Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Resumen

Dominios de dedos de zinc son células permeable intrínseca y capaz de mediar la entrega de proteínas en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología zinc-finger para la entrega de proteínas intracelulares.

Resumen

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys₂-His₂ zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Introducción

Altamente estrategias de suministro de proteínas eficientes y versátiles son críticas para muchos la investigación básica y las aplicaciones terapéuticas. La entrega directa de proteínas purificadas en las células representa uno de los métodos más seguros y más fáciles para lograr esto. ^1,2 diferencia de las estrategias que se basan en la expresión de genes a partir de ácidos nucleicos, ^{3-5 de} administración de proteínas no plantea ningún riesgo de mutagénesis de inserción, es independiente de la maquinaria celular de la transcripción / traducción y permite un efecto inmediato. Sin embargo, la falta de métodos simples y generalizables para dotar a la actividad de penetración celular en proteínas confunde habitualmente su ingreso directo en las células. Los métodos actuales para facilitar la entrega intracelular de proteínas se basan en el uso de origen natural o diseñados ^6-8 péptidos de penetración celular, ^9-12 dominios de transducción de sobrealimentados, ^13,14 nanopartículas y liposomas ^{15, 16} partículas similares a virus ^17,18 y materiales de microesferas poliméricas. ¹⁹ Desafortunadamente, muchos de estos enfoques se ven obstaculizados por las bajas tasas de absorción celular, ^20,21 pobre estabilidad, ²² inadvertida especificidad de tipo celular, ²³ propiedades de escape bajo endosomales ²⁴ y toxicidad. ²⁵ Además, muchas proteínas tecnologías de transducción de reducir la bioactividad de las proteínas entregados. ¹⁴

Nuestro laboratorio previamente demostró que nucleasa dedo de zinc (ZFN) proteínas - restricción endonucleasas quimérico que consiste en una proteína programable _Cys2 -Su ₂ dedos de zinc de unión a ADN y el dominio de la escisión de la endonucleasa de restricción FokI ^26-28 - son inherentemente por células permeable. ²⁹ Esta actividad de penetración celular sorprendente ha demostrado ser una propiedad intrínseca del dominio dedo de zinc de diseño personalizado, una plataforma de unión a ADN que ha surgido como una poderosa herramienta para apuntado genoma eningeniería, ^30-32 y considera que es el resultado de la constelación de seis residuos de carga positiva en la superficie de la proteína. De hecho, varias proteínas de unión al ADN, incluyendo c-Jun N-DEK y se han demostrado poseer una capacidad innata para atravesar las membranas celulares. ³³ Más recientemente, nuestro laboratorio ampliado en estos resultados y demostró que la actividad de las células de penetración de zinc dedo (ZiF) dominios podrían ser aprovechados para la entrega de proteínas intracelulares. Fusión genética de cualquiera de los dominios ZIF de uno o dos dedos a la carga de proteína específica llevado a la absorción eficiencias que superan muchos sistemas de suministro de péptidos de penetración celular convencionales. ³⁴ En particular, la entrega mediada por ZiF no comprometió la actividad enzimática de la carga fundida y facilitó altos niveles de entrega citosólica. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial del dominio ZiF para facilitar la prestación eficiente y fácil de proteínas, y potencialmente más diversos tipos de macromoléculas, en las células.

Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso sobre cómo implementar la tecnología ZiF para la entrega de proteínas en células de mamíferos. Anteriormente hemos construido un conjunto de uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis dedo dominios ZIF que carecen de la capacidad de unirse al ADN, debido a la sustitución de cada uno de los residuos de unión a ADN-α helicoidal, pero son capaces de entregar proteínas en células ³⁴ (Figura 1). Se describe la producción y la transducción de Emerald GFP (EmGFP) en células HeLa utilizando un dominio ZiF con dos dedos. Este protocolo es extensible a casi cualquier proteína capaz de la expresión soluble en Escherichia coli y casi cualquier tipo de célula de mamífero. Resultados esperados se proporcionan y también se discuten estrategias para maximizar el rendimiento de este sistema.

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Protocolo

1. Clonación

1. Obtener dominios ZIF con dos dedos de alanina-sustituido que se han clonado sub-en el sistema de vector de expresión pET-28 y están disponibles bajo petición (PET-2F-ZiF). ³⁴
2. Amplificar por PCR EmGFP del plásmido Esmeralda-pBAD con los cebadores 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma sitio I en negrita) y 3 'Sac-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac I sitio en negrita).
   1. Utilice 5 ng de ADN plantilla, 10 l de tampón 10x de la polimerasa, 1 unidades (U) de ADN Taq polimerasa, 0,2 mM de cada dNTP y 0,2 M de cada cebador en una solución de 100 l con el volumen restante compuestos de agua destilada / desionizada . Utilice las condiciones de ciclo: 95 ° C durante 5 minutos; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 1 minuto; 72 ° C durante 10 min. Se purifica el producto de PCR por extracti gelen y determinar la concentración de ADN usando un espectrofotómetro de medición Abs ₂₆₀ x 50 g / ml.
3. Recopilación pET-2F-ZiF y el inserto que codifica EmGFP con las enzimas de restricción Xma I y Sac I en tampón recomendado durante 3 horas a 37 ° C utilizando 10 U de enzima por 1 g de ADN. Visualizar el ADN por electroforesis en gel de agarosa usando un colorante intercalante fluorescente, tal como bromuro de etidio.
4. Se purifica el ADN digerido mediante el kit de extracción de gel y determinar la concentración de ADN mediante un espectrofotómetro de medición Abs ₂₆₀ x 50 g / ml.
5. Ligar el ADN que codifica EmGFP purificado en 50-100 ng de pET-2F-ZiF utilizando 1 U de T4 DNA ligasa durante al menos 1 h a TA. Para obtener los mejores resultados, realice la reacción de ligación utilizando un 6: 1 molar-inserción a vector.
6. Descongelar 50 l de cualquier químicamente competentes XL-1 Azul de Escherichia coli células en hielo y mezclar suavemente con 10-20 ng de ligó pET-2F-ZiF-EmGFP.
7. Mantenga en hielo durante 30 min. El choque térmico la mezcla a 42 ° C durante 90 seg y recuperar las células en 2 ml de caldo de Super óptima con represión catabólica (SOC) durante 1 hora a 37 ° C con agitación.
8. Corre 100 l de la cultura de recuperación en un caldo lisogenia (LB) placa de agar con 50 g / ml de kanamicina y se incuba O / N a 37 ° C.
9. El día siguiente, inocular 6 ml de caldo super (SB) o de cultivo LB que contiene 50 mg / ml de kanamicina con una colonia de la placa de agar LB y cultivo O / N a 37 ° C.
   Nota: Colony PCR usando los cebadores 5 'XmaI-EmGFP y 3' SacI-EmGFP podría utilizarse para identificar los clones positivos antes de la miniprep.
10. Purificar pET-2F-ZiF-EmGFP por miniprep y confirmar mediante secuenciación de ADN plásmido utilizando el promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Expresión y purificación

1. Descongele 50 l de químicamente competente E. BL21 coli células en hielo y mezclar suavemente con 100 ng de pET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformar como se describe en los pasos 1.7 a 1.8.
2. El día siguiente, inocular 10 ml de medio LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina con una sola colonia y crecer O / N a 37 ° C con agitación.
3. El día siguiente, diluir 10 ml de cultivo O / N en 1 L de medio LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina, 0,2% de glucosa y 100 mM _ZnCl2. Mantener el cultivo a 37 ° C con agitación hasta una densidad óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ de 0,8 e inducir la expresión de la proteína con 2 mM isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Después de 6 horas de crecimiento a 37 ° C, las células de la cosecha por centrifugación a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   Nota: Las condiciones de inducción son altamente variables y dependen de la estabilidad de las proteínas que se expresa. Supervisar el OD ₆₀₀ cada 30 minutos hasta una DO ₆₀₀ de 0,8 se alcanza.
4. Resuspender el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM _ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM de MgCl _2, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) e imidazol 10 mM, pH 8,0). Lisar las células en hielo por ultrasonidos con la siguiente configuración: potencia del 50%, 4 minutos de tiempo de proceso con 5 segundos de encendido / apagado 10 segundos intervalos. Evite el sobrecalentamiento de la solución.
5. Centrifugar el lisado de células a 25.000 xg durante 30 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo de recogida fresco. Para obtener los mejores resultados, realice todos los pasos siguientes a 4 ° C.
6. Ejecute el sobrenadante a través de una columna pre-envasados ​​con 1 ml de suspensión equilibrada Ni-NTA. Lavar la resina con 20 ml de tampón de lavado (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM _ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl imidazol ₂ y 30 mM, pH 8,0).
7. Eluir la proteína con 5 ml de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM _ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl _2, e imidazol 300 mM, pH 8,0).
8. Intercambio de tampón la proteína se eluyó con tampón de almacenamiento (50 mMTris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM _ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl ₂ y 10% de glicerol, pH 8,0) y concentrar la proteína a al menos 40 mM utilizando un concentrador de giro por centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
9. Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford o BCA. Mezclar 2 l de proteínas purificadas con 2 l 2 × colorante de carga SDS-PAGE, hierven a 95 ° C durante 10 min y luego resolver el 4% -20% Tris-glicina SDS-PAGE para evaluar la pureza de proteína (Figura 2).

3. La proteína de almacenamiento

1. Alícuota de la proteína concentrada, congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Para las proteínas de fusión EmGFP, cubrir el tubo con papel de aluminio para proteger la proteína de la luz.
2. Evite la congelación y descongelación repetida de la solución de proteína. Nota: Las proteínas fusionadas-ZiF son estables en estas condiciones durante al menos 1 mes. O almacenamiento inadecuado mes> 4 puede conducirpara la precipitación de proteínas o photobleaching de EmGFP.

Transducción 4. Proteína

1. Mantener las células HeLa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% (v / v) de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C en una atmósfera totalmente humidificada con 5% de CO _2.
   Nota: las pasaron más de 30 veces no se recomiendan para la transducción de la proteína.
2. Pre-capa de una placa de 24 pocillos con 500 l de 50 mg / ml de poli-lisina durante 30 a 60 min a 25 ° C. Sembrar las células en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10 ⁵ células por pocillo. A las 24 h después de la siembra, o una vez que las células son entre 80% -90% de confluencia, retirar el medio de cada pocillo y se lava con 500 l de DMEM libre de suero pre-calentado (SFM).
3. A cada pocillo, añadir 250 l de SFM que contiene 2 M de proteína ZiF-EmGFP y 100 mM _ZnCl2. Se incuban las células a 37 ° C durante 1 hr. Nota: Los dominios ZIF entran en las células primarily través macropinocytosis, ^34, que es un mecanismo dependiente de la energía. Por lo tanto, las células deben ser incubadas a 37 ° C para la internalización de proteínas eficiente.
4. Retire el medio de las células y lavar tres veces con 500 l de calcio y de magnesio libre de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado con 0,5 mg / ml de heparina. Nota: La heparina es necesario para eliminar la proteína unida a la superficie que pudiera complicar los análisis.
5. (Opcional) repetir el tratamiento hasta tres veces para la entrega mejorada.
6. Aislar las células tratadas inmediatamente después de la heparina de lavado por digestión con 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 2 min. Vuelva a suspender las células desprendidas en 0,5 ml de DPBS suplementado con 1% de SFB.
7. Medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra por citometría de flujo ³⁵ utilizando el canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 3). Ajuste la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para colocar la población deinterés en la escala, asegurando que las poblaciones con diferentes propiedades se resuelven el uno del otro.
8. Recoge 10.000 eventos en directo para cada muestra y analizar los datos mediante citometría de flujo análisis de datos de software. ³⁶ Normalizar la fluorescencia de las células HeLa tratadas con ZiF-EmGFP a esas células tratadas sólo con SFM.

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Resultados

Con dos dedos proteínas de fusión ZiF-EmGFP pueden expresarse en E. coli con> 95% de homogeneidad y altos rendimientos (> 25 mg / ml) (Figura 2). En general, de uno y dos dedos proteínas de fusión ZIF pueden ser producidos en cantidades casi idénticas a las de la proteína no modificada de tipo salvaje. Sin embargo, en algunos contextos, proteínas de fusión ZiF de cinco y seis dedos no son capaces de ser producidos en rendimientos suficientemente altos para aplicaciones posteriores...

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Discusión

Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para la entrega de proteínas utilizando zinc-finger (ZiF) dominios de células permeable. El dominio ZiF no reduce la actividad enzimática de la carga fundida ^34; permite la producción y purificación de proteínas en rendimientos casi idénticos a los observados con proteína no modificada; y puede transportar proteínas y enzimas en una amplia gama de tipos de células con eficiencias que superan los sistemas de dominio de transducción de proteína o péptido ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
XmaI	New England Biolabs	R0180L
SacI	New England Biolabs	R0156L
Expand High Fidelity PCR system	Roche	11759078001
dNTPs	New England Biolabs	N0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells	Life Technologies	EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer	BioRad	161-0737
T4 DNA Ligase	Life Technologies	15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coli	New England Biolabs	C2527I
IPTG	Thermo Scientific	R0391
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086-5G
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP906-5
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-25
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
DTT	Fisher Scientific	PR-V3151
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ni-NTA Agarose Resin	QIAGEN	30210
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ML
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	EMO Millipore	UFC900324
DMEM	Life Technologies	11966-025
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-028
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
24-Well Flat Bottom Plate	Sigma-Aldrich	CLS3527-100EA
Poly-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
DPBS, No Calcium, No Magnesium	Life Technologies	21600010
Heparan Sulfate	Sigma-Aldrich	H4777
Trypsin	Life Technologies	25300054
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704