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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine ​​in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.

Abstract

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Introduzione

Altamente strategie consegna proteine ​​efficienti e versatili sono fondamentali per molti la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. La consegna diretta di proteine ​​purificate in cellule rappresenta uno dei metodi più sicuri e più semplici per raggiungere questo. 1,2 differenza strategie che si basano su espressione genica da acidi nucleici, proteine ​​3-5 consegna non comporta alcun rischio di mutagenesi inserzionale, è indipendente dal cellular trascrizione macchinari e / definizione permette un effetto immediato. Tuttavia, la mancanza di metodi semplici e generalizzabili per dotare l'attività delle cellule-penetrante su proteine ​​confonde regolarmente il loro ingresso diretto nelle cellule. Gli attuali metodi per facilitare la consegna proteina intracellulare si basano sull'uso di naturalmente 6-8 o progettati peptidi cellula-penetranti, 9-12 domini di trasduzione sovralimentati, 13,14 nanoparticelle 15 e liposomi, 16 particelle simili al virus 17,18 materiali polimerici microsfere. 19 Purtroppo, molti di questi approcci sono ostacolati da bassi tassi di assorbimento cellulare, 20,21 scarsa stabilità, 22 involontaria tipo cellulare specificità, 23 basso endosomali proprietà di fuga di 24 e la tossicità. 25 Inoltre, molti proteine ​​e tecnologie di trasduzione riducono la bioattività delle proteine ​​consegnati. 14

Il nostro laboratorio in precedenza dimostrato che zinc-finger nucleasi (ZFN) proteine ​​- restrizione endonucleasi chimerico costituito da una Cys 2 -Il suo 2 zinc-finger proteina-DNA-binding programmabile e il dominio scissione del FokI endonucleasi di restrizione 26-28 - sono intrinsecamente cell- permeabile. 29 L'attività delle cellule-penetrante sorprendente ha dimostrato di essere una proprietà intrinseca del dominio zinc-finger design personalizzato, una piattaforma di legame al DNA che è emersa come un potente strumento per la mirata del genoma enEngineering, 30-32 e considerato il risultato della costellazione di sei residui carichi positivamente sulla superficie della proteina. Infatti, diverse proteine ​​che legano il DNA, tra cui c-Jun e N-DEK hanno dimostrato di possedere una capacità innata di attraversare le membrane cellulari. 33 Più recentemente, il nostro laboratorio espanso su questi risultati e dimostrato che l'attività delle cellule-penetrante di zinco finger (ZIF) domini potrebbero essere sfruttate per la consegna delle proteine ​​intracellulari. La fusione genetica di entrambi i domini ZIF uno o due dita per uno specifico carico di proteine ​​portato ad assorbimento di efficienza che hanno superato molti sistemi di consegna di peptidi cellula-penetranti convenzionali. 34 In particolare, la consegna Zif-mediata non ha compromesso l'attività di carico enzimatica fuso e facilitato alti livelli di consegna citosolico. Collettivamente, questi risultati dimostrano il potenziale del dominio ZIF per facilitare la consegna efficiente e facile delle proteine, e potenzialmente più diversi tipi di macromolecole, nelle cellule.

Qui, un protocollo dettagliato passo-passo su come implementare la tecnologia ZIF per la consegna delle proteine ​​in cellule di mammifero è presentato. Abbiamo già costruito una suite di uno, due, tre, quattro, cinque e sei dita domini ZIF che non hanno la capacità di legare il DNA, a causa della sostituzione di ciascuno dei DNA-binding residui α-elica, ma sono in grado di fornire proteine ​​in cellule 34 (Figura 1). La produzione e la trasduzione di Emerald GFP (EmGFP) in cellule HeLa utilizzando una Zif dominio a due dita è descritto. Questo protocollo è estensibile a quasi qualsiasi proteina in grado di espressione solubile in Escherichia coli e quasi ogni tipo di cellula di mammifero. I risultati attesi sono forniti e strategie per massimizzare le prestazioni di questo sistema vengono anche discussi.

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Protocollo

1. Clonazione

  1. Ottenere domini Zif due dita alanina-sostituiti che sono stati sub-clonati nel sistema vettore di espressione pET-28 e sono disponibili su richiesta (PET-2F-ZIF). 34
  2. PCR amplifica EmGFP dal plasmide Emerald-pBAD con primer 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma sito ho in grassetto) e 3 'SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac sito che ho in grassetto).
    1. Utilizzare 5 ng di DNA stampo, 10 microlitri di tampone 10x polimerasi, 1 unità (U) di DNA polimerasi Taq, 0,2 mM ciascun dNTP e 0,2 mM di ciascun primer in una soluzione di 100 microlitri con il volume rimanente costituiti di acqua distillata / deionizzata . Utilizzare le condizioni di ciclismo: 95 ° C per 5 minuti; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 10 min. Purificare il prodotto PCR gel extraction e determinare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro misura Abs 260 x 50 ug / ml.
  3. Digest pET-2F-ZIF e l'inserto codifica EmGFP con gli enzimi di restrizione Xma I e Sac I in tampone raccomandato per 3 ore a 37 ° C utilizzando 10 U di enzima per 1 mg di DNA. Visualizza DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un colorante fluorescente intercalante, come bromuro di etidio.
  4. Purificare il DNA digerito dalla kit estrazione gel e determinare la concentrazione di DNA da uno spettrofotometro misurando Abs 260 x 50 mg / ml.
  5. Legare il DNA EmGFP-codifica purificato in 50-100 ng di PET-2F-ZIF con 1 U di T4 DNA Ligase per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Per ottenere i migliori risultati, effettuare la reazione di ligazione utilizzando un 6: rapporto molare 1 inserto a vettoriale.
  6. Scongelare 50 ml di eventuali chimicamente competenti XL-1 blu Escherichia coli su ghiaccio e mescolare delicatamente con 10-20 ng di legatura PET-2F-ZIF-EmGFP.
  7. Tenere in ghiaccio per 30 min. Urti Riscaldare la miscela a 42 ° C per 90 sec e recuperare le cellule in 2 ml di brodo con Super Optimal Cataboliti rimozione (SOC) per 1 ora a 37 ° C con agitazione.
  8. Stendere 100 ml di cultura recupero su un brodo lisogenia (LB) piastra di agar con 50 mg / ml kanamicina e incubare O / N a 37 ° C.
  9. Il giorno seguente, inoculare 6 ml di Super Broth (SB) o di coltura LB contenente 50 ug / ml kanamicina con una colonia dalla piastra di agar LB e cultura O / N a 37 ° C.
    Nota: Colony PCR utilizzando i primer 5 'XmaI-EmGFP e 3' SacI-EmGFP potrebbe essere utilizzata per identificare cloni positivi prima miniprep.
  10. Purificare pET-2F-ZIF-EmGFP da miniprep e confermare plasmide dal sequenziamento del DNA utilizzando promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Espressione e purificazione

  1. Scongelare 50 ml di chimicamente competente BL21 E. coli su ghiaccio e mescolare delicatamente con 100 ng di PET-2F-ZIF-EmGFP plasmid. Trasforma come descritto nei passaggi 1,7-1,8.
  2. Il giorno seguente, inoculare 10 ml di terreno LB contenente 50 mg / ml kanamicina con una singola colonia e crescere O / N a 37 ° C con agitazione.
  3. Il giorno seguente, diluire i 10 ml di O / N cultura in 1 l di terreno LB integrata con 50 mg / ml kanamicina, 0,2% di glucosio e 100 micron ZnCl 2. Crescere la coltura a 37 ° C con agitazione ad una densità ottica a 600 nm (OD 600) di 0,8 e indurre l'espressione di proteine ​​con 2 mM isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Dopo 6 ore di crescita a 37 ° C, le cellule raccolto per centrifugazione a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C.
    Nota: Le condizioni induzione sono molto variabili e dipendono dalla stabilità delle proteine ​​espressi. Monitorare l'OD 600 ogni 30 minuti fino a quando un OD 600 di 0,8 è raggiunto.
  4. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM MgCl 2, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e imidazolo 10 mM, pH 8,0). Lisare le cellule sul ghiaccio di ultrasuoni con la seguente impostazione: uscita di potenza del 50%, 4 min di tempo di processo con 5 sec su / 10 sec off intervalli. Evitare il surriscaldamento della soluzione.
  5. Centrifugare il lisato cellulare a 25.000 xg per 30 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una provetta di raccolta fresco. Per ottenere i migliori risultati, eseguire le seguenti operazioni a 4 ° C.
  6. Eseguire il surnatante con una colonna pre-compresso con 1 ml di equilibrata liquami Ni-NTA. Lavare la resina con 20 ml di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 e imidazolo 30 mM, pH 8,0).
  7. Eluire la proteina con 5 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2, e imidazolo 300 mM, pH 8,0).
  8. Buffer scambiare la proteina eluita con tampone di stoccaggio (50 mMTris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 e 10% glicerolo, pH 8,0) e concentrare la proteina di almeno 40 mM usando un concentratore rotazione mediante centrifugazione secondo le istruzioni del produttore.
  9. Determinare la concentrazione di proteine ​​da BCA o saggio Bradford. Mescolare 2 ml di proteine ​​purificate con 2 ml 2 × SDS-PAGE loading dye, ebollizione a 95 ° C per 10 minuti e poi risolvere il 4% -20% Tris-Glycine SDS-PAGE per valutare la proteina purezza (Figura 2).

3. Protein bagagli

  1. Aliquota la proteina concentrata, flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Per proteine ​​di fusione EmGFP, coprire il tubo con un foglio di alluminio per proteggere la proteina dalla luce.
  2. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti della soluzione proteica. Nota: le proteine ​​Zif-fuse sono stabili in queste condizioni per almeno 1 mese. O> 4 stoccaggio inappropriato mese può portarealle proteine ​​precipitazione o photobleaching di EmGFP.

4. proteina di trasduzione

  1. Mantenere cellule HeLa in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotico-antimicotico a 37 ° C in un ambiente completamente umidificata con 5% di CO 2.
    Nota: Le celle diversi passaggi più di 30 volte non sono raccomandati per la proteina di trasduzione.
  2. Pre-coat una piastra a 24 pozzetti con 500 ml di 50 mg / ml di poli-lisina per 30 a 60 minuti a 25 ° C. Cellule Seed su una piastra da 24 pozzetti ad una densità di 2 x 10 5 cellule per pozzetto. A 24 ore dopo la semina, o una volta cellule sono tra l'80% -90% confluenti, rimuovere i supporti da ciascun pozzetto e lavare con 500 ml di pre-riscaldato DMEM senza siero (SFM).
  3. Per ogni bene, aggiungere 250 ml di SFM contenente 2 mM di proteine ​​Zif-EmGFP e 100 micron ZnCl 2. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora. Nota: i domini ZIF entrano nelle cellule primarily attraverso macropinocitosi, 34 che è un meccanismo di energia-dipendente. Pertanto, le cellule devono essere incubate a 37 ° C per un efficiente internalizzazione proteine.
  4. Rimuovere supporti dalle cellule e lavare tre volte con 500 ml di calcio-magnesio e senza tampone fosfato salino di Dulbecco (DPBS) supplementato con 0,5 mg / ml di eparina. Nota: L'eparina è necessario rimuovere legato alle proteine ​​di superficie che potrebbe complicare le analisi a valle.
  5. (Opzionale) Ripetere i trattamenti fino a tre volte per la consegna maggiore.
  6. Isolare cellule trattate immediatamente dopo eparina lavaggio mediante digestione con 0,05% tripsina-EDTA a 37 ° C per 2 min. Risospendere le cellule staccate in 0,5 ml di DPBS addizionato con 1% FBS.
  7. Misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun campione mediante citometria di flusso 35 utilizzando il canale di isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Figura 3). Regolare il forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) per posizionare la popolazioneinteressi su scala, assicurando che le popolazioni con proprietà differenti vengono risolte tra loro.
  8. Raccogliere 10.000 eventi live per ogni campione e analizzare i dati in citometria a flusso di analisi dei dati del software. 36 Normalizzare fluorescenza da cellule HeLa trattate con ZIF EmGFP a quelle cellule trattate solo con SFM.

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Risultati

Due dita proteine ​​di fusione Zif-EmGFP possono essere espressi in E. coli con> 95% omogeneità e rese elevate (> 25 mg / ml) (Figura 2). In generale, a uno o due dita proteine ​​di fusione ZIF possono essere prodotti in quantità quasi identiche a quelle del wild-type di proteine ​​non modificato. Tuttavia, in alcuni contesti, proteine ​​di fusione ZIF cinque e sei dita sono in grado di essere prodotti in rendimenti abbastanza elevati per applicazioni a valle.

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Discussione

Qui, un protocollo di step-by-step per la consegna delle proteine ​​usando zinc-finger (ZIF) domini cellulari permeabili è presentato. Il dominio ZIF non riduce l'attività del fuso carico enzimatica 34; consente la produzione e purificazione di proteine ​​dei rendimenti quasi identici a quelli osservati con proteine ​​non modificato; e può trasportare proteine ​​ed enzimi in una vasta gamma di tipi di cellule con efficienze superiori peptide o proteina sistemi tradizionali dominio trasd...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (DP1CA174426 di Carlos F. Barbas) e ShanghaiTech University di Shanghai, in Cina (a JL). Grafici molecolari sono stati generati utilizzando PyMol.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
XmaINew England BiolabsR0180L
SacINew England BiolabsR0156L
Expand High Fidelity PCR systemRoche11759078001
dNTPsNew England BiolabsN0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wellsLife TechnologiesEC6028BOX
2x Laemmli Sample BufferBioRad161-0737
T4 DNA LigaseLife Technologies15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coliNew England BiolabsC2527I
IPTGThermo ScientificR0391
Zinc ChlorideSigma-Aldrich208086-5G
Kanamycin SulfateFisher ScientificBP906-5
GlucoseSigma-AldrichG8270-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-25
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-25G
DTTFisher ScientificPR-V3151 
PMSFThermo Scientific36978
Ni-NTA Agarose ResinQIAGEN30210
GlycerolSigma-AldrichG5516-500ML
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsEMO MilliporeUFC900324
DMEMLife Technologies11966-025
Fetal Bovine SerumLife Technologies10437-028
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies15240-062
24-Well Flat Bottom PlateSigma-AldrichCLS3527-100EA
Poly-LysineSigma-AldrichP7280
DPBS, No Calcium, No MagnesiumLife Technologies21600010
Heparan SulfateSigma-AldrichH4777
TrypsinLife Technologies25300054
HeLa cellsATCCCCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704

Riferimenti

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