Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Resumo

Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.

Resumo

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys₂-His₂ zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Introdução

Altamente estratégias de fornecimento de proteína eficientes e versáteis são críticos para muitos pesquisa básica e aplicações terapêuticas. A entrega directa das proteínas purificadas em células representa um dos métodos mais seguros e mais fáceis para alcançar este objectivo. ^1,2 Ao contrário das estratégias que dependem de expressão de genes de ácidos nucleicos, ^3-5 entrega proteína não apresenta nenhum risco de mutagénese de inserção, é independente do transcrição / máquinas e tradução celular permite um efeito imediato. No entanto, a falta de métodos simples e generalizáveis ​​para dotar a atividade de penetração celular para proteínas confunde rotineiramente sua entrada direta nas células. Os métodos actuais para facilitar a entrega intracelular de proteínas são baseadas no uso de ocorrência natural ou ^6-8 concebidos de penetração de células, péptidos ^9-12 domínios de transdução de sobrealimentação, ^13,14 nanopartículas ^{15, 16} e lipossomas partículas semelhantes a vírus ^17,18 e materiais de microesferas poliméricas. ¹⁹ Infelizmente, muitas dessas abordagens são dificultados pelas taxas de captação celular baixos, ^20,21 pobre estabilidade, ²² inadvertida tipo de célula de especificidade, ²³ propriedades de escape baixo endossomais ²⁴ e toxicidade. ²⁵ Além disso, muitos proteína tecnologias de transdução de reduzir a bioactividade das proteínas entregues ^14.

O nosso laboratório demonstrou anteriormente que zinc-finger nuclease proteínas (ZFN) - endonucleases de restrição quimérico que consiste de uma Cys His _{2 2} zinc-finger programável proteína de ligação a ADN e domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI ^26-28 - são inerentemente célula.dia permeável. ²⁹ Esta actividade de penetração celular surpreendente mostrou ser uma propriedade intrínseca do domínio dedo-de-zinco personalizados, com uma plataforma de ligação de ADN que surgiu como uma ferramenta poderosa para o genoma segmentado enengenha-, ^30-32 e ser considerada como o resultado da constelação de seis resíduos carregados positivamente na superfície da proteína. De facto, várias proteínas de ligação de ADN, incluindo c-Jun e N-DEK foram mostrados para possuir uma capacidade inata para atravessar as membranas celulares. ³³ Mais recentemente, no nosso laboratório expandido estes resultados e demonstraram que a actividade da célula de penetração de zinco finger (ZIF) da domínios poderia ser aproveitado para a entrega de proteínas intracelulares. Fusão genética de ambos domínios ZIF de um ou dois dedos para carga proteína específica levou a absorção eficiências que superaram muitos sistemas de entrega de peptídeos convencionais de penetração celular. ³⁴ Mais notavelmente, entrega ZiF mediada não comprometeu a atividade de carga enzimática fundido e facilitado altos níveis de entrega cytosolic. Colectivamente, estes resultados demonstram o potencial do domínio ZiF para facilitar a entrega eficiente e fácil de proteínas, e potencialmente mais diversos tipos de macromoléculas, em células.

Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo sobre como implementar a tecnologia ZiF para entrega de proteína em células de mamíferos é apresentada. Nós previamente construído um conjunto de um, dois, três, quatro, cinco e seis domínios dedo-Zif que não possuem a capacidade de se ligar ao ADN, devido a substituição de cada um dos resíduos de ligação ao ADN de hélice α, mas são capazes de fornecer proteínas em células ³⁴ (Figura 1). A produção e a transdução de esmeralda GFP (EmGFP) em células HeLa usando um domínio ZiF de dois dedos é descrito. Este protocolo é extensível para quase qualquer proteína solúvel capaz de expressão em Escherichia coli e quase qualquer tipo de células de mamíferos. Os resultados esperados são fornecidos e estratégias para maximizar o desempenho do sistema também são discutidos.

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Protocolo

1. Clonagem

1. Obter de dois dedos domínios ZIF substituído por alanina que foram sub-clonados no sistema de expressão vector pET-28 e estão disponíveis mediante pedido (PET-2F-ZiF). ³⁴
2. EmGFP amplificar por PCR a partir do plasmídeo pBAD-esmeralda com os iniciadores 5 'Xmal-EmGFP (3-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC 5'-GGAAATTG CCCGGG'; sítio Xmal em negrito) e 3 'Saci-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' site eu Sac em negrito);.
   1. Use 5 ng de ADN molde, 10 ul de tampão de polimerase 10x, 1 Unidades (U) de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP e 0,2 pM de cada iniciador numa solução de 100 uL com o restante volume constituídos de água destilada / desionizada . Use as condições dos ciclos: 95 ° C durante 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 10 min. Purifica-se o produto de PCR por gel extractie em determinar a concentração de ADN utilizando um espectrofotómetro de medição Abs ₂₆₀ x 50 ug / ml.
3. Digest pET-2F-ZiF e a inserção que codifica EmGFP com as enzimas de restrição Xmal e Sac I em tampão recomendado durante 3 horas a 37 ° C utilizando 10 U de enzima por 1 ug de ADN. Visualizar o ADN por electroforese em gel de agarose, utilizando um corante fluorescente intercalante, tal como brometo de etídio.
4. Purifica-se o ADN digerido por gel extraction kit e determinar a concentração de DNA por um espectrofotómetro Abs medindo ₂₆₀ x 50 ug / ml.
5. Ligadura o ADN que codifica EmGFP purificado em 50-100 ng de pET-2F-ZiF usando 1 U de T4 DNA ligase durante pelo menos 1 h à TA. Para melhores resultados, realizar a reacção de ligação utilizando uma razão de 6: molar de inserção-para-um vector.
6. Descongelar 50 ul de quaisquer células XL-1 azul de E. coli quimicamente competentes de Escherichia em gelo e misturar suavemente com 10-20 ng de ligado pET-2F-ZiF-EmGFP.
7. Manter em gelo durante 30 min. O choque térmico a mistura a 42 ° C durante 90 seg e recuperar as células em 2 ml de caldo super óptima com repressão catabólica (SOC) durante 1 hora a 37 ° C com agitação.
8. Espalhe 100 ul de cultura de recuperação em um caldo lisogenia (LB) placa de ágar com 50 ug / ml de canamicina e incubar O / N a 37 ° C.
9. No dia seguinte, inocula 6 ml de Super Broth (SB) ou cultura LB contendo 50 ug / ml de canamicina com uma colónia da placa de agar LB e a cultura O / N a 37 ° C.
   Nota: Colony PCR utilizando os iniciadores 5 'e Xmal-EmGFP 3' Saci-EmGFP poderia ser usado para identificar os clones positivos antes de miniprep.
10. Purificar pET-2F-ZiF-EmGFP por miniprep e confirmar plasmídeo por sequenciação de ADN utilizando o promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Expressão e purificação

1. Descongelar 50 ul de quimicamente competentes BL21 de E. coli células no gelo e misture delicadamente com 100 ng do PET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformação como descrito nos passos 1,7-1,8.
2. No dia seguinte, inocular 10 ml de meio LB contendo 50 ug / ml de canamicina com uma única colónia e crescer O / N a 37 ° C com agitação.
3. No dia seguinte, dilui-se os 10 ml da cultura D / N para 1 L de meio LB suplementado com 50 ug / ml de canamicina, 0,2% de glucose e 100 mM de _ZnCl2. Crescer a cultura a 37 ° C com agitação até uma densidade óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ de 0,8 e induzir a expressão da proteína com 2 mM de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Após 6 horas de crescimento a 37 ° C, as células da colheita por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   Nota: As condições de indução são muito variáveis ​​e dependem da estabilidade das proteínas a ser expressa. Monitorar a OD _{a 600} a cada 30 min até uma _DO600 de 0,8 seja alcançado.
4. Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 mM de _ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM de MgCl _2, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e 10 mM de imidazol, pH 8,0). Lisar as células no gelo por ultra-sons com a seguinte configuração: 50% de potência, 4 min de tempo de processo com 5 sec on / off intervalos de 10 segundos. Evitar o sobreaquecimento da solução.
5. Centrifuga-se o lisado celular a 25000 xg durante 30 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo de recolha de fresco. Para melhores resultados, executar todos os passos seguintes a 4 ° C.
6. Executar o sobrenadante através de uma coluna pré-embalada com 1 ml de suspensão equilibrada de Ni-NTA. Lava-se a resina com 20 ml de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 fiM de _ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl ₂ e 30 mM de imidazol, pH 8,0).
7. Elui-se a proteína com 5 ml de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 fiM de _ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de _MgCl2, e 300 mM de imidazole, pH 8,0).
8. Tampão de trocar a proteína eluída com tampão de armazenamento (50 mMTris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 mM de _ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM _de MgCl2 e glicerol a 10%, pH 8,0) e concentrar a proteína de pelo menos 40 jiM utilizando um concentrador de rotação por centrifugação de acordo com as instruções do fabricante.
9. Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford ou BCA. Misturar 2 ul de proteínas purificadas com 2 ul 2 × SDS-PAGE de corante de carga, ferver a 95 ° C durante 10 min e em seguida resolver a 4% -20% de Tris-Glicina SDS-PAGE para avaliar a pureza de proteína (Figura 2).

3. Proteína de armazenamento

1. Alíquota da proteína concentrada, congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Para as proteínas de fusão EmGFP, cobrir o tubo com folha de alumínio para proteger a proteína da luz.
2. Evite congelamento e descongelamento da solução de proteína repetido. Nota: ZiF proteínas fundidas são estáveis ​​sob estas condições durante pelo menos 1 mês. Ou armazenamento inadequado mês> 4 pode levara precipitação de proteínas ou de fotobranqueamento EmGFP.

Transdução 4. Protein

1. Manter as células HeLa em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C em uma atmosfera totalmente humidi ficada com 5% de CO _2.
   Nota: As células passadas mais de 30 vezes não são recomendados para a transdução de proteína.
2. Pré-revestimento de uma placa de 24 poços com 500 ul de 50 ug / ml de poli-lisina para 30 a 60 min a 25 ° C. Semear as células num prato de 24 cavidades a uma densidade de 2 x 10 ⁵ células por poço. Em 24 horas após a sementeira, ou uma vez que as células são entre 80% -90% confluentes, retirar o suporte de cada poço e lava-se com 500 ul de DMEM isento de soro pré-aquecido (SFM).
3. Para cada poço, adicione 250 mL de SFM contendo 2 uM de proteína ZiF-EmGFP e 100 uM de _ZnCl2. Incubar as células a 37 ° C durante 1 h. Nota: domínios ZIF entrar nas células primarily através de macropinocitose, ^34, o qual é um mecanismo dependente de energia. Portanto, as células devem ser incubados a 37 ° C durante internalização proteína eficiente.
4. Remover meios a partir de células e lava-se três vezes com 500 ul de cálcio e sem magnésio salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado com 0,5 mg / ml de heparina. Nota: A heparina é necessário remover a proteína ligada à superfície que pode complicar análises a jusante.
5. (Opcional) tratamentos repetidos até três vezes para maior entrega.
6. Isolar células tratadas imediatamente depois de heparina de lavagem por digestão com 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 2 min. Re-suspender as células isoladas em 0,5 ml de DPBS suplementadas com 1% de FBS.
7. Medir a intensidade de fluorescência de cada amostra por ³⁵ citometria de fluxo utilizando o isotiocianato de fluoresceína (FITC) canal (Figura 3). Ajuste a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para colocar a população deinteresse na escala, assegurando que as populações com propriedades diferentes são resolvidos um do outro.
8. Colete 10.000 eventos ao vivo para cada amostra e analisar os dados utilizando citometria de fluxo de análise de dados software. ³⁶ Normalize fluorescência de células HeLa tratadas com ZiF-EmGFP a essas células tratadas apenas com SFM.

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Resultados

Dois dedos de proteínas de fusão ZiF-EmGFP pode ser expresso em E. coli com> 95% de homogeneidade e rendimentos elevados (> 25 mg / ml) (Figura 2). Em geral, de um e de dois dedos proteínas de fusão ZiF pode ser produzido em quantidades quase idênticas às de proteína não modificada tipo selvagem. No entanto, em alguns contextos, as proteínas de fusão ZiF cinco e seis dedos não são capazes de ser produzidos em rendimentos elevados o suficiente para aplicações a jusante.

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Discussão

Aqui, um protocolo passo-a-passo para a entrega de proteína utilizando dedo de zinco (ZiF) domínios de células-permeável é apresentado. O domínio ZiF não reduz a atividade de carga enzimática fundido ^34; permite a produção e purificação de proteínas em rendimentos quase idênticos aos observados com a proteína não modificada; e pode transportar proteínas e enzimas para uma ampla gama de tipos de células, com as eficiências que excedem os sistemas tradicionais de penetração de células de p...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
XmaI	New England Biolabs	R0180L
SacI	New England Biolabs	R0156L
Expand High Fidelity PCR system	Roche	11759078001
dNTPs	New England Biolabs	N0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells	Life Technologies	EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer	BioRad	161-0737
T4 DNA Ligase	Life Technologies	15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coli	New England Biolabs	C2527I
IPTG	Thermo Scientific	R0391
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086-5G
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP906-5
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-25
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
DTT	Fisher Scientific	PR-V3151
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ni-NTA Agarose Resin	QIAGEN	30210
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ML
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	EMO Millipore	UFC900324
DMEM	Life Technologies	11966-025
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-028
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
24-Well Flat Bottom Plate	Sigma-Aldrich	CLS3527-100EA
Poly-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
DPBS, No Calcium, No Magnesium	Life Technologies	21600010
Heparan Sulfate	Sigma-Aldrich	H4777
Trypsin	Life Technologies	25300054
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704