Выявление заболевания, связанного α-синуклеина-повышенной ELISA в мозге трансгенных мышей с гиперэкспрессией Human A53T Мутация α-синуклеина

Резюме

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

Аннотация

В дополнение к установленным методам, как вестерн-блоттинга, новые методы необходимы, чтобы быстро и легко количественно, ассоциированных с заболеваниями α-синуклеина (alpha; S ^D) в экспериментальных моделях synucleopathies. Трансгенной линии мышей (M83) более-выражения A53T & alpha; S человека и спонтанно развивается резкое клиническое фенотип между восемью и 22 месяцев, характеризующихся симптомами, включая потерю веса, упадок сил, и серьезные нарушения двигателя был использован в данном исследовании. Для молекулярных анализов alpha; S ^D (заболевания, связанные alpha; S) в этих мышей, ИФА был разработан специально для количественного & alpha; S ^D в больных мышей. Анализ центральной нервной системы в этой модели мыши показали наличие ^D & alpha; S, главным образом, в каудальных областях мозга и спинного мозга. Там не было никаких различий в распределении & alpha; S ^D между различных экспериментальных условиях, приводящих к клинической болезни, т.е. в uninoculованные и, как правило старения трансгенных мышей и мышей, привитых с экстрактами мозга от больных мышей. Конкретное определение иммунореактивности & alpha; S ^D с использованием антитела против Ser129 фосфорилируется & alpha; S от ELISA существу коррелируют с полученной помощью Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. Неожиданно, аналогичные результаты были получены с несколькими другими антителами против С-концевой части & alpha; S. Распространение & alpha; S ^D, предполагая участие в "прионов, как" механизм, таким образом, может быть легко контролируется и количественно в этой модели мыши с использованием подхода, ELISA.

Введение

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

протокол

Все процедуры и протоколы с участием животных были в соответствии с Директивой ЕС 86/609 / EEC и ратифицированной придет, французского национального комитета для рассмотрения этики в животных экспериментирования (протокол 11-0043). Животных содержали и уход в АНСЕС одобрил экспериментальные установки в Лионе (утверждение Б 69387 0801).

1. Получение мышей

1. Эвтаназии мышей путем внутрибрюшинной инъекции летальной дозой пентобарбитала натрия.
2. Получить весь мозг от черепа мыши и поместите его в 35 мм пластиковой чашке Петри на льду, пока добыча.
3. Выписка шейного отдела спинного мозга.
   Примечание: Извлечение & alpha; S или от одной из половин мозга после сагиттальной срезов или из вскрытых мозга мыши, доступна после экспериментов, приведенных в таблице 1.

ЭкспериментальT	Мыши Посевной (мозг эквивалент)	Период выживания (Точек на дюйм)	Медиана / максимальная выживаемость (дней)	& alpha; S обнаружения разработки по ELISA / ВБ / IHC
1	Неинокулированную мышей	441 ± 166	419/736	8/8
2	Инокулировали мышей (0,2 мг)	150 ± 52	140/241	9/9

Таблица 1. Список экспериментов, выполненных на мышах M83. Прививки проводили в течение 6 недель эксперимента 2 в стриато-кортикальной области с 20 мкл гомогената мозга больного мыши (1% вес / объем в глюкозы 5%), после того, как анестезия 6 недель гомозиготных мышей M83 на 3% изофлуран ингаляции. дюйм: дней после inoculвания.

2. & alpha; S Выписка из мозга Половинки

1. Сагиттально сократить мозг, чтобы получить две половинки. Взвесьте каждую половину в ribolysis пробирку, содержащую мелющих шаров.
2. Подготовьте высоким содержанием соли (HS) буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 750 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 1% фосфатазы и ингибитор протеазы коктейли. Добавить соль высокого буфер половин мозга, чтобы получить 20% (вес / объем) гомогенаты.
3. Подготовка образцов из половин мозга с помощью механического гомогенизатора при 6,0 м / с в течение 23 сек в два раза. После первого 23 сек гомогенизации, поместить пробирки, содержащие гомогенатах на льду в течение 2 мин до второго цикла 23-сек.
4. Центрифуга образцов при 1000 х г в течение 5 мин, чтобы устранить неразмолотом фрагменты мозга. Восстановление супернатанты, разделить на 200 мкл аликвоты и хранить их при температуре -80 ° C для последующего анализа ELISA.

3. & alpha; S Выписка из рассеченной мозга регионов

1. Проанализируйтевесь мозг в 35 мм пластиковой чашке Петри на льду с низким лупы питания (8X увеличение), используя два forcipes, концы которых хранятся вместе, за исключением, когда рассекает гиппокамп. Не превышать 10 минут, чтобы сохранить целостность мозга. Поместите правую сторону мозга и получить следующие участки мозга в следующем порядке:
   1. Отдельная один из двух обонятельных луковиц, используя щипцы, размещенные позади лампочки. Снять его с мозгом с помощью вниз движения. Повторите эту операцию для второй лампы.
   2. Аккуратно клин щипцы между двумя кор и переместить его вперед, чтобы облегчить диссоциацию двух кор. Ведение мозг в месте с одной щипцами, используйте другой, чтобы отделить кору от гиппокампа.
   3. Расположите щипцов на 2 мм ниже коры. Поддержание нежный давление на щипцы, пока верхняя часть гиппокампа не видно. Слезьте первую часть коры, и повторите со второй частью. Используйте пинцет, чтобы отделить два корначиная с гиппокампа и движется по направлению к передней части мозга.
   4. Расположите открытый щипцы вокруг одного из гиппокампа. Закройте щипцы в нижней части гиппокампа затем осторожно удалить его, восстанавливается в максимально возможной степени. Повторите процедуру для второго гиппокампа.
   5. Расположите открытый щипцы ниже один из полосатых и аккуратно отделить его от мозга. Используйте пинцет, чтобы удалить оставшуюся кору полосатого тела. Повторите эту процедуру для второго стриатуме.
   6. С помощью щипцов, чтобы аккуратно нажать на 2 мм по контуру мозжечка, чтобы облегчить отделение от мозжечка головного мозга. Поместите щипцы позади мозжечка и удалить его путем перемещения щипцы вперед.
   7. Используйте широкую часть щипцов, чтобы поднять средний мозг для того, чтобы ясно видеть, где он присоединяется к ствола мозга. Сделайте вертикальный разрез на стыке затем снимите ствол мозга.
   8. Расположите щипцы за среднего мозга, которые яы состоит из четырех округлых структур. Надрезать вертикально до тех пор, средний мозг не был полностью отделен от остальной мозга.
2. Подготовьте гомогенатах переменной% (вес / объем) в HS буфера, в зависимости от количества доступных тканей, т.е. 5% гомогената на вес от 10 до 30 мг, 10% за весом от 30 до 80 мг, и 20% при весе выше 80 мг.
   1. Добавить адекватный объем HS буфера рассеченных областей мозга, чтобы получить ожидаемый% гомогената.
   2. Вихревые и убедитесь, что ткани полностью погружен в буфер HS.
   3. Однородный образцов, полученных из вскрытых участках головного мозга или шейного отдела спинного мозга с помощью гомогенизатора тканей, состоящей из боросиликатного стекла трубки и двух пестики, А и В.
   4. Налейте каждый регион мозга, чтобы быть раздавлен прямо в трубку. Вставка пестик A в трубу и отвода его. Повторите это движение около десяти раз, чтобы отделить ткань. Затем используйте пестик В до Соказанию в измельчение ткани с еще 20 движений. Передача гомогенатах в 1,5 мл пробирку с 1 мл пипетки.
3. Центрифуга образцов при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы устранить любые неразмолотом фрагменты мозга. Получить супернатанты, разделить их на 200 мкл аликвоты и хранить их при температуре -80 ° C для последующего анализа ELISA.

4. Выявление & alpha; S методом ИФА

1. Развести антитела покрытий 0,01 нг / мл. Используйте либо анти-alpha; S кроличьи поликлональные или моноклональные антитела, клон 42 в 50 мМ Na ₂ CO ₃ / NaHCO ₃ буфера (рН 9,6).
2. Шерсть 96-луночных микропланшетов 100 мкл на лунку раствора для покрытия этого, и оставить на 4 ° CO / N. Использование поликлональное антитело кролика против & alpha; S в растворе для покрытия для ИФА с использованием антител обнаружения syn514, клонировать 42, LB509, AS11, 4D6 или 8A5. Использование анти-alpha; S моноклональное антитело клон 42 в виде раствора для нанесения покрытияв сочетании с анти-pSer129 & alpha; S антитела обнаружения.
   Примечание: Если необходимо, пластины могут храниться при температуре 4 ° С в течение одной недели перед ELISA выполняется.
3. Использование промывки планшетов мыть пластины пять раз с 300 мкл фосфатно-солевом буфере с 0,05% Твин-20 (PBST) на лунку. Из этого шага вперед, инкубационный при комнатной температуре.
4. Добавить 200 мкл PBS, Т20 блокирующего буфера на лунку. Встряхивают в течение 1 ч при 150 об. Промыть пластины пять раз PBST.
5. Развести гомогенатах мозга (разведение 1: 100 в 20% гомогенатах, 1:50 из 10% гомогената и 1:25 из 5% гомогенатах в PBST BSA 1%), и добавить 100 мкл в каждую лунку. Тогда инкубировать в течение 2 часов при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Промыть пластины пять раз PBST.
6. Добавить различные антитела обнаружения & alpha; S в PBST с 1% BSA в разведениях, указанных в Списке материалов. Инкубировать в течение 1 ч при 150 об. Промыть пластины пять раз PBST.
7. Добавить либо анти-mouse или анти-IgG кролика HRP конъюгаты разбавляли 1: 8000 в PBST с добавлением 1% BSA в течение 1 ч при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Промыть пластины пять раз PBST.
8. Добавить 100 мкл 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин раствора (TMB) в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин в темноте при встряхивании при 150 оборотах в минуту.
9. Остановить реакцию, добавив 100 мкл 1 N HCl на лунку затем измерить оптическую плотность при 450 нм с микропланшетного.
10. Для анализа данных, вычесть значение ОП, полученное в хорошо со всеми реагентами, за исключением каких-либо образцов мозга мыши (а) заготовки из значений оптической плотности, измеренных для каждого из анализируемых образцов.

5. Картирование эпитопов

1. Выполнение картирование эпитопов в соответствии с методом, описанным Osman ^16. Вкратце, местная пептиды человеческой последовательности α-синуклеина, содержащего 12 аминокислот на нитроцеллюлозу с 10 перекрывающихся аминокислот.
2. Блок 50 мМ Трис / 150 мМ NaCl буфером с рН 10, содержащим 0,05% Tween 20 и 5% обезжиренное молоко. Инкубируйте антитела в блокирующем растворе при концентрации 2 мкг антитела на мл при 2-10 ° CO / N.
3. Промыть мембраны три раза с помощью 50 мМ Трис / 150 мМ NaCl, рН-буфер 10, содержащим 0,05% Твин 20. инкубировать с козьим антителом против мышиного IgG HRP конъюгата. Вымойте мембраны еще пять раз, используя тот же буфер, то пятно, используя вестерн-блот ТМВ окрашивания комплект.

6. Статистический анализ

1. Используйте R программного обеспечения и nlme пакет для выполнения смешанных эффектов регрессии для моделирования ОП. Для каждого сравнения, выполнять смешанную модель эффект регрессии. Используйте фиксированный эффект отличить от бессимптомных симптоматическое групп.
2. Использование случайный эффект с учетом изменчивости повторений для заданного мыши. Проверьте гомоскедастичность путем изучения остатков и при необходимости использовать функции дисперсии моделировать структуру дисперсия внутри группы ошибок в соответствии с Пинейро и Бейтс ¹7. Установите 0,05 как значимости пороге P.

Результаты

В этом исследовании, ИФА, используемые конкретно определены, ассоциированных с заболеваниями alpha; S (& alpha; S ^D) в гомогенатах мозга, полученных в буфер с высоким содержанием соли от больных мышей M83. Использование антитела специфически распознавать pSer129 & alpha; S (р = 0,0074), ИФА легко от...

Обсуждение

Использование ELISA был продемонстрирован в частности, обнаружить & alpha; S ^D непосредственно из гомогенатов мозга мыши в течение заболевания в модели трансгенной мыши M83. В самом деле, это ИФА может легко отличить больные M83 мышей от здоровых мышей M83, используя только целые гомогена?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290