As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

Resumo

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Resumo

A transferência adoptiva de células T específica de agentes patogénicos podem ser utilizados para prevenir e tratar infecções oportunistas, tais como o citomegalovírus (CMV) que ocorrem após o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Células virais T específicas de dadores alogénicos, incluindo os doadores de terceiros, podem ser propagadas ex vivo em conformidade com as boas práticas de fabrico corrente (cGMP), empregando ciclos repetidos de estímulo-driven antígeno para propagar selectivamente as células T desejados. A identificação e isolamento de células T específicas de antigénio pode também ser realizada com base no sistema de captura de citoquinas de células T que foram activadas para secretar gama-interferão (IFN-γ). No entanto, a aplicação humana generalizada do sistema de captura de citocinas (CCS) para ajudar a restaurar a imunidade tem sido limitado como o processo de produção é demorada e requer um operador qualificado. O desenvolvimento de um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração, como Prodigy CliniMACS agorapermite investigadores para gerar células T-virais específico usando um, menos sistema de trabalho intensivo automatizado. Este dispositivo separa magneticamente marcada células a partir de células não marcadas usando tecnologia de células activadas por triagem magnética para gerar produtos de grau clínico, foi concebido como um sistema fechado, e pode ser acedido e é operado na bancada. Nós demonstramos o funcionamento deste novo dispositivo de enriquecimento de células automatizado para a fabricação de células T específicas para CMV pp65 obtidos a partir de um produto de aférese steady-state obtidas a partir de um dador seropositivo a CMV. Estas células T isolados podem então ser directamente injectado a um doente sob a supervisão regulamentar e institucional federal. Todos os passos de processamento de bio incluindo a remoção de células vermelhas do sangue, a estimulação de células T, separação das células T específicas de antigénio, purificação e lavagem estão completamente automatizado. Dispositivos como este levantam a possibilidade de que as células T para aplicação em seres humanos pode ser produzido fora da boa prática de fabrico dedicada (GMP) Instalações e em vez disso ser produzido em instalações bancárias de sangue onde os funcionários podem supervisionam protocolos automatizados para produzir vários produtos.

Introdução

-Transplante de células estaminais hematopoiéticas (HSCT) ¹ pode ser combinada com a terapia adoptiva de células T para melhorar o efeito do enxerto contra o tumor e para proporcionar imunidade a infecções oportunistas ^2. Geração de células derivadas do doador T específicas de antigénio para perfusão tem historicamente exigido pessoal qualificado e uso de instalações especializadas que são GMP-compliant. A entrega dos referidos células T resultou na resolução de infecções oportunistas ^3, bem como o tratamento da doença subjacente ^4. Recentemente, os investigadores demonstraram que a transferência adoptiva de apenas alguns milhares de células T específicas do vírus (1 x 10 ~ ⁴ - ⁵ 2,5 x 10 células / kg de peso corporal do receptor) podem tratar com sucesso infecções oportunistas CMV após transplante alogénico ^5-9. Um número limitado de instalações GMP com requisitos de fabrico associados especializados e o custo elevado associado com a produção de células tem, no entanto, restro acesso dos doentes a terapias promissoras icted de células T ^10. Uma abordagem para o isolamento de células T específicas de antigénio é calculada com base nos CAC usando um reagente bi-específico para reconhecer CD45 e IFN-γ. Como é mostrado, esta metodologia pode ser utilizada para gerar células T específicas para CMV grau clínico que empregam um dispositivo de enriquecimento de células CCS automatizado (Figura 1B).

Células específicas do CMV T são geradas por incubação de péptidos sobrepostos de antígeno pp65 do CMV com o total de células nucleares leucoferese (TNC) de doadores CMV-soropositivos. Estes péptidos, apresentados no contexto do antigénio dos leucócitos humanos (HLA), activar as células T específicas de pp65 de CMV dentro da TNC a secretar IFN-γ. Estas células T podem então ser "capturados" e separado magneticamente. O funcionamento do dispositivo de enriquecimento de células de primeira geração (Figura 1A), exigiam pessoal especializado em cultura de células em condições GMP, e coordenação de pessoal para realizar as múltiplas sTEPS necessário para gerar um produto "capturado".

O procedimento normalmente necessários de 10 a 12 horas de operação contínua, e, portanto, o pessoal provavelmente precisará trabalhar mais de dois turnos nas instalações GMP. Estas restrições são agora obviado pela aplicação de um dispositivo de segunda geração (mostrado na Figura 1B). Este dispositivo realiza enriquecimento magnético, semelhante ao primeiro dispositivo de geração, mas automatiza outros aspectos do CCS em uma abordagem unbreached. Isto reduz significativamente a carga sobre a equipe GMP como a maioria dos passos pode ser realizado por uma equipe autônoma. Além disso, uma vez que o dispositivo funciona como um sistema fechado, as células T específicas de antigénio pode ser capturado e processado na bancada excepto as etapas envolvidas no isolamento leucaferese e preparação dos materiais de partida antes de o instrumento. Detalhes da instrumentação completa e funcionalidade deste dispositivo enriquecimento celular de segunda geração foram pubcido ^11.

Aqui, descrevemos os passos para enriquecer células específicas do CMV pp65 T a partir de um produto de aférese de estado estacionário com o sistema automatizado CCS enriquecimento celular. Uma vez isoladas, estas células T específicas de CMV pode ser imediatamente infundidas num paciente.

Protocolo

1. Preparação dos materiais em condições estéreis (Veja Materiais e Equipamentos Table)

1. Prepare a 3 L de tampão de PBS / EDTA suplementado com albumina de soro humano (HSA) para uma concentração final de 0,5% (w / v).
2. Prepare 1 litro de solução saco de qualidade clínica a 0,9% de cloreto de sódio (NaCl) e 2 L de GMP grau de meio de cultura celular.
3. Preparar 60 nmol de CMV-específico antigénio peptídico cocktail por reconstituição de um frasco de CMV pp65 com 8 ml de água estéril.
4. Transferir CMV pp65 peptídeo cocktail em um volume de 50 ml usando um saco de congelação Luer / Pico interligação e prenda com uma pinça de bloqueio para evitar a posterior distribuição de cocktail para o conjunto de tubos. Abra a pilha conjunto de tubos de enriquecimento (TS 500) em condições estéreis.
5. Usando soldador tubulação estéril, ligue saco de congelação peptídeo cocktail na conexão do tubo de válvula 2 de conjunto de tubos TS 500. Não abra o peptídeo cocktail saco braçadeira neste momento.
6. Remover 1 x 10 ⁹ tNc do produto de partida e de suspensão celular em tampão / EDTA PBS contendo 2,5% de HSA para um volume total de 50 ml. Injectar o produto celular em um saco de transferência de 150 ml.

2. Preparação e Utilização do Sistema Automatizado celular Enrichment (Veja Materiais e Equipamentos Table)

1. Ligue o sistema de enriquecimento de células (Figura 1B) e selecione o programa "CCS_IFN-γ Enrichment". Observar uma interface de usuário que mostra telas com instruções e imagens orientadores o operador através do procedimento.
2. Digite o parâmetro "operador" e "Tubing Set P / N Não". Em seguida, instalar o dispositivo Tubing Set 500 para o enriquecimento de células automatizado, conforme as instruções exibidas na tela do monitor interativo.
3. Siga o passo a passo exibidas na tela para ligar a médio e buffers para o dispositivo. Número da ficha de catálogo e número de lote dos reagentes antes connecting para o instrumento.
4. Após a verificação final do conjunto de tubos, abra o grampo do saco peptídeo cocktail. Abra o saco de médio e iniciar priming automática do conjunto de tubos.
5. Após o passo de iniciação está completo, complementar HSA (2,5%) em tampão de NaCl no saco de reservatório (200 ml) com a ajuda do soldador tubo estéril. Transferir o produto celular partida para o "saco de Aplicação" usando o soldador tubulação estéril.
6. Conecte CCS (IFN-y) em reagentes respectiva tubagem através de adaptadores. Digite horário preferido para coletar uma fração do material celular antes processo de enriquecimento. Comente e verificar a exatidão de todos os dados / parâmetros inseridos. Iniciar o processo.
7. Antes do início do processo de enriquecimento de células automatizado, retirar o saco de Controlo de Qualidade (BQC, fracção inicial (ori), contém cerca de 1,3 ml em 100 ml de conteúdo câmara diluída com tampão / EDTA PBS). Selar a BQC, pesar e armazenar a 4 ° C.
8. Comece o enrichmeprocesso nt. No final do processo, as células alvo vai ser eluída com um volume aproximado de tampão de eluição a partir do saco de reservatório.
9. Selar o não-alvo celular Bag (NTCB, fração negativo = neg) e Bolsa alvo celular (TCB, fração positiva = pos) e pesar cada saco. Os pesos serão usados ​​mais tarde para o cálculo dos números de células.
10. Imediatamente após o procedimento de enriquecimento recolher duas alíquotas por fracção para análise de citometria de fluxo, e armazenar o restante das amostras a 4 ° C. Utilize uma aliquota da amostra para determinação da contagem de células e a outra aliquota de amostra para a análise do desempenho de enriquecimento (quadro 1).
11. Remover o conjunto de tubo do instrumento de enriquecimento de células. Transfira o arquivo de log para uma unidade USB para uso futuro.
    NOTA: Todos os reagentes devem ser preparados em condições estéreis. O uso de uma capa Segurança Biológica tipo II é altamente recomendável. Use aférese produto celular em estado estacionário (não mobilizado) isolado a partir de uma saudávelCMV-dador seropositivo para enriquecer as células T específicas de antigénio CMV. Apenas licenciada pela FDA HSA deve ser usado. O tampão para a preparação de células deve ser mantida a 19 ° C a 25 ° C como temperaturas mais elevadas ou mais baixas irão resultar em ambientes reduzida pureza e um rendimento reduzido das células alvo.

3. celular Contagem Determinação

1. Aqui as alíquotas de BQC, NTCB TCB e para as contagens de células, como mostrado na Tabela 1. Adicionar CD45-VoBlue para cada alíquota (título de 1,11) e incuba-se no escuro durante 10 min a 4 ° C.
2. Adicionar 1,5 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos recentemente preparada (1x) para a fracção original e fracção negativa, a 450 ul de solução preparada de fresco de lise de glóbulos vermelhos para a fracção positiva, todas as fracções e incubar durante 15 min à TA.
3. Imediatamente antes da análise, adiciona-se iodeto de propídio para uma concentração final de 1 ug / ml (1: 100 de diluição de 100 ug / mL). Use contador de células automático para determinar a contagem de células e vihabilidade. Use software recomendado aparelho contador de células para citometria de fluxo análise. Determinar as contagens absolutas de leucócitos para as fracções originais, negativos e positivos.
   NOTA: A contagem de células de leucócitos viáveis ​​por ml das amostras colhidas para análise de contagem de células é determinado usando o software analisador de células recomendadas.
4. Definir a região como mostrado na Figura 2 (região 5, leucócitos viáveis). Utilize a seguinte estratégia gating para determinar a contagem de células. Uma fracção de leucócitos viável no original é mostrada na Figura 2.
5. As regiões indicadas (Figura 2, 1-6), hierarquicamente são como se segue:
   1: Tempo portão → 2: células individuais → 3: células ^CD45 + ^ 4: Os leucócitos (detritos excluído) → 5: leucócitos viáveis ​​→ 6: linfócitos viáveis
6. Repita os mesmos passos para determinar as contagens de células para as fracções positivas e negativas. Calcula-se a contagem de células de toda a fracçãoconsiderando o factor de diluente da amostra e o volume total da fracção (Tabela 2).

4. O exame do desempenho de separação

1. Lavam-se as alíquotas de BQC, NTCB e células fracção TCB com tampão PBS / EDTA previamente arrefecido / 0,5% de soro AB. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
2. Ressuspender as células em 100 ul mistura de coloração anticorpo-fluorocromo contendo: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue e anti-IFN-y-PE (01:11) e título incubar no escuro durante 10 min a 4 ° C.
3. Adicionar 1 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos recentemente preparada (1x) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células num volume adequado de PBS / EDTA Tampão / 0,5% de soro AB.
4. Adicionou-se iodeto de propídio para uma concentração final de 1 ug / ml, imediatamente antes da análise (1: 100 dilutina de 100 ug / mL). Realizar análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza da amostra.
5. Utilize a seguinte estratégia gating para calcular as células ^T CD3 + em estratégia viável Supressão de leucócitos para a determinação das células ^T CD3 + é mostrada na fracção positiva após o processo de enriquecimento CCS. As regiões indicadas (Figura 3A e 3B, 1-6) estão hierarquicamente ligados como se segue:
   As células ^CD45 + → 4:: 1: tempo portão → 2: Células individuais → 3 células (detritos excluídos) → 5: leucócitos viáveis ​​→ 6: As células viáveis ^​​CD3 + populacionais
6. Determinação das frequências de células CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ ^{+ e CD8 +} IFN-γ ⁺ células T após processo de enriquecimento de CCS (Tabela 2).
7. Utilizar a estratégia de propagação para determinar as frequências ^de células CD4 +, CD8 ^{+, CD4} + IFN-γ ^{+ e CD8 +} IFN-γ ⁺ células T mostrados abaixo fou um (capturado) fração positivo original e enriquecido após o processo de CCS. As regiões indicadas são hierarquicamente ligados e nomeados da seguinte forma:
   As células ^CD45 + → 4:: 1: tempo portão → 2: Células individuais → 3 células (detritos excluídos) → 5: Os leucócitos viáveis ​​→ 6: As células viáveis ^​​CD3 + → 7: CD4 ⁺ células → 7a: CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ células (box) → 8: CD8 ⁺ células → 8a: ^CD8 + IFN-gama ⁺ (box)

NOTA: Os primeiros 6 regiões indicadas de hierarquia as ligações são as mesmas que na Figura 3, (1-6) e 2 última regiões são mostradas na Figura 4 (6-8a).

Resultados

Neste estudo, um sistema de células automatizado enriquecimento CAC foi utilizado para a produção automatizada de células T específicas de pp65 de CMV. Células T específicas do CMV foram enriquecidas a partir de três produtos de células de aférese. O produto de aférese em estado estacionário foi colhida ao longo de 2 horas a partir de um doador CMV-soropositivos e gerou 10 ¹⁰ células nucleares totais (CNC). 10 ⁹ TNC foram então activadas com péptidos derivados de CMV pp65 (60 nmol) d...

Discussão

Terapia adoptiva de células T tem emergido como uma opção viável para o tratamento de malignidades de células-B ^4. O seu potencial terapêutico é dependente infundindo o número desejado de células T específicas para o antigénio alvo que carecem de senescência replicativa ^2. Isto pode ser conseguido, classificando uma população pura de células T específicas de antigénios a partir de células T expandidas de acordo com as boas práticas de fabrico actuais. Dois procedimentos de triage...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-182
5 L waste bag	Miltenyi Biotec GmbH	110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)	Miltenyi Biotec GmbH	279-01
Albumin (Human) 25%	Grifols	58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)	Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-109
Water for injections	Hospira, inc, Lake Forest, IL	NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm	Millipore	SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec GmbH	200-074-400
60 ml Syringes, sterile	BD, Laagstraat, Temse, Belgium	309653
CMV sero positive apheresis product	Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials	Manufacturer	Catalog number
AB Serum, GemCell	Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA	100-512
CD3-FITC	Miltenyi Biotec GmbH	130-080-401
CD4-APC	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-033
CD8-APC-Vio770	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-065
CD14-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-072
CD20-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-077
CD45-VioBlue	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-136
aIFN-γ-PE, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-940
CD3-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml)	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-233
Equipment	Manufacturer	Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device	Miltenyi Biotec GmbH	200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec GmbH	130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R	Eppendorf AG	22331
Cellometer K2	Nexelom Bioscience, Lawrence, MA	LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB	Terumo Medical Corp., Elkton, MA	7811