Cellules T d'enrichissement de cellules automatisé de cytomégalovirus spécifique pour des applications cliniques utilisant le système de capture de cytokine

Résumé

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Résumé

Le transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de l'agent pathogène peut être utilisé pour prévenir et traiter les infections opportunistes telles que le cytomégalovirus (CMV) survenant après allogéniques hématopoïétiques transplantation de cellules souches. Cellules T virales spécifiques de donneurs allogéniques, y compris les bailleurs de fonds tiers, peuvent être propagés ex vivo en conformité avec les bonnes pratiques de fabrication (cGMP), employant des cycles répétés de stimulation conduit antigène pour propager sélectivement les cellules T souhaités. L'identification et l'isolement des cellules T spécifiques de l'antigène peuvent également être effectuées sur la base du système de capture de cytokine des cellules T qui ont été activées pour sécréter de l'interféron-gamma (IFN-γ). Cependant, l'application humaine généralisée du système cytokine de capture (CCS) pour aider à rétablir l'immunité a été limitée que le processus de production prend du temps et nécessite un opérateur qualifié. Le développement d'un dispositif d'enrichissement cellulaire de deuxième génération tels que CliniMACS Prodigy maintenantpermet aux enquêteurs de générer des cellules T-viraux spécifiques en utilisant un système de main-d'œuvre moins automatisé. Ce dispositif sépare magnétiquement marqué cellules de cellules non marquées à l'aide de la technologie de tri activé magnétique de cellules pour générer des produits de qualité clinique, est conçu comme un système fermé et peut être consulté et utilisé sur la paillasse. Nous démontrons le fonctionnement de ce nouveau dispositif d'enrichissement de cellules automatisé pour la fabrication de cellules T spécifiques de pp65 CMV obtenus à partir d'un produit d'aphérèse l'état d'équilibre obtenu à partir d'un donneur séropositif CMV. Ces cellules T isolées peuvent ensuite être directement perfusé à un patient sous la supervision réglementaire et institutionnel fédéral. Toutes les étapes de traitement, y compris la bio-élimination des cellules rouges du sang, la stimulation des cellules T, la séparation des cellules T spécifiques de l'antigène, la purification et le lavage sont entièrement automatisés. Les dispositifs tels que ce soulèvent la possibilité que les cellules T pour application humaine peuvent être fabriqués à l'extérieur de bonnes pratiques de fabrication dédié (GMP) Et des installations au lieu être obtenus dans des installations bancaires de sang où le personnel peut superviser les protocoles automatisés pour produire des produits multiples.

Introduction

Hématopoïétiques transplantation de cellules souches (HSCT) ¹ peut être combiné avec la thérapie des cellules T adoptive pour améliorer l'effet du greffon contre la tumeur et de fournir l'immunité aux infections opportunistes ^2. Génération de cellules T donateurs dérivés spécifiques de l'antigène pour perfusion a historiquement nécessaire du personnel et l'utilisation des installations spécialisées qui sont conformes aux BPF qualifiés. La livraison de ces cellules T a abouti à la résolution des infections opportunistes ³ ​​ainsi que le traitement de la maladie sous-jacente ^4. Récemment, des chercheurs ont démontré que le transfert adoptif de seulement quelques milliers de cellules T spécifiques du virus (~ 1 x 10 ^{4 à 2,5} x 10 ⁵ cellules / kg de poids corporel du receveur) peuvent réussir à traiter les infections à CMV opportunistes après allogéniques HSCT ^5-9. Un nombre limité d'installations GMP aux exigences de fabrication qualifiés associés et le coût élevé associé à la production de cellules a, cependant, restrl'accès des patients à des thérapies prometteuses igés cellules T ^10. Une approche pour isoler des cellules T spécifiques d'antigène est basée sur le CCS en utilisant un réactif bi-spécifique pour reconnaître CD45 et IFN-γ. Comme on le voit, cette méthodologie peut être utilisée pour générer des cellules T spécifiques de CMV de qualité clinique utilisant un dispositif d'enrichissement de cellules automatisé CCS (figure 1B).

Des cellules T spécifiques de CMV sont générés par incubation de peptides chevauchants à partir de l'antigène pp65 de CMV avec des cellules de leucaphérèse totales (TNC) nucléaires provenant de donneurs CMV-séropositif. Ces peptides, affichés dans le contexte de l'antigène de leucocyte humain (HLA), activent les cellules T spécifiques de CMV pp65 au sein du TNC à sécréter IFN-γ. Ces cellules T peuvent alors être "capturés" et séparées magnétiquement. Le fonctionnement du dispositif d'enrichissement de cellules de première génération (figure 1A) requis personnel qualifié dans la culture cellulaire dans des conditions GMP, et la coordination du personnel pour entreprendre les multiples sTeps nécessaire pour générer un produit "capturé".

La procédure généralement requis 10 à 12 h de fonctionnement continu, et donc le personnel probablement besoin de travailler sur deux quarts de travail dans l'établissement GMP. Ces contraintes sont désormais évités par la mise en œuvre d'un dispositif de deuxième génération (le montre la figure 1B). Ce dispositif engage enrichissement magnétique, similaire au premier dispositif de génération, mais automatise les autres aspects de la SCC dans une approche unbreached. Cela réduit considérablement le fardeau de l'équipe GMP que la plupart des étapes peut être accompli sans surveillance par le personnel. En outre, puisque le dispositif fonctionne comme un système fermé, les cellules T spécifiques de l'antigène peuvent être capturées et traitées sur la paillasse à l'exception des étapes impliquées dans l'isolement de leucaphérèse et préparation des matières de départ avant de l'instrument. Détails de l'instrumentation complète et la fonctionnalité de ce dispositif d'enrichissement cellulaire de deuxième génération ont été pubblies ^11.

Ici, nous décrivons les étapes pour enrichir les cellules T spécifiques de pp65 CMV d'un produit d'aphérèse l'état d'équilibre en utilisant le système de CCS d'enrichissement de cellules automatisé. Une fois isolé, ces cellules T spécifiques de CMV peuvent être immédiatement perfusé dans un patient.

Protocole

1. Préparation du matériel dans des conditions stériles (Voir Tableau Matériaux et Équipement)

1. Préparation 3 L de tampon PBS / EDTA additionné de sérum-albumine humaine (HSA) à une concentration finale de 0,5% (p / v).
2. Préparer 1 L sac de classe 0,9% de chlorure de sodium (NaCl) clinique et 2 L de qualité GMP milieu de culture cellulaire.
3. Préparer 60 nmol de CMV spécifiques à l'antigène peptidique cocktail en reconstituant un flacon de CMV pp65 avec 8 ml d'eau stérile.
4. Transfert CMV pp65 peptide cocktail dans un sac de congélation de 50 ml de volume en utilisant un / de Spike interconnexion Luer et serrer avec une pince de verrouillage pour éviter une distribution ultérieure de cocktail dans le jeu de tuyaux. Ouvrir cellule tube enrichissement jeu (TS 500) dans des conditions stériles.
5. Utilisant un tube stérile soudeur, connectez peptide cocktail sac de congélation en connexion de tube pour valve 2 du jeu de tuyaux TS 500. Ne pas ouvrir le sac pince peptide cocktail à cette époque.
6. Retirer 1 x 10 ⁹ TNC à partir de produit de départ et de suspension cellulaire dans du tampon PBS / EDTA contenant 2,5% de HSA à un volume total de 50 ml. Injecter le produit cellulaire dans un sac de transfert de 150 ml.

2. Préparation et utilisation de cellules automatisé Système d'enrichissement (Voir Tableau Matériaux et Équipement)

1. Allumez le système d'enrichissement de cellules (figure 1B) et sélectionnez le programme "CCS_IFN-γ enrichissement". Observez une interface utilisateur montrant des écrans avec des instructions et des photos directeurs l'opérateur à travers la procédure.
2. Entrez le paramètre "Opérateur" et "Tubing Set P / N Non". Ensuite, installez le dispositif Tubing Set 500 à l'enrichissement de cellules automatisé selon les instructions affichées sur l'écran du moniteur interactif.
3. Suivez les instructions étape par étape affichées sur l'écran pour connecter le moyen et les tampons à l'appareil. Numéro de catalogue et le numéro de lot des réactifs avant connecting à l'instrument.
4. Après le contrôle final de l'ensemble de tubes, ouvrir la pince du sac peptide cocktail. Ouvrez le sac moyen et initier amorçage automatique de l'ensemble de tubes.
5. Après l'étape d'amorçage est terminée, compléter HSA (2,5%) dans un tampon de NaCl dans le sac de réservoir (200 ml) à l'aide de la soudeuse tube stérile. Transférer le produit cellulaire à partir dans le "sac de l'application" en utilisant le tube soudeur stérile.
6. Connectez CCS (IFN) réactifs dans les tubes respectifs via des adaptateurs. Entrez le temps préféré pour recueillir une fraction de matériau cellulaire avant que le processus d'enrichissement. Examiner et de vérifier l'exactitude de toutes les données / paramètres entrés. Lancer le processus.
7. Avant le début du processus automatisé d'enrichissement de cellules, enlever le sac Quality Control (BRC, la fraction originale (ori) contient environ 1,3 ml de 100 ml le contenu de la chambre diluée avec un tampon / EDTA PBS). Sceller le BRC, peser et stocker à 4 ° C.
8. Démarrez le enrichmeprocessus nt. A la fin du processus, les cellules cibles sont éluées avec un volume approximatif de tampon d'élution à partir de la poche de réservoir.
9. Sceller la cellule cible Sac non (NTCB, fraction négative = neg) et Sac cellulaire cible (TCB, positif fraction = pos) et peser chaque sac. Les poids seront utilisés ultérieurement pour le calcul des nombres de cellules.
10. Immédiatement après la procédure d'enrichissement recueillir deux aliquotes par fraction de cytométrie de flux, et stocker le reste des échantillons à 4 ° C. Utilisez une aliquote de l'échantillon pour la détermination de la numération cellulaire et l'autre partie aliquote de l'échantillon pour l'analyse des performances de l'enrichissement (tableau 1).
11. Retirer le tube fixé à partir de l'instrument d'enrichissement cellulaire. Transférez le fichier journal sur un lecteur USB pour une utilisation future.
    REMARQUE: Tous les réactifs doivent être préparés dans des conditions stériles. L'utilisation d'une hotte de biosécurité de type II est fortement recommandé. Utilisez aphérèse produit cellulaire à l'état stable (non-mobilisés) isolé à partir d'une bonne santéCMV-séropositif donateurs pour enrichir les cellules T spécifiques de l'antigène CMV. Seulement autorisé par la FDA HSA doit être utilisé. Le tampon pour la préparation de la cellule doit être maintenue à 19 ° C à 25 ° C alors que les températures ambiantes inférieures ou supérieures se traduira par la pureté réduite et un rendement réduit des cellules cibles.

3. Détermination comte cellulaire

1. Prenez les aliquotes de QCB, NTCB et TCB pour la numération des cellules, comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter CD45-VoBlue à chaque aliquote (titre 01h11) et incuber dans l'obscurité pendant 10 min à 4 ° C.
2. Ajouter 1,5 ml de solution de globules rouges de lyse fraîchement préparé (1x) à la fraction initiale et la fraction négative, à 450 ul fraîchement préparé solution de lyse des globules rouges à la fraction positive, et incuber toutes les fractions de 15 min à température ambiante.
3. Juste avant l'analyse, ajouter l'iodure de propidium à une concentration finale de 1 pg / ml (dilution 1: 100 de 100 ug / ml). Utilisez compteur de cellules automatique pour déterminer le nombre de cellules et vicapacité. Utilisez dispositif de compteur de cellules logiciel recommandé pour cytométrie de flux. Déterminer les valeurs absolues de leucocytes pour les fractions originaux, négatifs et positifs.
   NOTE: Le nombre de cellules de leucocytes viables par ml des échantillons prélevés pour l'analyse de numération cellulaire est déterminée en utilisant le logiciel de l'analyseur recommandé cellulaire.
4. Réglez la région comme représenté sur la Figure 2 (région 5, leucocytes viables). Utilisez la stratégie de déclenchement suivant pour déterminer le nombre de cellules. Une fraction de leucocytes viables d'origine est représenté sur la figure 2.
5. Les régions indiquées (figure 2, 6.1) sont hiérarchiquement comme suit:
   1: Temps porte → 2: cellules individuelles → 3: CD45 ⁺ cellules → 4: leucocytes (débris exclu) → 5: leucocytes viables → 6: lymphocytes viables
6. Répétez les mêmes étapes pour déterminer le nombre de cellules pour les fractions positives et négatives. Calculer le nombre de cellules de la fraction ensembleen considérant le facteur de dilution de l'échantillon et le volume total de la fraction (tableau 2).

4. Examen de la performance de séparation

1. Laver les aliquotes de QCB, NTCB et les cellules de la fraction TCB avec / EDTA mémoire tampon de pré-réfrigérés PBS / 0,5% de sérum AB. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
2. Resuspendre les cellules dans le mélange de coloration 100 pi anticorps fluorochrome contenant: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue et anti-IFN-PE (titre 01h11) et incuber dans l'obscurité pendant 10 min à 4 ° C.
3. Ajouter 1 ml de solution de globules rouges de lyse fraîchement préparé (1x) et incuber pendant 15 min à température ambiante. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un volume suffisant de PBS / EDTA / 0,5% de sérum AB.
4. Ajouter l'iodure de propidium à une concentration finale de 1 pg / ml juste avant l'analyse (1: 100 dilutisur 100 ug / ml). Effectuer l'analyse de cytométrie de flux pour évaluer la pureté de l'échantillon.
5. Utilisez la stratégie de déclenchement suivante pour calculer les ^lymphocytes T CD3 + dans la stratégie de vannage de leucocytes viables pour déterminer les ^lymphocytes T CD3 + est montré dans la fraction positive après processus d'enrichissement de CCS. Les régions indiquées (Figure 3A et 3B, 1-6) sont liés hiérarchiquement comme suit:
   1: Temps de porte → 2: cellules individuelles → 3: CD45 ⁺ cellules → 4: Cellules (débris exclu) → 5: leucocytes viables → 6: ^CD3 + cellules viables population
6. Déterminer les fréquences de CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ ⁺ et CD8 + IFN-γ ⁺ cellules T après processus d'enrichissement CCS (tableau 2).
7. Utiliser la stratégie de déclenchement pour déterminer les fréquences de ^cellules CD4 +, CD8 ^+, CD4 ⁺ IFN-γ ^{+ et CD8 +} IFN-γ ⁺ cellules T au-dessous fou un (capturé) fraction positive original et enrichi après le processus de CCS. Les régions indiquées sont hiérarchiquement liés et nommés comme suit:
   1: Temps de porte → 2: cellules individuelles → 3: CD45 ⁺ cellules → 4: Cellules (débris exclu) → 5: leucocytes viables → 6: ^CD3 + cellules viables → 7: ^cellules CD4 + → 7a: CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ cellules (encadré) → 8: ^cellules CD8 + → 8a: ^CD8 + IFN-y ⁺ cellules (encadré)

REMARQUE: Les 6 premières régions des liens hiérarchiques indiqués sont les mêmes que sur la figure 3, (6.1) et des 2 dernières régions sont présentés dans la figure 4 (6-8a).

Résultats

Dans cette étude, une cellule d'enrichissement du système automatisé CCS a été utilisée pour la production automatisée de cellules T spécifiques de pp65 du CMV. Des cellules T spécifiques de CMV ont été enrichies à partir de trois produits d'aphérèse de cellules. Le produit d'aphérèse l'état d'équilibre a été récolté plus de 2 h à partir d'un donneur CMV-séropositif et a généré 10 ¹⁰ cellules nucléaires totales (TNC). 10 ⁹ TNC ont ensuite été ac...

Discussion

La thérapie des cellules T adoptive a émergé comme une option viable pour traiter les tumeurs malignes à cellules B ^4. Son potentiel thérapeutique dépend de l'infusion le nombre désiré de cellules T spécifiques de l'antigène cible sénescence réplicative qui manquent ^deux. Ceci peut être obtenu par le tri d'une population pure de cellules T spécifiques de l'antigène de lymphocytes T expansés en conformité avec les pratiques de fabrication actuelles bons. Deux procéd...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-182
5 L waste bag	Miltenyi Biotec GmbH	110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)	Miltenyi Biotec GmbH	279-01
Albumin (Human) 25%	Grifols	58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)	Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-109
Water for injections	Hospira, inc, Lake Forest, IL	NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm	Millipore	SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec GmbH	200-074-400
60 ml Syringes, sterile	BD, Laagstraat, Temse, Belgium	309653
CMV sero positive apheresis product	Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials	Manufacturer	Catalog number
AB Serum, GemCell	Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA	100-512
CD3-FITC	Miltenyi Biotec GmbH	130-080-401
CD4-APC	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-033
CD8-APC-Vio770	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-065
CD14-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-072
CD20-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-077
CD45-VioBlue	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-136
aIFN-γ-PE, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-940
CD3-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml)	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-233
Equipment	Manufacturer	Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device	Miltenyi Biotec GmbH	200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec GmbH	130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R	Eppendorf AG	22331
Cellometer K2	Nexelom Bioscience, Lawrence, MA	LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB	Terumo Medical Corp., Elkton, MA	7811