Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine

Résumé

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated α-synuclein (αS^D) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated αS form or the C-terminal part of the protein.

Résumé

En plus des méthodes établies comme Western blot, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour quantifier rapidement et facilement associé à une maladie α-synucléine (aS ^D) dans des modèles expérimentaux de synucléopathies. Une lignée de souris transgéniques (M83) sur-exprimant les aS de A53T humaines et développer spontanément un phénotype clinique dramatique entre huit et 22 mois d'âge, caractérisées par des symptômes tels que la perte de poids, une prostration, et sévère déficience motrice, a été utilisé dans cette étude. Pour les analyses moléculaires de aS ^D (aS associée à la maladie) chez ces souris, un test ELISA a été conçu pour quantifier spécifiquement aS ^D chez des souris malades. L'analyse du système nerveux central dans ce modèle de souris a montré la présence de ^D aS principalement dans les régions du cerveau et caudale de la moelle épinière. Il n'y avait pas de différences dans la distribution aS ^D entre différentes conditions expérimentales conduisant à la maladie clinique, à savoir, dans uninoculATED et le vieillissement normalement souris transgéniques et des souris inoculées avec des extraits de cerveau de souris malades. La détection spécifique de aS ^D immunoréactivité en utilisant un anticorps contre Ser129 phosphorylé aS par ELISA essentiellement en corrélation avec celle obtenue par transfert de Western et immunohistochimie. De façon inattendue, des résultats similaires ont été observés avec d'autres anticorps dirigés contre la partie C-terminale de aS. La propagation de aS ^D, suggérant l'implication d'un mécanisme de «prion-like", peut donc être facilement contrôlée et quantifiée dans ce modèle de souris en utilisant une approche ELISA.

Introduction

Most current methods for detecting disease-associated α-synuclein (αS^D) in experimental models of Parkinson's disease (PD), such as immunohistochemistry or Western blot, are time-consuming and not quantitative. This neurodegenerative disease is characterized by alpha-synuclein aggregation mainly in the form of inclusions containing an aggregated form of the normally soluble presynaptic protein αS^1,2 (Lewy bodies and Lewy neurites). Normally only marginally phosphorylated, αS is hyperphosphorylated at its serine 129 residue in these inclusions³ and can be monitored by antibodies specifically directed against Ser129 phosphorylated αS, thus providing a reliable marker of the pathology.

Recent research suggests that a “prion-like” mechanism could be involved in the propagation of αS aggregation within the nervous system of an affected patient^4,5. These studies reported the acceleration of a synucleinopathy by inoculating brain extracts containing αS^D into a transgenic mouse model (M83) expressing an A53T mutated human αS protein associated with a severe motor impairment occurring as the mice age⁶. In the same manner, intra-cerebral inoculation of aggregated recombinant αS in the same M83 mouse model confirmed the acceleration of aggregation⁵. The induction of deposits of phosphorylated αS has also been reported after inoculation of C57Bl/6 wild-type mice with either fibrillar recombinant αS or brain extracts from human DLB patients^7,8. Sacino et al.⁹ recently pointed out that after injection of fibrillar human αS, a widespread and progressive cerebral αS inclusion formation could be induced in M83 mice, but not in E46K transgenic mice or non-transgenic mice in which induced αS inclusions were transient, and mainly restricted to the site of injection. Recent studies on monkeys confirmed propagation of αS aggregates after inoculation of PD-derived extracts in species closer to humans¹⁰.

The link between αS alterations and Parkinson’s disease suggest that αS^D is a potential biomarker for Parkinson’s disease¹¹. A recent study showed the detection of oligomeric soluble aggregates of α-synuclein in human cerebro-spinal fluid (CSF) and plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease based on a conventional sandwich system ELISA using the same antibody to capture and detect αS¹². Based on the same method, multimeric proteins were recognized in biological samples, including the brain, because there are multiple copies of epitopes present in the assembled forms¹³. Very recently, pathological αS in the CSF of patients with a proven Lewy body pathology was detected using both an ELISA kit with a highly specific antibody against αS^D (5G4) and an immunoprecipitation assay¹⁴. These methods could differentiate patients with PD/DLB from other types of dementia.

The “prion-like” propagation of αS aggregation was further studied in transgenic mouse model M83 using an ELISA approach that was designed to specifically identify αS^D15. In this study, we report the detailed ELISA protocol used to quantitatively detect αS^D in sick mice (whether or not inoculated with αS^D from sick M83 mice) and more especially in the brain regions specifically targeted by the pathological process in this M83 transgenic mouse model⁴.

Protocole

Toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux ont été conformément à la directive CE 86/609 / CEE du Conseil et ratifiée par Cometh, le comité national français pour l'examen de l'éthique dans l'expérimentation animale (protocole 11-0043). Les animaux ont été logés et soignés dans l'Anses approuvé d'installations expérimentales à Lyon (approbation B 69387 0801).

1. Préparation des souris

1. Euthanasier souris par une injection intraperitoneale de dose létale de pentobarbital de sodium.
2. Récupérer l'ensemble du cerveau de crâne de la souris et le placer dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm sur la glace jusqu'à l'extraction.
3. Extraire la moelle épinière cervicale.
   REMARQUE: aS d'extrait soit à partir de l'une des moitiés du cerveau après sectionnement sagittal ou de cerveaux de souris disséquées, disponible après les expériences énumérées dans le tableau 1.

Experiment	Souris Inoculum (cerveau équivalent)	Période de survie (Dpi)	Median / survie maximale (vieux jours)	aS détection de d par ELISA / WB / IHC
1	Souris inoculées	441 ± 166	419/736	8/8
2	Souris inoculées (0,2 mg)	150 ± 52	140/241	9/9

Tableau 1. Liste des expériences réalisées sur des souris M83. Les inoculations ont été réalisées à 6 semaines pour l'expérience 2 dans la zone de striato-corticale avec 20 ul d'un homogénat de cerveau de souris malade (1% poids / volume dans du glucose 5%), à la suite anesthésie de six semaines vieilles souris M83 homozygotes de 3% inhalation isoflurane. dpi: jours après inoculation.

2. aS Extraction de Brain moitiés

1. Sagittalement coupé le cerveau pour obtenir deux moitiés. Peser chaque moitié dans un tube contenant ribolysis boulets de broyage.
2. Préparer High Salt (HS) un tampon contenant 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% phosphatase et inhibiteurs de protéase cocktails. Ajouter tampon sel élevée aux moitiés du cerveau pour obtenir 20% (poids / volume) homogénats.
3. Préparer les échantillons provenant des moitiés du cerveau à l'aide d'un homogénéiseur mécanique à 6,0 m / s pendant 23 sec deux fois. Après la première homogénéisation de 23 sec, placer les tubes contenant les homogénats sur de la glace pendant 2 minutes avant le second cycle de 23 sec.
4. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 5 min pour éliminer les fragments de cerveau non broyées. Récupérer les surnageants, diviser en 200 aliquotes et les conserver à -80 ° C pour analyse ultérieure ELISA.

3. aS Extraction de disséqués régions cérébrales

1. Disséquer unensemble du cerveau dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm sur la glace avec une loupe de faible puissance (8X grossissement) en utilisant deux forcipes dont les extrémités sont maintenues ensemble sauf lorsque disséquer l'hippocampe. Ne pas dépasser 10 min pour préserver l'intégrité du cerveau. Placez le côté droit du cerveau et récupérer les régions du cerveau suivants dans cet ordre:
   1. Séparé des deux bulbes olfactifs aide de pinces placées juste derrière l'ampoule. Détacher du cerveau par un mouvement vers le bas. Répétez cette opération pour la deuxième ampoule.
   2. Caler doucement la pince entre les deux cortex et le déplacer vers l'avant pour faciliter la dissociation des deux cortex. Garder le cerveau en place avec une pince, utiliser un autre pour séparer le cortex de l'hippocampe.
   3. Placez la pince 2 mm en dessous du cortex. Maintenir une légère pression sur la pince jusqu'à ce que le haut de l'hippocampe est visible. Décoller la première partie du cortex, et répéter avec la deuxième partie. Utilisez la pince pour séparer les deux cortexà partir de l'hippocampe et le déplacement vers l'avant du cerveau.
   4. Placez la pince ouverte autour de l'un des hippocampes. Fermez la pince au bas de l'hippocampe, puis retirez-le délicatement, récupérer autant que possible. Répétez la procédure pour la deuxième hippocampe.
   5. Positionner les pinces ouvertes en dessous de la striata une douceur et le séparer du cerveau. Utilisez la pince pour enlever tout le cortex restant dans le striatum. Répétez cette procédure pour le deuxième striatum.
   6. Utiliser la pince pour abaisser doucement par 2 mm le contour du cervelet pour faciliter la séparation du cervelet de cerveau. Placez la pince juste derrière le cervelet et le retirer en déplaçant la pince avant.
   7. Utilisez la partie large de la pince à élever le mésencéphale afin de voir clairement où il rejoint le tronc cérébral. Faire une incision verticale à la jonction puis retirez le tronc cérébral.
   8. Placez la pince derrière le mésencéphale, qui is composé de quatre structures arrondies. Inciser verticalement jusqu'à ce que le mésencéphale a été complètement séparé du cerveau restant.
2. Préparation des homogénats de variable% (poids / volume) dans du tampon HS, en fonction de la quantité de tissus disponibles, à savoir, 5% d'homogénat pour un poids compris entre 10 et 30 mg, 10% pour un poids compris entre 30 et 80 mg, et 20% pour un poids de plus de 80 mg.
   1. Ajouter un volume suffisant de tampon HS aux régions du cerveau disséqués pour obtenir le% d'homogénat attendu.
   2. Vortex et vérifier que les tissus sont totalement immergés dans la mémoire tampon de HS.
   3. Homogénéiser les échantillons préparés à partir des régions du cerveau disséqués ou la moelle épinière cervicale avec un broyeur de tissu composée d'un tube en verre de borosilicate et deux pilons, A et B.
   4. Pour chaque région du cerveau d'être écrasé directement dans le tube. Un pilon insérer dans le tube et rétracter. Répétez ce mouvement une dizaine de fois pour dissocier le tissu. Ensuite, utilisez un pilon B à Continuer en broyant le tissu avec 20 autres mouvements. Transférer les homogénats dans un tube de 1,5 ml avec une pipette de transfert de 1 ml.
3. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer tous les fragments de cerveau non broyées. Récupérer les surnageants, les diviser dans 200 aliquotes et les conserver à -80 ° C pour analyse ultérieure ELISA.

4. Détection par ELISA de aS

1. Diluer les anticorps de revêtement à 0,01 ng / ml. Utilisez soit anti-aS polyclonaux de lapin ou de l'anticorps monoclonal clone 42 mM Na ₂ CO ₃ / tampon _NaHCO3 50 (pH 9,6).
2. Enduire le microplaques de 96 puits avec 100 pi par puits de cette solution de revêtement, et laisser à 4 ° CO / N. Utilisation de l'anticorps polyclonal de lapin anti-aS dans la solution de revêtement pour ELISA en utilisant des anticorps de détection syn514, clone 42, LB509, AS11, 4D6 ou 8A5. Utilisez la aS monoclonal anti-clone 42 d'anticorps en tant que solution de revêtementen combinaison avec l'anticorps de détection de l'anti-pSer129.
   NOTE: Si nécessaire, les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant une semaine avant le test ELISA est effectuée.
3. Utiliser un laveur de plaques pour laver les plaques cinq fois avec 300 ul de solution saline tamponnée au phosphate avec 0,05% de Tween 20 (PBST) par puits. De cette étape en avant, l'incubation est à température ambiante.
4. Ajouter 200 pi de T20 tampon PBS par puits de blocage. Agiter pendant 1 heure à 150 tours par minute. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
5. Diluer les homogénats de cerveau (dilution de 1: 100 des 20% homogénats, 01:50 10% des broyats et 01h25 des broyats de 5% dans PBST BSA 1%), et ajouter 100 ul à chaque puits. Puis incuber pendant 2 heures tout en agitant à 150 tpm. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
6. Ajouter les différents anticorps de détection aS en PBS avec de la BSA 1% aux dilutions mentionnées dans la liste des matériaux. Incuber pendant 1 heure à 150 tours par minute. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
7. Ajouter soit anti--mouse ou anti-lapin conjugués IgG HRP dilué à 1: 8000 dans du PBST complété avec de la BSA 1% pendant 1 heure en agitant à 150 tpm. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
8. Ajouter 100 pi de 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) à chaque puits et incuber pendant 15 min dans l'obscurité tout en agitant à 150 tpm.
9. Arrêter la réaction en ajoutant 100 pi de HCl 1 N par puits puis mesurer l'absorbance à 450 nm avec le lecteur de microplaques.
10. Pour l'analyse des données, il faut soustraire la valeur de DO obtenue dans un puits avec tous les réactifs à l'exception des échantillons de cerveau de la souris (de puits vierge) à partir des valeurs de DO mesurées pour chacun des échantillons analysés.

5. Epitope Mapping

1. Effectuer la cartographie d'épitopes selon la méthode décrite par Osman ^16. En bref, les peptides spot de la séquence α-synucléine humaine contenant 12 acides aminés sur nitrocellulose avec 10 acides aminés qui se chevauchent.
2. Bloc avec Tris 50 mM / NaCl 150 mM tampon à pH 10 contenant 0,05% de Tween 20 et 5% de lait en poudre. Incuber l'anticorps dans une solution de blocage à une concentration de 2 ug d'anticorps par ml à 2-10 ° CO / N.
3. Laver la membrane trois fois avec du Tris 50 mM / NaCl 150 mM tampon pH 10 contenant 0,05% de Tween 20. Incuber avec l'anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à HRP. Laver la membrane cinq fois en utilisant le même tampon puis tache en utilisant un kit de coloration blot TMB occidentale.

6. Analyse statistique

1. Utilisez le logiciel de R et nlme pour effectuer des régressions à effets mixtes pour modéliser OD. Pour chaque comparaison, effectuez un modèle d'effet de régression mixte. Utilisez un effet fixe de distinguer symptomatique des groupes asymptomatiques.
2. Utilisez un effet aléatoire pour refléter la variabilité des répétitions pour une souris donnée. Vérifiez homoscédasticité en examinant les résidus et, si nécessaire, utiliser les fonctions de la variance pour modéliser la structure de variance des erreurs au sein des groupes en accord avec Pinheiro et Bates ¹7. Réglez 0,05 comme seuil de signification de P.

Résultats

Dans cette étude, les tests ELISA utilisés spécifiquement identifiés aS associées à des maladies (aS ^D) dans des homogénats de cerveau préparés dans un tampon de sel élevée de souris M83 malades. En utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement pSer129 aS (p = 0,0074), l'ELISA distingue facilement vieux, souris malades (> 8 mois) à partir de jeunes (2-5 mois), les souris M83 sains (Figure 1). Plusieurs autres anticorps ont montré des signaux aussi élevés (> 0,6...

Discussion

L'utilisation d'un test ELISA a été démontrée pour détecter spécifiquement aS ^D directement à partir d'homogénats de cerveau de souris au cours de la maladie dans le modèle de souris transgénique M83. En effet, cet ELISA pouvait facilement distinguer les souris malades de souris M83 M83 sains en utilisant des homogénats de cerveau ne entiers dans un tampon de sel élevée.

Les étapes les plus critiques pour de bons résultats à l'aide de cet ELISA sont...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			Adjust at pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10x concentrated
TMB	Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	Used for epitope mapping
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	keep on ice at this step
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X magnification
Forceps Dumont#7	WPI	14097	For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290