Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Résumé

Domaines à doigt de zinc sont intrinsèquement perméable cellule et capable de médier la délivrance de protéines dans une large gamme de types de cellules de mammifères. Ici, un protocole étape par étape détaillé pour la mise en œuvre de la technologie à doigt de zinc pour la livraison de protéine intracellulaire est présenté.

Résumé

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys₂-His₂ zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Introduction

Très stratégies de prestation de protéines efficaces et polyvalents sont essentiels pour beaucoup la recherche fondamentale et les applications thérapeutiques. La livraison directe des protéines purifiées dans les cellules représente l'une des méthodes les plus sûres et les plus faciles pour atteindre cet objectif. ^1,2 Contrairement aux stratégies qui se appuient sur ​​l'expression des gènes à partir d'acides nucléiques, ^3-5 délivrance de protéines ne pose pas de risque de mutagenèse insertionnelle, est indépendante de la transcription / machinerie de traduction cellulaire et permet pour un effet immédiat. Cependant, le manque de méthodes simples et généralisables pour doter l'activité pénétrant dans les cellules sur des protéines confond régulièrement leur entrée directe dans les cellules. Les méthodes actuelles pour faciliter la délivrance de protéines intracellulaires sont basés sur l'utilisation d'origine naturelle ou conçus ^08.06 peptides de pénétration cellulaire, ^12.9 domaines de transduction suralimentés, ^13,14 nanoparticules, des liposomes ¹⁵ et ¹⁶ particules pseudo-virales ^17,18 et les matériaux de microsphères polymères. ¹⁹ Malheureusement, plusieurs de ces approches sont entravés par de faibles taux d'absorption cellulaire, ^20,21 mauvaise stabilité, ²² par inadvertance spécificité de type cellulaire, ²³ bas endosomales échappement propriétés ²⁴ et la toxicité. ²⁵ En outre, beaucoup de protéines technologies de transduction de réduire la bioactivité des protéines livrés. ¹⁴

Notre laboratoire précédemment démontré que la nucléase en doigt de zinc (ZFN) protéines - restriction endonucléases chimérique constitué d'un Cys ₂ -His _deux doigt de zinc protéine de liaison à l'ADN programmable et le domaine de clivage de l'endonucléase de restriction FokI ^26-28 - sont intrinsèquement Cell- perméable. ²⁹ Cette activité pénétrant les cellules-surprenant se est révélée être une propriété intrinsèque du domaine en doigt de zinc conçu sur mesure, une plate-forme de liaison à l'ADN qui a émergé comme un outil puissant pour génome ciblé eningé-, ^30-32 et est considéré comme le résultat de la constellation de six résidus chargés positivement sur ​​la surface de la protéine. En effet, plusieurs protéines de liaison à l'ADN, y compris c-Jun et N-DEK ont été démontré qu'ils possèdent une capacité innée à traverser les membranes cellulaires. ³³ Plus récemment, notre laboratoire élargi sur ces résultats et a démontré que l'activité pénétrant dans les cellules du zinc doigt (ZiF) domaines pourraient être mises à profit pour la livraison de protéine intracellulaire. Fusion génétique soit des domaines de ZIF une ou deux doigts à la cargaison de protéine spécifique conduit à l'absorption efficacité qui dépassaient de nombreux systèmes de livraison classiques de peptides de pénétration cellulaire. ³⁴ Plus particulièrement, la livraison ZiF médiation n'a pas compromis l'activité de fret enzymatique fusionné et facilité des niveaux élevés de livraison cytosolique. Collectivement, ces résultats démontrent le potentiel du domaine ZiF pour faciliter la prestation efficace et facile de protéines, et potentiellement plus divers types de macromolécules, dans les cellules.

Ici, un protocole étape par étape détaillées sur la façon de mettre en œuvre la technologie ZIF pour la distribution des protéines dans les cellules de mammifères sont présentées. Nous avons déjà construit une suite de un, deux, trois, quatre, cinq et six doigt des domaines ZIF qui ne ont pas la capacité de lier l'ADN, en raison de la substitution de chacun des résidus de liaison à l'ADN α-hélicoïdale, mais sont capables de délivrer des protéines dans des cellules ³⁴ (figure 1). La production et la transduction de Emerald GFP (EmGFP) dans des cellules HeLa en utilisant un domaine ZiF deux doigt est décrite. Ce protocole est extensible à presque ne importe quelle protéine soluble capable d'expression dans Escherichia coli et presque ne importe quel type de cellule de mammifère. Les résultats attendus sont fournis et des stratégies pour maximiser la performance de ce système sont également discutés.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Clonage

1. Obtenir deux doigts domaines ZIF substitution alanine qui ont été sous-clonés dans le système de vecteur d'expression pET-28 et sont disponibles sur demande (PET-2F-ZiF). ³⁴
2. Amplifier par PCR à partir du plasmide EmGFP Emerald-pBAD avec les amorces 5 'Xmal-EmGFP (5'-CCCGGG GGAAATTG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xmal place en gras) et 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG GAGCTC-3' ; Sac I site en gras).
   1. Utilisez 5 ng d'ADN matrice, 10 ul de tampon 10X de la polymérase, une unités (U) de Taq ADN polymerase, 0,2 mM de chaque dNTP et 0,2 uM de chaque amorce dans une solution de 100 pi avec le volume restant constitué d'eau distillée / désionisée . Utiliser les conditions de cyclisme: 95 ° C pendant 5 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 sec et 72 ° C pendant 1 min; 72 ° C pendant 10 min. Purifier le produit PCR par gel extractiet à déterminer la concentration d'ADN en utilisant un spectrophotomètre mesurant Abs ₂₆₀ x 50 ug / ml.
3. Digest pET-2F-ZiF et l'insert codant EmGFP avec les enzymes de restriction Xmal et Sac I dans le tampon recommandé pendant 3 heures à 37 ° C en utilisant 10 U d'enzyme par 1 ug d'ADN. Visualiser l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant un colorant d'intercalation fluorescent, tel que le bromure d'éthidium.
4. Purifier l'ADN digéré par le kit d'extraction sur gel et déterminer la concentration d'ADN par un spectrophotomètre mesurant Abs ₂₆₀ x 50 ug / ml.
5. Ligaturer l'ADN codant EmGFP purifié dans 50 à 100 ng de pET-2F-ZiF en utilisant 1 U de T4 DNA Ligase pendant au moins 1 h à température ambiante. Pour de meilleurs résultats, effectuer la réaction de ligature en utilisant un rapport de 6: 1 insert-à-vecteur molaire.
6. Thaw 50 pi de toute cellules XL-1 coli Bleu Escherichia chimiquement compétentes sur la glace et mélanger doucement avec 10-20 ng d'ligaturé pET-2F-ZiF-EmGFP.
7. Gardez sur la glace pendant 30 min. choc thermique le mélange à 42 ° C pendant 90 secondes et récupérer les cellules dans 2 ml de bouillon de Super optimale avec la répression catabolique (SOC) pendant 1 heure à 37 ° C avec agitation.
8. Étaler 100 pi de la culture de récupération sur un bouillon de lysogénie (LB) plaque de gélose avec 50 ug / ml de kanamycine et incuber O / N à 37 ° C.
9. Le lendemain, inoculer 6 ml de Super Broth (SB) ou à la culture LB contenant 50 pg / ml de kanamycine avec une colonie de la plaque de gélose LB et la culture O / N à 37 ° C.
   Remarque: colonie PCR en utilisant les amorces 5 'Xmal-EmGFP et 3' Sacl-EmGFP pourrait être utilisée pour identifier des clones positifs avant Miniprep.
10. Purifier pET-2F-ZiF-EmGFP par miniprep et confirmer plasmide par séquençage d'ADN en utilisant le promoteur T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Expression et purification

1. Décongeler 50 pi de chimiquement compétente BL21 E. coli cellules sur la glace et mélanger doucement avec 100 ng de PET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformez comme décrit dans les étapes 1.7 à 1.8.
2. Le lendemain, inoculer 10 ml de milieu LB contenant 50 ug / ml de kanamycine avec une colonie unique et faire croître O / N à 37 ° C avec agitation par secousses.
3. Le jour suivant, les diluer 10 ml de culture O / N dans 1 L de milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine, 0,2% de glucose et 100 uM _ZnCl2. Cultiver la culture à 37 ° C avec agitation par secousses à une densité optique à 600 nm _(DO600) de 0,8 et induire l'expression de la protéine avec 2 mM d'isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Après 6 heures de croissance à 37 ° C, les cellules de récolte par centrifugation à 5000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
   Nota: conditions d'induction sont très variables et dépendent de la stabilité des protéines est exprimé. Surveiller la DO ₆₀₀ toutes les 30 minutes jusqu'à ce qu'une DO ₆₀₀ de 0,8 soit atteint.
4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de _ZnCl2, 1 mM dithiothréitol (DTT), 1 mM de _MgCl2, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et de l'imidazole 10 mM, pH 8,0). Lyse des cellules sur la glace par ultrasons avec le réglage suivant: sortie de puissance de 50%, 4 min temps de processus avec 5 sec sur / 10 sec éteint intervalles. Éviter la surchauffe de la solution.
5. Centrifuger le lysat cellulaire à 25 000 xg pendant 30 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau tube de collecte. Pour de meilleurs résultats, effectuer toutes les étapes suivantes à 4 ° C.
6. Exécuter le surnageant à travers une colonne pré-garnie de 1 ml d'une suspension équilibrée de Ni-NTA. Laver la résine avec 20 ml de tampon de lavage (50 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de _ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM MgCl ₂ et 30 mM d'imidazole, pH 8,0).
7. Eluer la protéine avec 5 ml de tampon d'élution (50 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de _ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de _MgCl2, et 300 mM d'imidazole, pH 8,0).
8. Tampon échanger la protéine est éluée avec un tampon de stockage (50 mMTris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 uM de _ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de _MgCl2 et 10% de glycerol, pH 8,0) et on concentre la protéine à au moins 40 uM en utilisant un concentreur centrifuge par centrifugation selon les instructions du fabricant.
9. Déterminer la concentration de protéines par BCA ou dosage de Bradford. Mélanger 2 ul de protéines purifiées avec 2 pi 2 × SDS-PAGE colorant de charge, faire bouillir à 95 ° C pendant 10 min, puis résoudre le 4% à 20% de Tris-Glycine SDS-PAGE pour évaluer la pureté de la protéine (figure 2).

3. Protéines de stockage

1. Aliquoter la protéine concentrée, gel rapide dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Pour les protéines de fusion EmGFP, couvrir le tube de papier d'aluminium pour protéger la protéine de la lumière.
2. Évitez congélation et décongélation de la solution de protéine répétée. Remarque: protéines ZiF fusionnés sont stables dans ces conditions pendant au moins un mois. Ou> 4 stockage inapproprié de mois peut conduireà la précipitation des protéines ou des EmGFP photoblanchiment.

4. Protéines de transduction

1. Maintenir des cellules HeLa dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% (v / v) de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% d'antibiotique-antimycotique à 37 ° C dans une atmosphère complètement humidifiée avec 5% de CO _2.
   Note: Les cellules des passages plus de 30 fois ne sont pas recommandés pour la protéine de transduction.
2. Pré-enduire une plaque à 24 puits avec 500 ul de 50 ug / ml de poly-lysine pendant 30 à 60 min à 25 ° C. cellules de semences sur une plaque de 24 puits à une densité de 2 x 10 ⁵ cellules par puits. À 24 h après le semis, ou une fois les cellules sont entre 80% -90% de confluence, retirer les supports de chaque puits et laver avec 500 pi de DMEM sans sérum préchauffé (AFD).
3. Pour chaque puits, ajouter 250 pi de GDF contenant 2 uM de la protéine ZiF-EmGFP et 100 uM ZnCl _2. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: ZIF domaines pénètrent dans les cellules primarily travers macropinocytose, ³⁴ qui est un mécanisme dépendant de l'énergie. Par conséquent, les cellules doivent être incubées à 37 ° C pendant une internalisation efficace de la protéine.
4. Retirez le support de cellules et laver trois fois avec 500 ul de calcium et sans magnésium tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (DPBS) supplémenté avec 0,5 mg / ml d'héparine. Remarque: L'héparine est nécessaire pour éliminer la protéine liée à la surface qui pourraient compliquer les analyses en aval.
5. (Facultatif) Les traitements répétés jusqu'à trois fois pour une meilleure exécution.
6. Isoler les cellules traitées immédiatement après l'héparine lavage par digestion avec 0,05% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 2 min. Remettre en suspension les cellules détachées dans 0,5 ml de DPBS supplémenté avec 1% de FBS.
7. Mesurer l'intensité de fluorescence de chaque échantillon par cytométrie de flux en utilisant le canal ³⁵ l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (figure 3). Réglez la diffusion vers l'avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) à placer la population deintérêt à l'échelle, en assurant que les populations ayant des propriétés différentes sont réglées l'une de l'autre.
8. Recueillir 10 000 événements en direct pour chaque échantillon et d'analyser les données en utilisant la cytométrie en flux analyse des données logiciel. ³⁶ Normaliser la fluorescence de cellules HeLa traitées avec ZiF-EmGFP à ces cellules traitées seulement avec GDF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Deux doigts protéines de fusion ZiF-EmGFP peuvent être exprimées dans E. coli avec> 95% d'homogénéité et des rendements élevés (> 25 mg / ml) (Figure 2). En général, un ou deux doigts protéines de fusion ZIF peuvent être produites en quantités presque identiques à celles de type sauvage protéine non modifiée. Toutefois, dans certains contextes, des protéines de fusion ZiF cinq et six doigts ne peuvent pas être produits avec des rendements suffisamment élevés pour l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ici, un protocole étape par étape, pour la délivrance de protéines à doigt de zinc en utilisant (ZiF domaines cellulaires) perméable est présentée. Le domaine ZiF ne réduit pas l'activité enzymatique de la cargaison ³⁴ condensé; permet la production et la purification de protéines avec des rendements pratiquement identiques à celles observées avec la protéine non modifiée; et peut transporter des protéines et des enzymes dans un large éventail de types de cellules avec des rendements qui...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
XmaI	New England Biolabs	R0180L
SacI	New England Biolabs	R0156L
Expand High Fidelity PCR system	Roche	11759078001
dNTPs	New England Biolabs	N0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells	Life Technologies	EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer	BioRad	161-0737
T4 DNA Ligase	Life Technologies	15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coli	New England Biolabs	C2527I
IPTG	Thermo Scientific	R0391
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086-5G
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP906-5
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-25
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
DTT	Fisher Scientific	PR-V3151
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ni-NTA Agarose Resin	QIAGEN	30210
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ML
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	EMO Millipore	UFC900324
DMEM	Life Technologies	11966-025
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-028
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
24-Well Flat Bottom Plate	Sigma-Aldrich	CLS3527-100EA
Poly-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
DPBS, No Calcium, No Magnesium	Life Technologies	21600010
Heparan Sulfate	Sigma-Aldrich	H4777
Trypsin	Life Technologies	25300054
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704