Enriquecimiento de la célula automatizada de citomegalovirus células T específicas para aplicaciones clínicas utilizando el Sistema de citoquinas de captura

Resumen

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Resumen

La transferencia adoptiva de células T de patógenos específicos se puede utilizar para prevenir y tratar las infecciones oportunistas como citomegalovirus (CMV), la infección se producen después de un trasplante hematopoyético alogénico de células madre. Las células T-virales específicos de donantes alogénicos, incluidos los donantes de terceros, se pueden propagar ex vivo en el cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), que emplean a rondas repetidas de estimulación antígeno impulsado para propagar selectivamente las células T deseados. La identificación y aislamiento de células T específicas de antígeno también pueden llevarse a cabo basándose en el sistema de captura de citoquinas de las células T que han sido activadas para secretar interferón gamma (IFN-γ). Sin embargo, la aplicación humano generalizado del sistema de captura de citoquinas (CCS) para ayudar a restaurar la inmunidad ha sido limitado como el proceso de producción es mucho tiempo y requiere un operador experto. El desarrollo de un dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación, como CliniMACs Prodigy ahorapermite a los investigadores a generar células T-virales específicos utilizando un sistema automatizado menos, mano de obra intensiva. Este dispositivo separa magnéticamente etiquetados células a partir de células no marcadas que utilizan la tecnología de células activadas por la clasificación magnética para generar productos clínica de grado, se ha diseñado como un sistema cerrado y se puede acceder y operar en la mesa de trabajo. Se demuestra el funcionamiento de este nuevo dispositivo de enriquecimiento de células automatizado para la fabricación de células T-pp65 de CMV específica obtenidas a partir de un producto de aféresis de estado estacionario obtenida de un donante seropositivo CMV. Estas células T aisladas pueden ser infundidas directamente en un paciente bajo supervisión reglamentaria institucional y federal. Todos los pasos de procesamiento de bio incluyendo la eliminación de las células rojas de la sangre, la estimulación de las células T, la separación de las células T específicas de antígeno, purificación y lavado están completamente automatizados. Los dispositivos tales como esta plantean la posibilidad de que las células T para aplicación humana pueden ser fabricados fuera de las buenas prácticas de fabricación dedicada (GMP) Las instalaciones y en su lugar se produzcan en instalaciones bancarias de sangre donde el personal puede supervisar protocolos automatizados para producir varios productos.

Introducción

Trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) ¹ se puede combinar con la terapia adoptiva de células T para mejorar el efecto injerto contra tumor y para proporcionar inmunidad frente a infecciones oportunistas ^2. Generación de células T derivadas del donante de antígenos específicos para perfusión ha requerido históricamente personal calificado y uso de instalaciones especializadas que son GMP. La entrega de tales células T ha dado como resultado en la resolución de infecciones oportunistas ^3, así como el tratamiento de la neoplasia maligna subyacente ^4. Recientemente, los investigadores han demostrado que la transferencia adoptiva de tan sólo unos pocos miles de células T específicas del virus (~ 1 x 10 ^{4 a 2,5} x 10 ⁵ células / kg destinatario de peso corporal) puede tratar con éxito las infecciones por CMV oportunistas después de TCMH alogénico ^5-9. Un número limitado de instalaciones GMP con los requisitos de fabricación expertos asociados y el alto costo asociado con la producción de células tiene, sin embargo, restracceso de los pacientes igido de terapias prometedoras de células T ^10. Un enfoque para el aislamiento de células T específicas de antígeno se basa en los CCS utilizando un reactivo bi-específico para reconocer CD45 y IFN-γ. Como se muestra, esta metodología se puede utilizar para generar células T específicos de CMV clínico grado que emplean un dispositivo de CCS enriquecimiento de células automatizado (Figura 1B).

Las células T-CMV específicos se generan mediante la incubación de péptidos solapantes de antígeno pp65 de CMV con células leukapheresis totales nucleares (CNC) de donantes CMV-seropositivos. Estos péptidos, que se muestran en el contexto de antígeno leucocitario humano (HLA), activan las células T-pp65 de CMV específica dentro de la TNC para secretar IFN-γ. Estas células T pueden ser "capturados" y magnéticamente separados. El funcionamiento del dispositivo de enriquecimiento de células de primera generación (Figura 1A) requiere personal especializado en el cultivo de células bajo condiciones GMP, y la coordinación de personal para llevar a cabo las múltiples sPTE necesarias para generar un producto "capturado".

El procedimiento normalmente requiere de 10 a 12 horas de funcionamiento continuo, y por lo tanto el personal probablemente necesitan trabajar más de dos turnos en las instalaciones de GMP. Estas limitaciones están ahora obvian por la aplicación de un dispositivo de segunda generación (mostrado en la Figura 1B). Este dispositivo se compromete enriquecimiento magnética, similar al dispositivo de primera generación, pero automatiza otros aspectos de la CCS en un enfoque unbreached. Esto reduce significativamente la carga sobre el equipo de GMP ya que la mayoría de los pasos se puede lograr sin supervisión por parte del personal. Además, puesto que el dispositivo funciona como un sistema cerrado, las células T específicas de antígeno pueden ser capturadas y procesadas en la mesa de trabajo, excepto las etapas implicadas en el aislamiento leucoféresis y preparación de materiales antes de iniciar el instrumento. Los detalles de la instrumentación completa y la funcionalidad de este dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación han sido pubcido ^11.

A continuación, describimos los pasos para enriquecer las células T-pp65 de CMV específica de un producto de aféresis en estado estacionario utilizando el sistema CCS enriquecimiento de células automatizado. Una vez aislado, estas células T específicos de CMV se pueden infundir inmediatamente en un paciente.

Protocolo

1. Preparación de los materiales bajo condiciones estériles (ver Materiales y Equipos Tabla)

1. Preparar 3 L de tampón de PBS / EDTA suplementado con albúmina de suero humano (HSA) a una concentración final de 0,5% (w / v).
2. Preparar 1 L bolsa de solución de cloruro sódico de grado clínico 0,9% (NaCl) y 2 L de medio de cultivo celular GMP grado.
3. Preparar 60 nmol de CMV específica cóctel de antígeno peptídico mediante la reconstitución de un vial de CMV pp65 con 8 ml de agua estéril.
4. Traslado pp65 de CMV cóctel de péptidos en una bolsa de congelación volumen de 50 ml usando un / a Spike interconector Luer y sujetar con pinzas de bloqueo para evitar la posterior distribución de cóctel en el conjunto de tubos. Célula abierta conjunto de tubos de enriquecimiento (TS 500) en condiciones estériles.
5. El uso de soldador tubo estéril, conecte bolsa de congelación cóctel péptido en la conexión del tubo de la válvula 2 de conjunto de tubos TS 500. No abra la pinza bolsa de cóctel de péptidos en este momento.
6. Eliminar 1 x 10 ^{9 T}NC del producto de partida celular y suspender en tampón PBS / EDTA que contiene 2,5% de HSA a un volumen total de 50 ml. Inyectar el producto celular en una bolsa de transferencia de 150 ml.

2. Preparación y Uso de Automated Cell Sistema de Enriquecimiento (Ver Materiales y Equipos Tabla)

1. Encienda el sistema de enriquecimiento de células (Figura 1B) y seleccione el programa "CCS_IFN-γ enriquecimiento". Observar una interfaz de usuario que muestra pantallas con instrucciones y las imágenes que guían al operador a través del procedimiento.
2. Introduzca el parámetro "Operador" y "Tubing Set P / N No". A continuación, instale el dispositivo Tubing Set 500 con el enriquecimiento de células automatizado según las instrucciones que aparecen en la pantalla del monitor interactivo.
3. Siga las instrucciones paso a paso que aparecen en la pantalla para conectar el medio y tampones en el dispositivo. Número de catálogo de registros y número de lote de los reactivos antes connecting al instrumento.
4. Después de la revisión final del conjunto de tubos, abra la abrazadera de la bolsa de cóctel de péptidos. Abra la bolsa de medio e iniciar el cebado automático del conjunto de tubos.
5. Después de que se complete la etapa de imprimación, complementar HSA (2,5%) en tampón de NaCl en la bolsa de depósito (200 ml) con la ayuda de la soldadora tubo estéril. Transferir el producto celular de partida en la "bolsa de Aplicación" usando el soldador tubo estéril.
6. Conecte CCS (IFN) los reactivos en un tubo respectivo a través de adaptadores. Introduzca el tiempo preferido para recoger una fracción de material celular antes del proceso de enriquecimiento. Revisar y verificar la veracidad de todos los datos / parámetros introducidos. Iniciar el proceso.
7. Antes del inicio del proceso de enriquecimiento de células automatizado, quite el control de calidad Bolsa (QCB, fracción original (ori) contiene aproximadamente 1,3 ml de cada 100 ml de contenido cámara diluida con tampón / EDTA PBS). Sellar el Banco Central de Qatar, pesar, y se almacena a 4 ° C.
8. Inicie el enrichmeproceso nt. Al final del proceso, las células diana se eluyeron con un volumen aproximado de tampón de elución de la bolsa de depósito.
9. Selle la no Target Cell Bolsa (NTCB, fracción negativa = neg) y Bolsa de la célula diana (TCB, positivo fracción = pos) y pesar cada bolsa. Los pesos serán utilizados más tarde para el cálculo de los números de células.
10. Inmediatamente después del procedimiento de enriquecimiento de recoger dos alícuotas por fracción para citometría de flujo análisis, y almacenar el resto de las muestras a 4 ° C. Utilice una alícuota de la muestra para la determinación del recuento de células y la otra alícuota de la muestra para el análisis de rendimiento de enriquecimiento (Tabla 1).
11. Retire el tubo del equipo del instrumento de enriquecimiento celular. Transferir el archivo de registro en una unidad USB para su uso futuro.
    NOTA: Todos los reactivos deben ser preparadas en condiciones estériles. Es muy recomendable el uso de una campana de bioseguridad de tipo II. Utilice producto celular aféresis de estado estacionario (no movilizaron) aislado a partir de una sanaCMV-seropositivos donantes para enriquecer las células T específicas de antígeno CMV. Sólo FDA licencia HSA se debe utilizar. El tampón para la preparación de células debe mantenerse a 19 ° C a 25 ° C como temperaturas ambiente bajas o más altas darán como resultado la pureza reducida y un rendimiento reducido de las células diana.

3. Cell Count Determinación

1. Tome las alícuotas de QCB, NTCB y TCB para los recuentos de células como se muestra en la Tabla 1. Añadir CD45-VoBlue a cada alícuota (título 1:11) y se incuba en la oscuridad durante 10 min a 4 ° C.
2. Añadir 1,5 ml de solución de lisis de glóbulos rojos recién preparado (1x) a la fracción original y la fracción negativa, 450 l recién preparada sangre roja solución de lisis de células a la fracción positiva, e incubar todas las fracciones durante 15 min a RT.
3. Justo antes del análisis, añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1 mg / ml (1: 100 dilución de 100 g / ml). Utilice contador celular automático para determinar el recuento de células y vihabilidad. Utilice dispositivo contador de células software recomendado para citometría de flujo análisis. Determinar los recuentos absolutos de leucocitos para las fracciones originales, negativos y positivos.
   NOTA: El recuento de células de leucocitos viables por ml de las muestras tomadas para el análisis de recuento de células se determina utilizando el software recomendado analizador de células.
4. Establecer la región como se muestra en la figura 2 (región 5, los leucocitos viables). Utilice la siguiente estrategia de compuerta para determinar el recuento de células. A leucocitos viable en la fracción original se muestra en la Figura 2.
5. Las regiones indicadas (Figura 2, 1-6) son jerárquicamente como sigue:
   1: Tiempo de puerta → 2: las células individuales → 3: ^CD45 + células → 4: leucocitos (residuos no incluidos) → 5: leucocitos viables → 6: linfocitos viables
6. Repita los mismos pasos para determinar el recuento de células de fracciones positivas y negativas. Calcular el recuento de células de toda la fracciónteniendo en cuenta el factor de diluyente de la muestra y el volumen total de la fracción (Tabla 2).

4. Examen del Rendimiento Separación

1. Lávese las alícuotas de QCB, NTCB y las células de la fracción TCB con pre-enfriado tampón PBS / EDTA / 0,5% de suero AB. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
2. Resuspender las células en 100 l mezcla de tinción de anticuerpos fluorocromo que contiene: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue y anti-IFN-PE (título 1:11) y incubar en la oscuridad durante 10 min a 4 ° C.
3. Añadir 1 ml de solución de lisis de glóbulos rojos recién preparado (1x) y se incuba durante 15 min a TA. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en un volumen adecuado de PBS / EDTA Buffer / 0,5% de suero AB.
4. Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1 mg / ml Apenas antes del análisis (1: 100 dilutien de 100 g / ml). Realizar análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza de la muestra.
5. Utilice la siguiente estrategia gating para calcular las células T CD3 ⁺ en la estrategia de apertura de puerta de leucocitos viable para la determinación de las células T CD3 ⁺ se muestra en la fracción positiva después de proceso de enriquecimiento CCS. Las regiones indicadas (Figura 3A y 3B, 1-6) están vinculados jerárquicamente de la siguiente manera:
   1: Tiempo de compuerta → 2: las células individuales → 3: ^CD45 + células → 4: Células (residuos no incluidos) → 5: leucocitos viables → 6: Las células viables ^CD3 + población
6. Determinar las frecuencias de CD4 +, CD8 +, CD4 + células T después de proceso de enriquecimiento CCS (Tabla 2) IFN-γ ^{+ y} CD8 + IFN-γ ^+.
7. Utilizar la estrategia gating para determinar las frecuencias de CD4 ^+, CD8 ^+, CD4 ⁺ IFN-γ ^{+ y} CD8 ⁺ células T IFN-γ ⁺ f se muestran a continuacióno un (capturado) fracción positiva original y enriquecido después del proceso de CCS. Las regiones indicadas son jerárquicamente vinculados y nombrados de la siguiente manera:
   1: Tiempo de compuerta → 2: las células individuales → 3: ^CD45 + células → 4: Células (residuos no incluidos) → 5: Los leucocitos viables → 6: Las células viables ^CD3 + → 7: CD4 ⁺ células → 7a: CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ células (caja) → 8: CD8 ⁺ células → 8a: células CD8 ⁺ IFN-gamma ⁺ (caja)

NOTA: Los primeros 6 regiones indicadas de los enlaces de jerarquía son los mismos que en la Figura 3, (1-6) y el último 2 regiones se muestran en la Figura 4 (6-8a).

Resultados

En este estudio, se utilizó una célula automatizado enriquecimiento Sistema CCS para la producción automatizada de las células T-pp65 de CMV específica. Las células T-CMV específicos fueron enriquecidos a partir de tres productos de células de aféresis. El producto de aféresis en estado estacionario se cosechó más de 2 horas de un donante CMV-seropositivos y generó 10 ¹⁰ células nucleares totales (CNC). 10 ⁹ TNC se activa entonces con péptidos derivados de pp65 de CMV (60 nmol) duran...

Discusión

Terapia adoptiva de células T ha surgido como una opción viable para el tratamiento de neoplasias malignas de células B ^4. Su potencial terapéutico depende de la infusión el número deseado de células T específicas de antígeno diana que carecen de la senescencia replicativa ^2. Esto se puede lograr mediante la clasificación de una población pura de células T específicas de antígeno de las células T expandidas de acuerdo con buenas prácticas de fabricación actuales. Dos procedimientos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-182
5 L waste bag	Miltenyi Biotec GmbH	110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)	Miltenyi Biotec GmbH	279-01
Albumin (Human) 25%	Grifols	58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)	Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-109
Water for injections	Hospira, inc, Lake Forest, IL	NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm	Millipore	SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec GmbH	200-074-400
60 ml Syringes, sterile	BD, Laagstraat, Temse, Belgium	309653
CMV sero positive apheresis product	Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials	Manufacturer	Catalog number
AB Serum, GemCell	Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA	100-512
CD3-FITC	Miltenyi Biotec GmbH	130-080-401
CD4-APC	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-033
CD8-APC-Vio770	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-065
CD14-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-072
CD20-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-077
CD45-VioBlue	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-136
aIFN-γ-PE, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-940
CD3-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml)	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-233
Equipment	Manufacturer	Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device	Miltenyi Biotec GmbH	200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec GmbH	130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R	Eppendorf AG	22331
Cellometer K2	Nexelom Bioscience, Lawrence, MA	LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB	Terumo Medical Corp., Elkton, MA	7811