Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

Resumen

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Resumen

Infecciones del tracto urinario (ITU) son altamente prevalentes, una causa importante de morbilidad y son cada vez más resistentes al tratamiento con antibióticos. Las mujeres se ven desproporcionadamente afectados por la UTI: 50% de todas las mujeres tendrán una infección urinaria en su vida. Además, el 20-40% de estas mujeres que tienen una inicial UTI sufrirá una recurrencia con algunas recurrencias frecuentes que sufren con grave deterioro en la calidad de vida, el dolor y el malestar, la interrupción de las actividades diarias, el aumento de los costes sanitarios, y pocas opciones de tratamiento otra que la profilaxis antibiótica a largo plazo. Uropatógena Escherichia coli (UPEC) es el agente causal principal de la UTI adquirida en la comunidad. IU asociada al catéter (ITUAC) es el hospital infección adquirida más común que representa un millón de ocurrencias en los EE.UU. cada año y los costes sanitarios dramáticos. Mientras UPEC es también la principal causa de infección urinaria, otros agentes causantes son de una mayor importancia incluyendo Enterococcusfaecalis. Aquí utilizamos dos modelos bien establecidos de ratón que recapitular muchas de las características clínicas de estas enfermedades humanas. Para IU, un modelo C3H / HeN recapitula muchas de las características de la UPEC virulencia observadas en los seres humanos, incluyendo las respuestas de acogida, formación de IBC y filamentation. Para ITUAC, un modelo utilizando ratones C57BL / 6, que retienen los implantes de catéter de la vejiga, se ha demostrado ser susceptibles a E. faecalis infección de la vejiga. Estos modelos representativos se están utilizando para obtener nuevos conocimientos sorprendentes sobre la patogénesis de la enfermedad de IU, que está llevando al desarrollo de nuevas terapias y estrategias de gestión o de prevención.

Introducción

Infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las infecciones bacterianas más comunes y se pueden dividir en dos categorías basadas en el mecanismo de la adquisición, la comunidad y nosocomial adquirida UTI. Infecciones urinarias a menudo ocurren en mujeres y estudios por lo demás sanos adquirida en la comunidad han demostrado que aproximadamente el 50% de las mujeres tendrán al menos una infección urinaria en su vida ^1. Además, la recurrencia es un problema importante. Una mujer que tiene una infección aguda inicial Ocasión 25-40% de tener una segunda infección dentro de los seis meses a pesar del tratamiento antibiótico adecuado y muchas mujeres siguen teniendo recurrencias frecuentes ^2. Las bacterias que causan estas infecciones son cada vez más los protocolos de tratamiento cada vez más resistentes a los antibióticos de confusión ^3-6. IU afecta a millones de personas cada año cuesta aproximadamente 2,5 millones de dólares en gastos relacionados con el cuidado de la salud en los EE.UU., lo que subraya el impacto y la prevalencia de la enfermedad1,7 .Nosocomial adquirió las ITU se asocian principalmente con la presencia de cuerpos extraños tales como catéteres permanentes. Infecciones urinarias asociadas a catéter (ITUAC) siguen siendo los nosocomial más común adquirida IU, lo que representa ~ 70-80% de estas infecciones ^8. Además, ITUAC se asocia con aumento de la morbilidad y la mortalidad y es la causa más común de infecciones del torrente sanguíneo secundarias ^9.

UPEC comunidad asociada adquirida UTI se cree que es causada por la introducción de bacterias en la vejiga de los embalses en el tracto gastrointestinal a través de la manipulación mecánica durante la relación sexual, la falta de higiene u otras dinámicas de población microbiana entre los diferentes nichos de acogida ^10. Una vez dentro de la vejiga, UPEC emplean numerosos factores de virulencia, incluyendo cápsula, sistemas de adquisición de hierro, toxinas, un plásmido de virulencia, tRNAs, islas de patogenicidad y factores de colonización que han demostrado desempeñar un papel en la patogénesis ^{11-14. Fundamental para el establecimiento de la UPEC la colonización, la UPEC también codifican múltiples tipos de chaperón adhesiva ujier vía (CUP) pili que reconocen los receptores con especificidad estereoquímica 15. Tipo 1 pili, punta con la adhesina FimH, se expresan por la UPEC y se unen uroplaquinas 16 y α-1, β-3 integrinas 17, que se expresan en la superficie luminal de las dos vejigas humanas y de ratón 18 manosilado. Estas interacciones FimH mediada facilitan la colonización bacteriana y la invasión de las células epiteliales superficiales 19,20. Una vez dentro de la célula, UPEC puede escapar al citoplasma, donde una sola bacteria puede dividirse rápidamente para formar una comunidad bacteriana intracelular (IBC), que, tras la maduración, puede contener ~ 10 4 bacterias 21. Formación de IBC se ha demostrado en al menos seis diferentes cepas de ratón, C3H / gallina, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / NJ y BALB / c, y con una amplia variedad de UPECepas C y otras enterobacterias 22-24. Sin embargo las diferencias temporales y espaciales de la formación de IBC pueden variar dependiendo de los antecedentes del ratón y la cepa UPEC infectar. En ratones C3H / HeN infectadas con el prototipo de la UPEC cepas UTI89 o la formación CFT073, IBC pueden ser visualizados como pequeños biomasas de bacterias ya en 3 hpi (infección post hr). Esta comunidad sigue creciendo y alcanza un "punto medio" de desarrollo aproximadamente 6 hpi cuando las bacterias en forma de barra ocupan un gran porcentaje del espacio citoplásmico de células paraguas superficiales diferenciadas terminalmente Estos forma temprana los GRG de una manera relativamente sincrónica con la mayoría presentan dimensiones similares y morfologías. ~ 8 hpi las bacterias en el cambio de un IBC bacilos a cocos morfología. RIG son de naturaleza transitoria. Por lo tanto, IBC maduración 12-18 resultados hpi en continua expansión de la población bacteriana, seguida de su filamentation y la dispersión de la conexión wi celularth propagación posterior a las células vecinas 23. Por lo tanto, el nicho IBC permite rápido crecimiento bacteriano en un entorno protegido de las respuestas y antibióticos 25 inmune del huésped. Las distintas etapas de la infección UPEC que se ven en ratones también se observan en los seres humanos, tales como los RIG y filamentación, apoyando el modelo de ratón de infección del tracto urinario como una herramienta beneficiosa que puede ser utilizado para modelar UTI en los seres humanos 22,26-28.}

Si bien la mayoría de las mujeres experimentan una infección urinaria en su vida, el resultado de estas infecciones puede variar desde una infección autolimitada aguda sin recurrencia, a la cistitis recurrente frecuente. Además, los estudios han mostrado una fuerte incidencia familiar de IU, lo que sugiere un componente genético contribuye a la susceptibilidad UTI ^29. Hemos encontrado que los resultados UTI diferentes visto en las clínicas pueden ser reflejadas por los distintos resultados de la infección experimental UPEC entre puras cepas de ratón ^30. Por ejemplo, C3H / gallina, CBA, Los ratones DBA, y C3H / HeOuJ son susceptibles, en una forma dependiente de la dosis infecciosa, a la larga duración cistitis, crónica que se caracteriza por, bacterias alto título de persistentes (> 10 ⁴ unidades formadoras de colonias (ufc) / ml), bacterianas alto título cargas de la vejiga en el sacrificio> 4 semanas después de la infección (WPI), inflamación crónica y necrosis urotelial. Estos ratones también muestran niveles séricos elevados de IL-6, G-CSF, KC, y IL-5 dentro de la primera 24 hpi que sirven como biomarcadores para el desarrollo de la cistitis crónica. Esto puede representar con precisión el curso natural de la infección urinaria en algunas mujeres, ya que los estudios con placebo han demostrado que un gran porcentaje de las mujeres que experimentan ITU mantendrá altos niveles de bacterias en la orina durante varias semanas después de los primeros síntomas de la cistitis, si no se da tratamiento antibiótico ^{31 , 32.} Además, el uso de ratones C3H / HeN, se encontró que una historia de la cistitis crónica es un factor de riesgo significativo para posteriores infecciones recurrentes graves. IU recurrente es el más simanifestación clínica gnificant de IU y el ratón C3H / gallina es actualmente el único modelo estudiado que recapitula una mayor predisposición después de la exposición anterior. Un segundo resultado UTI se recapitula en ratones C57BL / 6, donde la infección aguda UPEC es autolimitada, con la resolución de la inflamación de la vejiga y la bacteriuria plazo aproximado de una semana. Curiosamente, en este modelo, UPEC formar fácilmente reservorios intracelulares quiescentes dentro del tejido de la vejiga de la que UPEC son capaces de salir de un estado latente para reiniciar una UTI activo, potencialmente explicar un mecanismo para misma cepa IU recurrente en seres humanos ^{33, 34.}

Además de las influencias genéticas en UTI susceptibilidad, la introducción de un catéter en la vejiga aumenta en gran medida la probabilidad de tener una infección, así como el aumento de la gama de bacterias capaces de causar una infección. Se ha demostrado que el cateterismo urinario humano provoca histológico ycambios inmunológicos en la vejiga debido a la tensión mecánica que se traduce en una respuesta inflamatoria robusta, exfoliación, edema de la lámina propia y submucusa, adelgazamiento urotelial, y lesión de la mucosa del urotelio y riñón ^35,36. Además, el catéter proporciona una superficie para la unión bacteriana a crear un entorno utilizado por varias especies de causar ITUAC. Mientras UPEC siguen siendo un importante contribuyente, Enterococcus faecalis representa el 15% de estos ITUAC ^37. E. faecalis es cada vez más resistente a los antibióticos con vancomicina aparición de resistencia, lo que plantea un problema de salud grave ^38. E. faecalis poseen numerosos factores de virulencia, incluyendo las toxinas y adhesinas necesarias para la unión a tanto el catéter y el epitelio ^38. Durante el cateterismo urinario, el anfitrión es vulnerable a la adhesión microbiana, multiplicación y diseminación en el ^39,40 de las vías urinarias. E. Faecalis forma una biopelícula en el catéter, como parte de un mecanismo de persistir en la vejiga y difundir a los riñones, que se reproduce en un modelo de ratón ITUAC ^41. Recientemente, se ha demostrado durante la cateterización urinaria, fibrinógeno (Fg) se libera en la vejiga, como parte de la respuesta inflamatoria. Fg se acumula en la vejiga, recubre el catéter y es esencial para E. faecalis la formación de biopelículas, que funciona como un andamio archivo adjunto. En un modelo de ratón C57BL / 6 de ITUAC, descubrimos que E. la formación de biopelículas faecalis en el catéter, y por lo tanto la persistencia en la vejiga, era dependiente de la pilus Ebp, específicamente su EBPA adhesina tip. Se encontró que el dominio N-terminal de EBPA se une específicamente a FG revestir el catéter. Además, se encontró que E. faecalis utiliza Fg como fuente metabolito durante la infección, mejorando así la formación de biopelículas ^42.

Los modelos de ratón han demostrado ser fundamental para understanding, así como la predicción de las manifestaciones clínicas de la infección del tracto urinario y la infección urinaria ^41. En este artículo se demuestra la preparación del inóculo de la cistitis UPEC aislamos UTI89 e inoculación transuretral de ratones C3H / HeN. Además, demostramos un protocolo para la inserción del catéter en ratones C57BL / 6 y la inoculación de la E. cepa faecalis OG1RF. Ambas técnicas conducen a UTI consistente y fiable o ITUAC en ratones. También mostramos técnicas utilizadas para observar la formación de IBC durante la cistitis aguda y de recogida de orina para el análisis de la cistitis crónica o recurrente. Ratones C3H / HeN se han utilizado para estudiar los aspectos de la UPEC patogénesis incluyendo invasión bacteriana inicial, la formación IBC, filamentación y el desarrollo de la cistitis crónica ^23,33,43. Estos parámetros de virulencia también se han estudiado en una variedad de otros antecedentes de ratón ^22,33. Para ITUAC, el / modelo C57BL 6 permite la implantación de un cuerpo extraño en la vejiga con la posterior co bacterianaionización, que se puede mantener durante 7 días después de la infección ^41. Estos modelos han sido útiles para la evaluación de los mecanismos de virulencia bacteriana, las respuestas del huésped a IU y mecanismos para subvertir las respuestas de acogida, gran parte del cual ha sido posteriormente recapituladas u observadas en las poblaciones humanas clínicos.

Protocolo

Declaración de Ética: La Comisión de Estudios Animal de la Universidad de Washington aprobó todas las infecciones del ratón y procedimientos como parte del protocolo número 20120216, que fue aprobado y expira 11/01/2013 11/01/2016. El cuidado general de los animales fue consistente con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y la Guía de Recursos de Cuidado de Animales del USDA. Procedimientos de eutanasia son consistentes con las "directrices AVMA para la eutanasia de animales 2013 edición."

1. UPEC Protocolo UTI, Inoculación Preparación de la aguja (Figura S1)

1. Retire la tapa de la aguja de 30 G. Hilo de aproximadamente 1 pulgada de tubo de PE10 sobre el eje de la aguja. UV esterilizar los conjuntos de aguja durante la noche. Agujas sondaje se pueden almacenar indefinidamente en placas de Petri estériles.

2. Preparación del inóculo bacteriano UPEC

1. Preparar UTI89 inóculo (inicio de 72 horas antes de la inoculacióndía ción)
   1. Streak UTI89 sobre una LB (Luria-Bertani) placa de agar de una madre congelada. Incubar durante la noche a 37 ° C. Escoja una colonia e inocular en 10 ml de LB en un matraz de 125 ml. Se incuba a 37 ° C durante 24 horas, de forma estática.
   2. Inocular 10 l de cultivo durante la noche en 10 ml de LB en un nuevo frasco de 125 ml para una 24 horas adicionales a 37 ° C, de forma estática.
   3. Transferencia de 3 ml (varían en función de la tensión y el tamaño del inóculo se desea) a estériles tubos de 1,5 ml y se centrifuga a 7000 g durante 3 min y resuspender el precipitado en 1x PBS y centrifugar por segunda vez. Resuspender el sedimento bacteriano en 1 ml de PBS 1x.
2. Medir la densidad óptica bacteriana y ajustar la concentración de la densidad de inóculo deseado. La concentración estándar del inóculo utilizado es 10 ⁷ bacterias; sin embargo, esto puede variar debido al diseño del estudio.

3. La inoculación bacteriana

1. Limpiar la estación de trabajo con etanol al 70% y cen el borde con papel absorbente (o utilice campana de flujo estéril).
2. Dibuja hasta 0,9 ml del inóculo bacteriano preparado en un 1 ml (TB) de la jeringa (quitar las burbujas de aire). Coloque una aguja de inoculación estéril preparada con tubería PE10, en la jeringa que contiene el inóculo, a continuación estérilmente recortar el tubo de polietileno.
   NOTA: Dejar 1 mm de tubo por encima de la punta de la aguja para evitar la punción de la vejiga.
3. Corte un pedazo cuadrado de 1 pulgada de parafina y poner un poco de lubricante quirúrgico (aproximadamente del tamaño de una moneda de diez centavos) en la parte superior.
4. Anestesiar ratones C3H / HeN femeninos poniéndolos en un frasco de vidrio 32 oz que contiene una bola de té-infusor con bolas de algodón empapadas con 3 ml de isoflurano o cámara vaporizador (siguiendo fabrica protocolo) hasta inconsciente pero todavía respirando normalmente (1 respiración / seg) .
   NOTA: Algunos comités IACUC no aprueban el uso de un frasco o vaporizador. Por favor, siga la indicación del comité IACUC de su institución.
   NOTA: Si el tarro de cristalcon té-ball y / o cono de la nariz con se utilizan bolas de algodón-isoflurano soakd, el animal debe ser observado cuidadosamente para evitar una sobredosis de anestesia y la muerte. La ventaja de usar una cámara de vaporizador y la anestesia es que proporciona la administración de isoflurano controlada que evita sobredosis accidentales. PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico de inhalación. Use en un área bien ventilada y minimizar la inhalación.
5. Retire el ratón de la jarra / vaporizador y colocarlo en la espalda a una toalla de papel y extender las piernas.
6. Cubrir la nariz del ratón con un cono de la nariz (un tubo conectado al vaporizador que proporciona una dosis controlada isoflurance que viene equipado en algunas unidades de vaporizador) o 50 ml tubo cónico con una bola de algodón que contiene una pequeña cantidad (aproximadamente 1-2 ml ) de isoflurano.
7. Palpitar suavemente la vejiga para inducir la micción y garantizar una vejiga anulado. Limpie el área periuretral con etanol al 100% limpie. Frote la aguja de inoculación / jeringa, punto primero, en ellubricante quirúrgico.
8. Inocular cada ratón con 50 l de la solución de bacterias mediante la inserción de la aguja transuretral de la inoculación, aproximadamente 12 mm, y presionando hacia abajo el émbolo de la jeringa suavemente para dispensar el inóculo en la vejiga suavemente (10 l / seg). Retire la aguja de inoculación del ratón.
   NOTA: el retorno inmediato de inóculo en la abertura de la uretra al empezar a inocular indica la inserción incorrecta o incompleta de la aguja.
9. Retire el ratón de cono de la nariz y devolverlo a su jaula. Repita los pasos 3.3 a 3.8 para cada ratón. Cuando / si indicador del estado de inóculo / cepas, deseche la jeringa y la aguja de inoculación en un contenedor de objetos punzantes aprobado y empezar de nuevo el paso 3.2.
   NOTA: La inoculación con organismos uropatógenos generalmente no causa síntomas de dolor severo. Sin embargo, en raras ocasiones, la administración de grandes dosis de patógenos puede causar fiebre, disminución de la ingesta de alimentos y el agua y el comportamiento anormal. LANimal salud debe ser monitoreado durante todo el experimento. Si los síntomas de dolor son evidentes aviso, un analgésico, como la buprenorfina (0,05-,1 mg / kg por vía subcutánea), se puede aplicar. Los procedimientos deben estar de acuerdo con IACUC de cada institución.

4. Determinación de las cargas bacterianas

1. Preparar separadas tubos de 5 ml por cada vejiga y los riñones par que se recogerá. Añadir 1 ml de PBS 1x / tubo / vejiga ratón para ser cosechado. Añadir 0,8 ml de PBS 1x / tubo / par de riñones de ratones que se recogerá. Etiqueta de cada tubo para corresponder a un ratón dado. Preparar una placa de 96 pocillos que contenía 180 l de 1x PBS en cada pocillo para 01:10 diluciones en serie.
2. Limpie el área de trabajo con etanol al 70% y cubrir la zona con una tapa o papel toalla absorbente.
3. Anestesiar el ratón con isoflurano (véase el paso 3.4) hasta que el ratón deja de respirar durante aproximadamente 1 min, luego se coloca en la tapa o papel toalla absorbente. Otros métodos de euthanasia también son aceptados por los comités IACUC, tales como dióxido de carbono, y puede ser sustituido por sobredosis de isoflurano.
4. Sacrificio el ratón por dislocación cervical rápido que consiste en restringir el cuello en la base de la cabeza y tirando de la cola horizontalmente lejos del cuerpo hasta que se produce la dislocación.
   NOTA: La mayoría de los comités IACUC requieren un medio secundario de la eutanasia y la dislocación cervical es un método común. Sin embargo, otros métodos pueden ser utilizados si son aprobados por el comité de IACUC.
5. Coloque el ratón muerto en su parte posterior y rociar etanol al 70% en el abdomen. Diseccionar el ratón, cosechar la vejiga y los riñones, en ese orden para minimizar la contaminación potencial de la sangre después de la disección del riñón. Coloca los órganos de forma independiente en los preparados tubos de 5 ml que contienen 1x PBS (consulte el paso 4.1).
   NOTA: Use tijeras diferentes para la disección externa y para la extracción de órganos para reducir al mínimo la contaminación.
6. Toque en el tubo para asegurar que los órganos están en tél 1x PBS. Repita el paso 4.3 a 4.5 para cada ratón. Tijeras y pinzas limpias en etanol al 70% después de cada ratón.

5. Recuperación bacteriana

1. Homogeneizar la vejiga y los riñones cosechada en los tubos de 5 ml con un homogeneizador de tejidos, 15 seg por el riñón y 30 segundos por vejiga. Enjuague secuencialmente homogeneizador en 1x PBS, etanol al 70% y 1x PBS entre las muestras.
2. Hacer diluciones seriadas 1:10 a 10 ^-8 y la placa de dilución para cada CFU (unidades formadoras de colonias) en placas de agar LB. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche y contar las colonias al día siguiente.

6. Enumeración IBC

1. Eliminar asépticamente la vejiga y colocarlo en PBS 1x en una placa de 6 pocillos con fondo silicona. Las placas se pueden preparar usando un kit de elastómero de silicona y verter aproximadamente 1 cm de silicona en cada pocillo, ver instrucciones del fabricante. Cortar la vejiga por la mitad con unas tijeras.
2. El uso de pernos de metal pequeñas splay suavemente el bladder de manera que el lumen de la vejiga quede hacia arriba. Asegúrese de colocar los pasadores en los bordes exteriores de las secciones de la vejiga para asegurar la cantidad máxima de urotelio se expone.
3. Después de ensanchamiento, lavar suavemente la vejiga una vez con PBS 1x. Retire la PBS 1x por pipeta. Fijar la vejiga mediante la adición de suficiente 3% de paraformaldehído para cubrir toda la vejiga extendidas. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es cancerígeno. Equipo de protección adecuado, incluyendo guantes, se debe usar en todo momento. La eliminación debe seguir las directrices institucionales.
4. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Retire solución de paraformaldehído. Lavar una vez con PBS 1x.
5. Lavar con solución de lavado LacZ (2 mM _MgCl2, 0,01% de desoxicolato de sodio y 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) tres veces durante 5 minutos por lavado.
6. Retire la solución de lavado y añadir suficiente mancha LacZ (9,5 ml de solución de lavado LacZ, 0,4 ml 25 mg / ml de X-gal y 0,1 ml de 100 mM de K-ferrocianuro / K-ferricianuro) para cubrir las vejigas. Se incuba a 30 ° C overniGHT protegido de la luz.
7. Retire vejigas extendidos de la incubadora y observar los RIG, que aparecen como puntos lagrimales azul como se visualiza con un microscopio de disección, ampliación 40-60X.
   NOTA: A veces un ratón puede orinar antes de la colocación del tubo debajo de la uretra. En este caso, espere 15 a 20 minutos antes de tratar de recoger la orina de nuevo.

7. La orina Colección de bacteriuria CFU Enumeración (No aplicable para ITUAC)

1. Para recoger la orina antes o después de la infección frenar suavemente el ratón mediante la celebración de la cola y colocarlo sobre una superficie plana elevada (parte superior de la jaula del ratón).
2. Mantenga un tubo de 1,5 ml estéril debajo de la uretra ratón. Presione suavemente en la parte posterior del ratón cerca de la cola para aplicar presión en la vejiga. Atrapa la orina en el tubo de 1,5 ml.
3. Hacer diluciones seriadas 1:10 a 10 ^-7 y placa cada dilución en LB. apropiada Incubar las placas a 37 ° C durante la noche y contar las colonias al día siguiente.

8. ITUAC Protocolo Modelo, Catéter Preparación Agujas de ITUAC Modelo (Figura S2)

1. Retire la tapa de la aguja de 30 G. Corte un pedazo de tubo de 7 mm PE10 y 5 mm trozo de tubo de silicona como RenaSIL. Enhebrar la aguja con un tubo PE10 hasta que el tubo toca la base de la aguja.
2. Luego de comer la pieza 5 mm en la aguja que contiene PE10. UV esterilizar las asambleas agujas durante la noche.
   NOTA: Al cargar el tubo de silicona, deje aproximadamente 1 mm de la tubería que se extiende más allá de la punta de la aguja.

9. E. faecalis OG1RF bacteriana Preparación del inóculo

1. Preparar el inóculo de partida OG1RF 48 hr antes de la inoculación días. Streak OG1RF sobre una placa BHI (infusión de cerebro corazón) a partir de una acción congelada.
2. Escoja una colonia e inocular en 10 ml de BHI y crecer estáticamente durante 18 horas a 37 ° C. Centrifugar la cultura y lavar el pellet (3 veces) en volúmenes de 1 ml de PBS 1x estéril.
3. Resuspender el sedimento bacteriano en PBS 1x. Medir la densidad óptica bacteriana y ajustar la concentración a la tamaño del inóculo deseado. La concentración estándar del inóculo utilizado es 10 ^7; sin embargo, esto puede variar debido al diseño del estudio

10. Catéter de implantación

1. Limpie la estación de trabajo con 70% de etanol y cubrir la zona con una cubierta absorbente (o usar campana de flujo estéril).
2. Conecte el catéter de aguja a un vacío de 1 ml (TB) de la jeringa. Corte un pedazo cuadrado de 1 pulgada de parafina y poner un poco de lubricante quirúrgico (aproximadamente del tamaño de una moneda de diez centavos) en la parte superior.
   NOTA: Dos agujas de diferentes se utilizan para la deposición del catéter y para el inóculo de la inoculación accidental minimizado debido a la manipulación mecánica necesaria para la implantación del catéter. Esto también permite la conveniencia de la preparación de un menor número de agujas de inoculación.
3. Anestesiar C57BL / 6 ratones poniéndolos en un frasco de vidrio 32 oz contiene un tébola -infuser con bolas de algodón empapadas en 3 ml de isoflurano o cámara vaporizador (siguiendo fabrica protocolo) hasta inconsciente pero todavía respirando normalmente (1 respiración / seg).
4. A continuación, poner el ratón sobre la espalda a una toalla de papel y extender las piernas. Cubrir la nariz del ratón con un cono de nariz o 50 ml tubo cónico con bolas de algodón que contienen una pequeña cantidad (aproximadamente 1-2 ml) de isoflurano.
   PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico de inhalación. Use en un área bien ventilada y minimizar la inhalación por el investigador.
5. Palpitar suavemente la vejiga para inducir la micción y garantizar una vejiga anulado. Limpie el área periuretral con un 100% de etanol limpie.
6. Desinfectar la zona periuretral con 10% de solución de povidona yodada utilizando un aplicador de algodón de punta. Frote la aguja de inoculación / jeringa, punto primero, en el lubricante quirúrgico.
   NOTA: povidona-yodo se utiliza para la implantación del catéter, que es una solución aséptica más fuerte que el alcohol. La implantación del catéter requieremanipulación más mecánico para insertar el catéter y por lo tanto un mayor potencial de contaminación.
7. Insertar el catéter en la abertura uretral. Una vez dentro, el uso de pinzas para empujar el (7 mm PE10) pieza larga hacia la vejiga, en consecuencia, empujando el (5 mm de silicona) pequeño catéter y depositarlo en la vejiga. Retire la aguja, con el tubo de 7 mm todavía unido, inmediatamente.

11. La inoculación bacteriana

1. Siga el protocolo de la inoculación bacteriana en la sección 3, mediante el inóculo preparado de la sección 9. Retire el ratón desde el cono de la nariz y devolverlo a su jaula

12. En cada momento del Sacrificio

1. Preparar tubos de 5 ml para la vejiga y el riñón (por órganos siguen el paso 4.1) y 1,5 ml tubo Eppendorf de catéteres. Añadir 1 ml de PBS 1x en 1,5 ml tubo Eppendorf para muestras de catéter
2. Siga los pasos 4.3 a 4.5. Diseccionar el ratón, cosechando la vejiga, los riñones y el catéter, placing los tejidos independientemente en 5 tubos ml que contenían PBS 1x y el catéter en el 1,5 ml Eppendorf (véase el paso 12.1).
   NOTA: Use tijeras diferentes para la disección externa y para la extracción de órganos y recuperación catéter para minimizar la contaminación
3. A continuación, siga el paso 4.6.

13. Recuperación bacteriana

1. Por órganos, siga los pasos 5.1 y 5.2. Para la recuperación bacteriana de los catéteres, vórtice a velocidad máxima durante 30 seg, sonicar las muestras de catéter durante 5 min usando un sonicador de baño, y luego vórtice a la máxima velocidad por un 30 seg adicional.
2. Hacer diluciones seriadas 1:10 a 10 ^-8 y la placa de dilución para cada CFU enumeración en placas de BHI. Incubar las placas a 37 ºC durante la noche y contar las colonias al día siguiente.

Resultados

Los modelos intravesical de IU asociada sin complicaciones y el catéter proporcionan plataformas flexibles para dilucidar los mecanismos moleculares de la patogénesis bacteriana, el impacto de estas enfermedades en el tejido de acogida, así como el desarrollo y ensayo de nuevos enfoques para gestionar estas infecciones comunes y costosos. Dependiendo de la cepa de ratón y el patógeno, la inoculación intravesical se puede utilizar para estudiar las interacciones huésped-patógeno para dilucidar los factores necesa...

Discusión

Comunidad no complicada adquirió UTI es una infección común y costoso que representa varios millones de consultas de atención primaria cada año ^46. Además, ITUAC son una infección adquirida sanitaria común que ha llegado a ser extremadamente costoso para los proveedores de salud como los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid no reembolsa a los proveedores por el costo añadido de trato que resulta de un hospital adquirida ITUAC ^45. Los modelos de ratón de infección urinaria, tanto l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles	BD Precision Glide	305106	30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 inches
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 inches x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1x Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299