人間A53T変異αシヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳における強化ELISAによる疾患関連αシヌクレインの検出

要約

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

要約

ウエスタンブロットのような確立された方法に加えて、新たな方法は、迅速かつ容易にsynucleopathiesの実験モデルにおいて疾患関連αシヌクレイン^{（αSD）を}定量化するために必要とされています。過剰発現しているヒトA53TのαSを自発的に体重減少、衰弱、重度の運動障害などの症状を特徴と年齢の8と22ヶ月の間に劇的な臨床表現型を開発するトランスジェニックマウス系統（M83）は、この研究で使用しました。これらのマウスにおける^αSD（疾患関連αS）の分子解析のために、ELISAは、特に病気のマウスで^αSDを定量化するために設計されました。このマウスモデルにおいて、中枢神経系の分析は、主に、尾側脳領域および脊髄における^αSDの存在を示しました。臨床疾患につながる異なる実験条件、 すなわち間^αSD分布の違いはuninoculに、ありませんでしたated、通常トランスジェニックマウスの老化と病気のマウスからの脳抽出物を接種したマウスで。基本的に、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学によって得られたものと相関して、ELISAによってSer129リン酸化αSに対する抗体を用い^αSD免疫反応性^の特異的検出。意外にも、同様の結果がαSのC末端部分に対するいくつかの他の抗体を用いて観察しました。 ^αSDの伝播は、「プリオン様」メカニズムの関与を示唆し、容易に監視し、ELISA法を用いて、このマウスモデルにおいて定量することができます。

概要

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

プロトコル

動物に関わるすべての手順およびプロトコルは、EC指令609分の86 / EECに従ったと動物実験（プロトコル11から0043）に倫理の検討のために来る、フランスの国家委員会によって批准します。動物が収容され、ANSESの中に世話したリヨン（承認B 69387 0801）の実験施設を承認しました。

マウスの作製

1. ペントバルビタールナトリウムの致死量を腹腔内注射によりマウスを安楽死させます。
2. マウスの頭蓋骨から脳全体を取得し、抽出するまで氷上に35ミリメートルのプラスチックシャーレに入れてください。
3. 頸髄を抽出します。
   注 ：矢状切片後、または表1に記載した実験の後に利用可能な解剖マウスの脳、のいずれかから脳の半分のいずれかからαSを抽出します。

ExperimenT	マウス 接種材料（脳相当）	生存期間 （DPI）	中央値/最大生存 （日齢）	ELISAによるαSdを検出 / WB / IHC
1	未接種のマウス	441±166	736分の419	8/8
2	接種したマウス（0.2 mg）を	150±52	241分の140	9/9

M83マウスで実施した実験の表1のリスト。接種をした後、病気のマウス（グルコース5％の1％重量/容量）の脳ホモジネート20μlのstriato皮質領域での実験2のための6週間で実施しました3％イソフルラン吸入による6週齢ホモ接合M83マウスの麻酔。解像度：日後inoculエーション。

脳を半減2.αS抽出

1. 矢状は二つの部分を取得するために脳をカット。粉砕ボールを含むribolysisチューブに各半分を計量。
2. 50 mMトリス - 塩酸、pHが7.5、750のNaCl、5mMのEDTA、1mMのDTT、1％ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む高塩（HS）のバッファを準備します。 20％（重量/体積）ホモジネートを得るために、脳の半分に、高塩緩衝液を追加します。
3. 脳からサンプルを調製二回23秒間6.0メートル/秒で機械的ホモジナイザーを用いて半分になります。最初の23秒の均質化の後、第二の23秒サイクルの前に2分間氷上でホモジネートを含むチューブを配置します。
4. 5分間の未粉砕脳断片を除去するために1000×gで試料を遠心。 200μlのアリコートに分割し、その後のELISA分析のために-80℃でそれらを保つ、上清を回復します。

解剖脳の領域から3αS抽出

1. 解剖します両端海馬を解剖する場合を除いて一緒に保持されている2つのforcepsの複数形を用いて低電力拡大鏡（8X倍率）と氷上で35ミリのプラスチックシャーレ内の全脳。脳の整合性を保持するために10分を超えないようにしてください。脳の右側を上に配置し、このためには、以下の脳領域を検索します：
   1. ちょうど球の後ろに配置鉗子を使用して、2つの嗅球の1を分離します。下方に移動することにより、脳からそれを取り外します。第二の電球のため、この操作を繰り返します。
   2. ゆっくり2皮質の間に鉗子を楔二皮質の解離を促進するために前方に移動します。 1鉗子で所定の位置に脳を維持し、海馬から大脳皮質を分離するために別のものを使用しています。
   3. 2ミリメートル皮質下の鉗子の位置を調整します。海馬のトップが表示されるまで、鉗子で穏やかな圧力を維持します。皮質の最初の部分を剥がし、第2の部分で繰り返します。 2皮質を分離するために鉗子を使用して、海馬で開始し、脳の前部に向かって移動します。
   4. 海馬の周りに開いた鉗子を置きます。海馬の一番下に鉗子を閉じて、その後静かに可能な限りの回収は、それを削除します。第海馬のための手順を繰り返します。
   5. 線条体の1以下に開いた鉗子を置き、ゆっくりと脳から分離。線条体から残りの皮質を除去するために鉗子を使用してください。第二線条体について、この手順を繰り返します。
   6. 静かに脳から小脳の分離を容易にするために2ミリメートル小脳の輪郭によって押下する鉗子を使用してください。ただ小脳後ろ鉗子を置き、前方に鉗子を移動させることによって、それを削除します。
   7. それは脳幹に参加する場所をはっきりと見るために脳を高めるために鉗子の広い部分を使用してください。接合部に縦切開を行い、次いで脳幹を削除します。
   8. 脳の後ろに鉗子を置き、どのI4丸みを帯びた構造からなります。■。脳が完全に残りの脳から分離されるまで垂直に切開。
2. 利用可能な組織の量に応じて、HSバッファ変数％（重量/体積）のホモジネートを調製し、 すなわち、5％の10と30mgの間の重量のためにホモジネート、30及び80 mgの間の重量で10％、および20％ 80ミリグラム以上の重量のために。
   1. ホモジネートの期待％を取得するために解剖した脳領域にHSバッファの適切な量を追加します。
   2. 渦と組織が完全にHS緩衝液に浸漬されていることを確認してください。
   3. 解剖した脳領域または頸髄ホウケイ酸ガラス管からなる組織グラインダーと二乳棒、AおよびBから調製したサンプルをホモジナイズ
   4. チューブに直接破砕されるべき各脳領域を注ぎます。チューブに乳棒Aを挿入し、それを撤回。組織を解離するために、この運動を10回程度繰り返します。次にCに乳棒Bを使用さらに20の動きで組織を粉砕ontinue。 1ミリリットルの転送ピペットで1.5mlチューブにホモジネートを転送します。
3. 任意の未粉砕脳断片を除去するために4℃で5分間、1000×gでサンプルを遠心。 、上清を取り出し、200μlのアリコートにそれらを分割し、その後のELISA分析のために-80℃で保管してください。

ELISAによるαS4.検出

1. 0.01 ng / mlでのコーティング抗体を希釈します。 50 mMののNa ₂ CO ₃ / NaHCO _3で緩衝液（pH 9.6）中の抗αSウサギポリクローナルまたはモノクローナルクローン42抗体のいずれかを使用してください。
2. コー​​ト96ウェルマイクロプレートこの塗布液のウェルあたり100μlで、4°CO / Nに出発。検出抗体をsyn514を使用してのELISA用塗布液、クローン42、LB509、AS11、4D6または8A5で抗αSウサギポリクローナル抗体を使用してください。塗布液のような抗αSモノクローナル抗体クローン42を使用して抗pSer129αS検出抗体との組み合わせで。
   注 ：必要に応じてELISAを行う前に、プレートを、一週間、4℃に保持することができます。
3. ウェル当たり0.05％のTween 20（PBST）でプレートをリン酸緩衝生理食塩水300μlので5回洗浄するためにプレートウォッシャーを使用してください。以降、このステップから、インキュベーションは室温です。
4. ウェルあたりブロッキングバッファーT20200μlのPBSを追加します。 150rpmで1時間振とうします。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
5. （20％ホモジネートの100を、10％ホモジネート1:50及び1％BSA PBST中の5％ホモジネートの1：25希釈物1）、および各ウェルに100μlを添加する脳ホモジネートを希釈します。 150 rpmで振とうしながら2時間インキュベートします。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
6. 物質一覧に記載された希釈で1％BSAを含むPBSTで異なるαS検出抗体を追加します。 150rpmで1時間インキュベートします。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
7. アンチのいずれかを追加150rpmで振とうしながら1時間、1％BSAを補充したPBSTで8,000：-mouseまたは抗ウサギIgG HRPコンジュゲートの1に希釈しました。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
8. 150rpmで振とうしながら、3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）を100μlを各ウェルに溶液を加え、暗所で15分間インキュベートします。
9. その後、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定し、ウェル当たり1 NのHClを100μl加えて反応を停止します。
10. データ分析のために、分析試料のそれぞれについて測定したOD値から任意のマウス脳試料（ブランクウェル）を除くすべての試薬を用いてウェル中で得られたOD値を減算します。

5.エピトープマッピング

1. オスマン¹⁶に記載の方法に従って、エピトープマッピングを行います。簡単に言えば、10アミノ酸重複でニトロセルロース上の12個のアミノ酸を含むヒトαシヌクレインの配列のスポットペプチド。
2. 50mMトリス/ 150mMのNaCl緩衝液pH 1にブロック0 0.05％のTween 20および5％粉乳を含みます。 2-10°CO / Nで1mlあたり2μgの抗体の濃度でブロッキング溶液中の抗体をインキュベートします。
3. メンブレンを50mMのヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲートで、0.05％のTween 20を含有するインキュベートトリス/ 150mMのNaCl緩衝液pH 10を用いて3回洗浄します。同じバッファを使用して別の5回は、その後、ウエスタンブロットTMB染色キットを用いて染色した膜を洗浄してください。

6.統計分析

1. ODをモデル化するために混合効果回帰を実行するために、Rソフトウェアとnlmeパッケージを使用します。それぞれの比較のために、混合効果回帰モデルを実行します。無症候性の基から症候区別するために一定の効果を使用してください。
2. 与えられたマウスのための繰り返しの変動を反映するために、ランダムな効果を使用します。残差を調べることにより等分散性を確認し、必要に応じて、ピニェイロとベイツ¹に合わせて群内誤差の分散構造をモデル化するために、分散機能を使用します7。Pの有意性閾値として0.05を設定します。

結果

本研究では、ELISAは病気のM83マウスからの高塩緩衝液中で調製脳ホモジネート中で具体的に特定疾患関連^{αS（αSD）を}使用しました。具体的にはpSer129αSた（p = 0.0074）を認識する抗体を用い、ELISAは容易に若い（2-5ヶ月齢）、健康なM83マウス（ 図1）から（> 8ヶ月齢）古い、病気のマウスを区別します。いくつかの他の抗体は、病気のマウスからの脳ホモジネート中で同様...

ディスカッション

ELISAの使用は、特にM83のトランスジェニックマウスモデルにおける疾患の間にマウス脳ホモジネートから直接^αSDを検出すること^が実証されました。確かに、このELISAは、容易に、高塩緩衝液中で唯一の全脳ホモジネートを使用して健康なM83マウス由来の病気のM83マウスを区別することができます。

このELISAを用いて成功した結果を得るために最も重要な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290