JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Аннотация

Приемная передача возбудителя конкретных Т-клеток может быть использован для профилактики и лечения оппортунистических инфекций, таких как цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции, происходящие после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Вирусные конкретных Т-клеток из аллогенных доноров, в том числе доноров сторонних, могут распространяться экс естественных условиях в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ), используя повторные раундов антиген-приводом стимуляции выборочно распространяются желаемых Т-клеток. Идентификация и выделение антиген-специфических Т-клеток может быть также проведена на основе системы захвата цитокинов Т-клеток, которые были активированы секретировать гамма-интерферона (IFN-gamma). Тем не менее, широко распространены человека применение системы захвата цитокинов (CCS), чтобы помочь восстановить иммунитет был ограничен, как производственный процесс занимает много времени и требует квалифицированного оператора. Развитие устройство обогащения клеток второго поколения, таких как CliniMACS Prodigy Сейчаспозволяет следователям генерируют вирусных конкретных Т-клеток, используя автоматизированную, менее трудоемким систему. Это устройство отделяет магнитно меченых клеток из клеток с использованием немеченых магнитного активированного технологии сортировки клеток для создания клинико-класса продуктов, спроектирована как закрытая система, и могут быть доступны и работают по крышке. Мы демонстрируем действие этого нового устройства автоматизированного обогащения клеток для производства CMV РР65-специфических Т клеток, полученных из стационарного афереза ​​продукта, полученного из ЦМВ серопозитивным донора. Эти изолированные Т-клетки могут быть непосредственно вливаются в пациента под институциональной и федерального регулирующего надзора. Все стадии био-обработки, включая удаление эритроцитов, стимуляция Т-клеток, разделения антиген-специфических Т-клеток, очистки и промывки полностью автоматизированы. Такие устройства, как это повышает вероятность, что Т-клетки для человека применения могут быть изготовлены за пределами посвященной надлежащей производственной практики (GMP) Средства и вместо быть произведены в банковских услуг крови, где сотрудники могут контролировать автоматизированные протоколы, чтобы произвести несколько продуктов.

Введение

Трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) 1 могут быть объединены с приемной терапии Т-клеток, чтобы улучшить трансплантат против опухоли эффект и обеспечить устойчивость к оппортунистических инфекций 2. Генерация антигенспецифических доноров полученных Т-клеток для инфузий исторически требуется квалифицированный персонал и использование специализированных объектов, которые GMP-совместимый. Доставка таких Т-клеток привела к решению оппортунистических инфекций 3, а также в лечении основного злокачественности 4. Недавно исследователи показали, что усыновитель перевод только несколько тысяч вирусспецифических Т-клеток (~ 1 х 10 4 - 2,5 х 10 5 клеток / кг массы тела получатель) может успешно лечения оппортунистических инфекций ЦМВ после аллогенной HSCT 5-9. Ограниченное число GMP объектов с соответствующими квалифицированных производственных требований и высокая стоимость, связанная с производством клеток, однако, Ограничicted доступ пациента обещая Т-клеточной терапии 10. Один из подходов к выделению антиген-специфических Т-клеток основан на CCS с помощью би-специфическим реагентом распознавать CD45 и IFN-gamma. Как показано, эта методика может быть использована для генерации клинико-класса CMV-специфичные Т-клетки, использующие автоматический CCS обогащение клеток устройство (Фигура 1В).

CMV-специфические Т-клетки генерируются путем инкубации перекрывающихся пептидов из ЦМВ РР65 антигена с лейкафереза ​​общего ядерных клеток (ТНК) из ЦМВ серопозитивных доноров. Эти пептиды, отображаемые в контексте человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), активировать ЦМВ РР65-специфических Т клеток в ТНК секретируют IFN-gamma. Эти Т-клетки могут быть "захвачены" и магнитно разделены. Работа устройства по обогащению первого поколения клеток (1А) требуется персонал квалифицированных в культуре клеток в условиях GMP, и координация персонала для проведения многочисленных SТЭЦ необходимо сформировать "захваченный" продукт.

Процедура обычно требуется от 10 до 12 ч непрерывной работы, и, следовательно, скорее всего, потребуется персонал для работы в течение двух смен на объекте GMP. Эти ограничения в настоящее время устранены путем реализации второго поколения устройства (как показано на фиг.1В). Это устройство осуществляет магнитное обогащение, похожий на устройство первого поколения, но автоматизирует другие аспекты CCS в unbreached подхода. Это значительно снижает нагрузку на команду GMP, как большинство из шагов можно выполнить без присмотра персонала. Кроме того, поскольку устройство действует как замкнутой системе, антиген-специфические Т-клетки могут быть захвачены и обработаны по крышке, кроме операций, связанных с изоляцией лейкафереза ​​и подготовки материалов перед запуском инструмента. Подробная информация о полной приборов и функциональности этого устройства по обогащению клеток второго поколения были пабчания 11.

Здесь мы опишем шаги, чтобы гости чувствовали ЦМВ РР65-специфических Т клеток из стационарного афереза ​​продукта с использованием автоматизированной системы CCS обогащению клеток. После выделения эти CMV-специфические Т-клетки могут быть немедленно вливают пациенту.

протокол

1. Подготовка материалов в стерильных условиях (см Материалы и оборудование таблицу)

  1. Подготовьте 3 л PBS / EDTA буфера с добавлением сывороточного альбумина человека (HSA) до конечной концентрации 0,5% (вес / объем).
  2. Подготовьте 1 L мешок 0,9% раствора натрия хлорида клинической класса (NaCl) и 2 л клеточной культуральной среде GMP класса.
  3. Подготовьте 60 нмоль ЦМВ конкретных пептид антигена коктейль путем восстановления один флакон ЦМВ РР65 с 8 мл стерильной воды.
  4. Перевести ЦМВ РР65 пептидный коктейль в 50 мл объема морозильной сумку с использованием Луер / Spike соединительного элемента и зажим с фиксатором щипцы, чтобы избежать последующее распределение коктейль в наборе труб. Открыть клеток набор обогащение трубки (TS 500) в стерильных условиях.
  5. Использование стерильного сварщика труб, подключения пептид коктейль мешок замерзания в связи трубки для клапана 2 комплекта трубок TS 500. Не открыть пептид коктейль мешок зажим в это время.
  6. Удалить 1 х 10 9 тNC от исходного клеточного продукта и приостановить в PBS / EDTA буфером, содержащим 2,5% HSA до общего объема 50 мл. Внедрить сотовой продукта в мешке передачи 150 мл.

2. Подготовка и использование автоматизированной системы по обогащению клеток (см Материалы и оборудование таблицу)

  1. Включить систему обогащения клеток (рис 1B) и выберите программу "CCS_IFN-γ обогащению". Соблюдайте пользовательский интерфейс, показывающий экраны с инструкциями и руководящими фотографий оператора в порядке.
  2. Введите параметр "оператор" и "Трубы Набор P / N нет". Затем установите трубки набора 500 автоматизированного обогащения клеток устройство в соответствии с инструкциями, отображаемых на экране интерактивного монитора.
  3. Следуйте шаг за шагом инструкции, отображаемых на экране, чтобы подключить носитель и буферы в устройстве. Рекордное число каталог и номер партии реагентов до коннектинг к инструменту.
  4. После окончательной проверки комплекта трубок, открыть зажим пептида коктейль мешок. Откройте средний мешок и инициировать автоматическое грунтовки множества труб.
  5. После того, как грунтовки шаг завершен, дополнить HSA (2,5%) в буфере NaCl в резервуаре мешок (200 мл) с помощью стерильного сварщика труб. Перенести начиная сотовой продукта в мешке "Application", используя стерильную сварщика труб.
  6. Подключите CCS (IFN, реагенты) в соответствующей трубки с помощью адаптеров. Введите желаемое время для сбора фракцию клеточного материала, прежде чем процесса обогащения. Обзор и проверить точность всех данных / параметры введены. Начать процесс.
  7. Перед началом автоматической процесса обогащения клеток, удалить управления сумка качества (QCB, оригинальная фракция (Ori) содержит примерно 1,3 мл из 100 мл содержимого камеры разбавленного PBS / EDTA буфера). Уплотнение QCB, взвесить, и магазин на 4 ° C.
  8. Начните enrichmeNT процесс. В конце процесса, клетки-мишени будут элюировали с приблизительной объема буфера для элюции из резервуара мешок.
  9. Уплотнение нецелевых клеток сумка (NTCB, отрицательный доля = нег) и клетки-мишени сумка (УТС, положительная дробь = POS) и взвешивать каждый мешок. Веса будут использованы в дальнейшем для расчета количества клеток.
  10. Сразу же после процедуры обогащения собирают две аликвоты на фракцию для проточной цитометрии, и хранить остальную часть образцов при 4 ° С. Использование одного образца для определения аликвоту клеточной массы, а другой образец аликвоты для анализа производительности обогащение (Таблица 1).
  11. Снимите трубку набор из инструмента обогащения клеток. Перенести файл журнала на диск USB для использования в будущем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты должны быть подготовлены в стерильных условиях. Использование биобезопасности тип II капотом настоятельно рекомендуется. Используйте стационарный сотовый афереза ​​продукт (не мобилизованы) изолирован от здоровогоЦМВ-серопозитивных доноров, чтобы обогатить антиген, специфические Т-клетки. Только FDA лицензию HSA должен быть использован. Буфер для клеточного препарата следует хранить при +19 ° C до +25 ° C, как более низкой или высокой температуре окружающей среды приведет к уменьшению чистоты и снижению выхода целевых клеток.

Определение 3. Граф сотовый

  1. Возьмем аликвоты QCB, NTCB и УТС для подсчета клеток, как показано в таблице 1. Добавить CD45-VoBlue каждой аликвоте (титр 1:11) и инкубируют в темноте в течение 10 мин при 4 ° С.
  2. Добавить 1,5 мл свежеприготовленного раствора для лизиса эритроцитов (1x) в исходное фракции и фракции, отрицательной 450 мкл свежеприготовленного раствора для лизиса клеток красной крови с положительным фракции, и инкубируют все фракции в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Непосредственно перед анализом добавьте пропидий йодида до конечной концентрации 1 мкг / мл (разведение 1: 100 100 мкг / мл). Используйте автоматический счетчик клеток для определения количества клеток и VIспособности. Используйте устройство счетчик клеток рекомендуется использовать программное обеспечение для анализа потока цитометрии. Определить абсолютные счетчики лейкоцитов оригинальные, отрицательных и положительных фракций.
    Примечание: если число элементов жизнеспособных лейкоцитов на мл образцов, взятых для анализа клеточной массы определяется с использованием анализатора клеток рекомендуется использовать программное обеспечение.
  4. Установите область, как показано на рисунке 2 (регион 5, жизнеспособные лейкоциты). Используйте следующую стратегию для определения стробирования подсчет клеток. Жизнеспособная лейкоцитов в оригинальном фракции показано на рисунке 2.
  5. Указанные регионы (Рисунок 2, 1-6) иерархически следующим образом:
    1: Время ворота → 2: Отдельные клетки → 3: CD45 + клеток → 4: Лейкоциты (мусор без НДС) → 5: жизнеспособных лейкоцитов → 6: жизнеспособные лимфоциты
  6. Повторите те же действия для определения количества клеток для негативных и позитивных фракций. Рассчитать количество клеток всей фракциис учетом коэффициента разбавитель образца и общего объема фракции (таблица 2).

4. Рассмотрение разделения производительности

  1. Вымойте аликвот QCB, NTCB и УТС фракции клеток с предварительно охлажденным PBS / EDTA буфера / 0,5% АВ сыворотки. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и аспирата супернатант.
  2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл антитела флуорохрома окрашивания смеси, содержащей: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-CD20, PerCP-PerCP, CD45-VioBlue и анти-IFN, PE-титр 1:11 () и инкубировать в темноте в течение 10 мин при 4 ° С.
  3. Добавить 1 мл свежеприготовленного раствора для лизиса эритроцитов (1x) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и аспирата супернатант. Ресуспендируют клеток в адекватном объеме PBS / EDTA буфер / 0,5% АВ сыворотки.
  4. Добавить пропидий йодида до конечной концентрации 1 мкг / мл непосредственно перед анализом (1: 100 dilutiна 100 мкг / мл). Выполнение проточной цитометрии, чтобы оценить чистоту образца.
  5. Используйте следующую стратегию стробирования для расчета CD3 + Т-клеток в жизнеспособном лейкоцитов стратегии Память для определения CD3 + Т-клеток показана на положительной фракции после процесса обогащения CCS. Указанные участки (рис 3А и 3В, 1-6) иерархически связаны которые следующим образом:
    1: Время ворота → 2: Отдельные клетки → 3: CD45 + клеток → 4: Клетки (мусор без НДС) → 5: жизнеспособные лейкоциты → 6: жизнеспособные клетки CD3 + населения
  6. Определить частоты CD4 +, CD8 + Т-клеток, после процесса обогащения CCS (Таблица 2) CD4 + IFN-gamma + и CD8 + IFN-gamma +.
  7. Использование стратегии стробирования для определения частоты CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-gamma + и CD8 + IFN-gamma + Т-клеток, показанные ниже Fили оригинал и обогащенного (захватили) положительная дробь после процесса CCS. Указанные регионы иерархически связаны и названы следующим образом:
    1: Время ворота → 2: Отдельные клетки → 3: CD45 + клеток → 4: Клетки (мусор без НДС) → 5: жизнеспособные Лейкоциты → 6: жизнеспособные CD3 + клеток → 7: CD4 + клеток → 7а: CD4 + ИФН-γ + клетки (коробка) → 8: CD8 + клетки → 8а: CD8 + IFN-gamma + клеток (коробка)

ПРИМЕЧАНИЕ: Первые 6 указанные регионы иерархии ссылок такие же, как рис 3, (1-6) и последние 2 регионы показаны на рисунке 4 (6-8a).

Результаты

В этом исследовании, автоматизированная клеток обогащение CCS Система была предназначена для автоматизированного производства ЦМВ РР65-специфических Т-клеток. CMV-специфические Т-клетки были обогащены из трех продуктов афереза ​​клеток. Стационарная афереза ​​продукт собирают в тече...

Обсуждение

Приемные терапия Т-клеток стала жизнеспособным вариантом для лечения В-клеточных злокачественных новообразований 4. Его терапевтический потенциал зависит от инфузии нужное количество целевой антиген-специфических Т-клеток, которые не имеют репликативной старение 2. Это м...

Раскрытие информации

Оба MD Anderson Cancer Center, и доктор Купер иметь финансовую заинтересованность в ZIOPHARM онкологии, Inc., и Intrexon Corporation. 7 мая 2015 года, д-р Купер был назначен главный исполнительный директор ZIOPHARM онкологии. Д-р Купер теперь приглашенный научный сотрудник MD Anderson. Д-р Купер основал и владеет InCellerate, Inc. Он имеет патенты с Sangamo BioSciences с искусственными нуклеаз. Он консультируется с Targazyme, Inc. (ранее американские стволовых клеток, Inc.), GE Healthcare, Ферринг Pharmaceuticals судьба Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, и Bristol-Myers Squibb. Он находится на Научно-консультативного совета французской фирмой Cellectis. Он получает гонорары от Miltenyi Biotec.

Благодарности

We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children's Foundation.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bagMiltenyi Biotec GmbH700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500Miltenyi Biotec GmbH130-097-182
5 L waste bagMiltenyi Biotec GmbH110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)Miltenyi Biotec GmbH279-01
Albumin (Human) 25% Grifols58516-5216-2
Luer/Spike InterconnectorMiltenyi Biotec GmbH130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65Miltenyi Biotec GmbH170-076-109
Water for injectionsHospira, inc, Lake Forest, ILNDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm MilliporeSLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bagMiltenyi Biotec GmbH170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)Miltenyi Biotec GmbH130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50Miltenyi Biotec GmbH200-074-400
60 ml Syringes, sterileBD, Laagstraat, Temse, Belgium309653
CMV sero positive apheresis productKey Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry MaterialsManufacturerCatalog number
AB Serum, GemCellGemini Bio-Products, West Sacramento, USA100-512
CD3-FITCMiltenyi Biotec GmbH130-080-401
CD4-APCMiltenyi Biotec GmbH130-098-033
CD8-APC-Vio770Miltenyi Biotec GmbH130-098-065
CD14-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-072
CD20-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-077
CD45-VioBlueMiltenyi Biotec GmbH130-098-136
aIFN-γ-PE, humanMiltenyi Biotec GmbH130-097-940
CD3-PEMiltenyi Biotec GmbH130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml)Miltenyi Biotec GmbH130-093-233
EquipmentManufacturerCatalog Number
CliniMACS Prodigy Device Miltenyi Biotec GmbH200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec GmbH130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R Eppendorf AG22331
Cellometer K2Nexelom Bioscience, Lawrence, MALB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIBTerumo Medical Corp., Elkton, MA7811

Ссылки

  1. Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
  2. Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
  3. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  4. Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
  5. Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
  6. Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
  7. Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
  8. Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
  9. Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
  10. Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
  11. Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
  12. Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  13. Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
  14. Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
  15. Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
  16. Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
  17. Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

104CCS65

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены