이 6 주에 실시 하였다 3 % 이소 플루 란 흡입 6 주 오래 된 동형 접합 M83 마우스의 마취. dpi로는 : 일 inocul 게시ATION.

뇌 반쪽 2. αS 추출

1. Sagittally 두 개의 반쪽을 얻기 위해 뇌를 잘라. 그라인딩 볼을 넣은 ribolysis 튜브에 각각 절반을 단다.
2. 에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM의 염화나트륨, 5mM의 EDTA, 1mM의 DTT, 1 % 인산 및 프로테아제 저해제 칵테일을 함유 고염 (HS) 버퍼를 준비한다. 20 % (중량 / 부피) 균질를 얻기 위해 뇌의 절반에 높은 소금 버퍼를 추가합니다.
3. 6.0 M에서 기계 균질화를 사용하여 뇌의 반쪽에서 샘플을 준비 / S 23 초 동안 두 번. 첫 번째 23 초 균질화 한 후, 두 번째 23 초주기 전에 2 분 동안 얼음에 균질을 포함하는 튜브를 배치합니다.
4. 5 분 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 200 μL 씩에 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ° C에서 그들을 유지, 상층 액을 복구 할 수 있습니다.

해부 두뇌 지역에서 3 αS 추출

1. 해부끝 해마를 해부 할 때를 제외하고 함께 보관이 forcipes를 사용하여 낮은 전력 돋보기 (8 배 확대)와 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 전체 뇌. 뇌의 무결성을 유지하기 위해 10 분을 초과하지 마십시오. 뇌를 놓고 바로 옆이 순서대로 다음과 같은 뇌 영역을 검색 :
   1. 단지 전구 뒤에 배치 집게를 사용하여 두 개의 후각 전구 별도의 하나. 아래쪽으로 이동에 의해 뇌에서 분리. 두 번째 전구에 대해이 작업을 반복합니다.
   2. 조심스럽게 두 대뇌 피질 사이에 집게를 쐐기 두 대뇌 피질의 분리를 용이하게하기 위해 앞으로 이동합니다. 한 집게와 장소에 두뇌를 유지, 해마에서 대뇌 피질을 분리하는 또 다른를 사용합니다.
   3. 집게에게 피질 아래 2mm를 놓습니다. 해마의 상단이 보일 때까지 집게에 부드러운 압력을 유지한다. 피질의 첫 번째 부분을 벗겨, 두 번째 부분 반복합니다. 두 개의 대뇌 피질을 분리 집게를 사용하여해마에서 시작하여 뇌의 앞쪽으로 이동.
   4. 해마 중 하나 주위에 오픈 집게를 놓습니다. 부드럽게 최대한 복구, 제거 해마의 하단에있는 집게를 닫습니다. 두 번째 해마에 대해이 절차를 반복합니다.
   5. 선조체의 하나 아래 열린 집게를 놓고 부드럽게 뇌에서 분리. 선조체에서 남아있는 피질을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 두 번째 선조체에 대해이 절차를 반복합니다.
   6. 부드럽게 뇌에서 소뇌의 분리를 용이하게하기 위해 2mm 소뇌의 윤곽에 의해 우울하기 위해 집게를 사용합니다. 다만 소뇌 뒤에 집게를 놓고 앞으로 집게를 이동하여 제거합니다.
   7. 이 뇌간에 가입되는 시점을 명확하게보기 위해 중뇌 인상 집게의 넓은 부분을 사용합니다. 교차점에서 수직 절개 후 뇌간을 제거합니다.
   8. , 중뇌 뒤 집게를 배치하는 나는네 개의 둥근 구조로 구성 s의. 중뇌가 완전히 남아있는 뇌에서 분리 될 때까지 수직으로 절개.
2. 가변 % HS 버퍼 (중량 / 부피), 가능한 조직의 양에 따라, 즉, 10 및 30 mg의 간 중량 5 % 파쇄, 30 및 80 mg의 간 중량 10 %, 및 20 %의 균질 준비 80 mg의 위의 무게.
   1. 균질 예상 %를 얻기 위해 해부 뇌 영역에 HS 버퍼의 적절한 볼륨.
   2. 소용돌이와 조직을 완전히 고속 버퍼에 포장되어 있는지 확인합니다.
   3. 붕규산 유리 튜브 및 두 방앗, 및 B. 이루어지는 조직 분쇄기로 해부 뇌 영역 또는 자궁 척수로부터 제조 된 샘플 균질화
   4. 튜브에 직접 분쇄 할 각 뇌 영역을 따르십시오. 튜브에 유봉을 삽입하고 철회. 조직을 떼어 놓다하기 위해이 운동을 약 10 회 반복한다. 그리고 C에 유봉 (B)를 사용상기 (20)의 움직임과 함께 조직 연마 ontinue. 1 ml의 전송 피펫 1.5 ML 튜브에 균질을 전송합니다.
3. 어떤 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. , 상층 액을 검색 200 μL 씩에 그들을 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하십시오.

ELISA에 의해 αS 4. 검출

1. 0.01 ng를 / ㎖으로 코팅 된 항체를 희석. 50 mM의 나 ₂ CO ₃ / _NaHCO3를 완충액 (pH 9.6)에 반 αS 토끼 폴리 클로 날 또는 단일 클론 클론 (42) 항체를 사용합니다.
2. 코트는 96 웰 마이크로이 코팅 용액을 잘 당 100 μL, 그리고 4 ° CO / N에 둡니다. 검출 항체를 사용하여 ELISA를 syn514 용 코팅 용액에 안티 αS 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 42 LB509, AS11, 4D6 또는 8A5 클론. 코팅 용액으로 안티 αS 모노클로 날 항체 클론 (42)을 사용하여항 pSer129 αS 검출 항체와 조합.
   주 : 플레이트 ELISA 일주일 전에 4 ℃에서 유지 될 수있다 필요한 경우 수행된다.
3. 물론 당 0.05 % 트윈 20 (PBST)와 플레이트를 인산 완충 생리 식염수 300 μL로 5 회 씻어 접시 세척기를 사용합니다. 이후이 단계에서 배양 실온에 있습니다.
4. T20 PBS를 잘 당 버퍼를 차단의 200 μl를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 흔들어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
5. (: 20 % 균질 100을, 10 %의 균질 1:50 PBST BSA 1 %에서 5 %의 균질 1시 25분 희석 1)를 각 웰에 100 μl를 추가 뇌 균질 액을 희석한다. 150 rpm으로 진탕하면서 다음 2 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
6. 자료 목록에 언급 된 희석에서 BSA와 PBST 1 %를 다른 αS 검출 항체를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
7. 안티를 추가150 rpm에서 진탕하면서 1 시간 동안 1 % BSA로 보충 PBST로 8000 : - 마우스 또는 항 - 토끼의 IgG HRP 접합체 (1) 희석 하였다. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
8. 각 웰에, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 솔루션 '3,3의 100 μl를 추가하고 150 rpm으로 흔들어 동안 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
9. 그럼 마이크로 플레이트 리더와 450 nm에서 흡광도 측정에 1 N의 HCl 100 μl를 첨가하여 반응을 정지.
10. 데이터 분석을 위해, 분석 시료의 각각에 대해 측정 된 OD 값으로부터 임의의 마우스 뇌 샘플 (블랭크 웰)을 제외하고 모든 시약 웰에서 얻어진 OD 값을 뺀다.

5. 에피토프 매핑

1. 오스만 ^(16)에 의해 기술 된 방법에있어서, 에피토프 맵핑을 수행한다. 간략하게, 10 중첩 아미노산 니트로 셀룰로오스 12 개의 아미노산을 함유하는 인간 α-synuclein의 시퀀스의 스폿 펩타이드.
2. 50mM 트리스 / 150 mM의 염화나트륨 완충액 pH 1 차단0, 0.05 % 트윈 20, 5 % 우유 분말을 함유. 2-10 ° CO / ml의 N에서 당 2 μg의 항체 농도에서 차단 용액에 항체 인큐베이션.
3. 세포막을 50mM 트리스 / 150 염소 항 - 마우스 IgG HRP 컨쥬 게이트 0.05 % 트윈 20을 함유하는 인큐베이션 mM의 염화나트륨 완충액 pH 10을 사용하여 세 번 씻는다. 다음 같은 버퍼를 사용하여 다른 5 배 웨스턴 블롯 TMB 염색 키트를 사용하여 얼룩 막 씻으십시오.

6. 통계 분석

1. 외경을 모델로 혼합 효과 회귀 분석을 수행하기 위해 R 소프트웨어와 NLME 패키지를 사용합니다. 각각의 비교를 위해, 혼합 효과 회귀 모형을 수행합니다. 무증상 그룹에서 증상을 구분하는 고정 효과를 사용합니다.
2. 주어진 마우스 반복의 변화를 반영하기 위해 임의의 효과를 사용합니다. 잔류 물을 검사하여 homoscedasticity 확인하고, 필요한 경우 및 핀 헤이 베이츠 ^1에 아울러 집단 내 에러의 분산 구조를 모델링 분산 함수를 사용7. (P)의 중요성 임계 값 0.05을 설정

결과

이 연구에서 사용 된 ELISA를 특별히 아픈 M83 마우스에서 높은 소금 버퍼에 준비 뇌 균질 질병 관련 αS (αS ^D)를 확인했다. 특히 pSer129 αS (P = 0.0074)를 인식하는 항체를 사용하여 ELISA 쉽게 젊은 (구 2-5개월), 건강 M83 마우스 (그림 1)에서 이전, 아픈 마우스 (> 8 개월)를 구별한다. 몇 가지 다른 항체는 유사하게 높은 신호 만 아픈 마우스의 뇌 균질 (> 0.6 OD)를 보여 주었다. 이 4D6?...

토론

ELISA의 사용은 구체적 M83 트랜스 제닉 마우스 모델에서 질병 중에 마우스 뇌 균질 물로부터 직접 αS ^D를 검출하는 것으로 입증되었다. 사실,이 ELISA 쉽게 높은 소금 버퍼 만 전체 뇌 균질를 사용하여 건강한 M83 마우스에서 아픈 M83 마우스를 구별 할 수있다.

이 ELISA를 사용하여 성공적인 결과를 위해 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 제대로 해부하는 동안 손상을 방...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290