JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Аннотация

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) широко распространены, существенной причиной заболеваемости и более устойчивы к лечению антибиотиками. Женщины непропорционально страдают от ИМП: 50% всех женщин будут иметь ИМП в течение своей жизни. Кроме того, 20-40% из этих женщин, которые имеют начальное ИМП будет страдать повторения с некоторыми страдающих частыми рецидивами с серьезным ухудшением качества жизни, боль и дискомфорт, нарушение повседневной деятельности, увеличение расходов на здравоохранение, и несколько вариантов лечения другой чем долгосрочные антибиотикопрофилактики. Уропатогенные кишечная палочка (УПЭК) является основным возбудителем внебольничной ИМП. Катетер-ассоциированные ИМП (CAUTI) является наиболее распространенным больница приобрела инфекции приходится на миллион вхождений в США ежегодно и драматических расходов на здравоохранение. В то время как УПЭК также основной причиной CAUTI, другие возбудители имеют более важное значение в том числе Enterococcusфекальный. Здесь мы используем два устоявшихся моделей мыши, что повторять многие из клинических характеристик этих заболеваний человека. Для ИМП, модель С3Н / HeN повторяет многие из особенностей УПЭК вирулентности наблюдаемых у человека в том числе ответов хозяев, формирования IBC и филаментацию. Для CAUTI, модели с использованием мышей C57BL / 6, которые сохраняют имплантаты мочевого пузыря катетер, было показано, что быть чувствительны к E. фекальный инфекции мочевого пузыря. Эти представительные модели, которые используются для получения ярких новых идей в патогенезе заболевания ИМП, которая ведет к развитию новых терапевтических стратегий и управления или профилактики.

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одним из самых распространенных бактериальных инфекций и может быть разделен на две категории в зависимости от механизма приобретения, сообщества и нозокомиальных ИМП приобретенной. Внебольничная ИМП часто встречаются в противном случае здоровых женщин и исследований показали, что примерно 50% женщин будут иметь по крайней мере один ИМП в течение своей жизни 1. Кроме того, рецидивы серьезной проблемой. Женщина, которая имеет начальную острую инфекцию имеет 25-40% шансов родить второй инфекции в течение шести месяцев, несмотря на соответствующее лечение антибиотиками и многие женщины по-прежнему имеют частые рецидивы 2 в. Бактерии, которые вызывают эти инфекции также становится все более устойчивых к антибиотикам дальнейшие смешанные протоколы лечения 3-6. ИМП влияет миллионы людей каждый год обходится примерно 2,5 млрд долларов в области здравоохранения, связанных расходов в США, подчеркивает влияние и распространенность заболевания1,7 .Nosocomial приобрела ИМП, в основном, связано с наличием инородных тел, таких как постоянных катетеров. Катетер-ассоциированные ИМП (CAUTI) остаются наиболее распространенным внутрибольничной приобрела ИМП, что составляет ~ 70-80% таких инфекций 8. Кроме того, CAUTI связано с увеличением заболеваемости и смертности, и это наиболее частая причина вторичного инфекций кровотока 9.

УПЭК связано внебольничная ИМП думал быть вызвано введением бактерий в мочевой пузырь из водохранилищ в желудочно-кишечном тракте через механических манипуляций во время полового акта, плохой гигиены или других микробных динамики населения между другом хосте ниши 10. После того, как в пузыре, УПЭК использовать многочисленные факторы вирулентности, в том числе капсулы, систем сбора железа, токсинов, в плазмиды вирулентности, тРНК, патогенности островов и колонизации факторов, которые, как было показано, играют роль в патогенезе 11-14. Важнейшее значение для установления УПЭК колонизации, УПЭК также кодировать различные типы клея шаперонной ассистента путь (CUP) пили, которые распознают рецепторы с стереохимического специфики 15. Тип 1 пили, с наконечниками адгезина FimH, выражаются УПЭК и связывать mannosylated uroplakins 16 и α-1, β-3 интегрины 17, которые выражаются на поверхности просвета обоих человеческих и мышиных пузырей 18. Эти FimH-опосредованной взаимодействия облегчить бактериальной колонизации и инвазии поверхностных эпителиальных клеток 19,20. После того, как в клетке, УПЭК может избежать в цитоплазму, где одна бактерия может быстро разделить, чтобы сформировать внутриклеточный бактериальный сообщества (IBC), который при созревании, может содержать ~ 10 4 бактерий 21. Формирование МДС была продемонстрирована по крайней мере шесть различных линий мышей, С3Н / курица, С3Н / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ и BALB / C, так и с широким спектром различных UPEШтаммы C и других энтеробактерий 22-24. Однако временные и пространственные различия формирования IBC может изменяться в зависимости от фона мыши и заражение штаммом UPEC. В C3H / HeN мышей, инфицированных штаммами прототипа УПЭК UTI89 или образование CFT073, МКБ могут быть визуализированы в виде небольших биомасс бактерий в начале 3 HPI (после инфекции ч). Это сообщество продолжает расширяться и достигнет "среднюю" развития приблизительно 6 HPI когда стержнеобразные бактерии занимают большой процент цитоплазматической пространства неизлечимо дифференцированных поверхностные клетки зонтик Эти ранние формы КСГМГ в относительно синхронно с большинством отображаются аналогичные размеры и морфологии. ~ 8 HPI бактерии в изменении IBC от бацилл в кокки морфологию. КСГМГ преходящий характер. Таким образом, МКБ созревания 12-18 HPI результатов в дальнейшее расширение бактериальной популяции, с последующим их филаментации и разгона из клеток Wiго последующее распространение на соседние клетки 23. Таким образом, ниша МКБ позволяет быстро бактериального роста в среде, защищенной от иммунной реакции и антибиотики 25. Отличительные этапы UPEC инфекции, которые видны у мышей наблюдались также у людей, таких как КСМ и филаментацию, поддерживая модель мыши ИМП как полезный инструмент, который можно использовать для моделирования ИМП у людей 22,26-28.

В то время как большинство женщин испытывают ИМП в течение своей жизни, исход этих инфекций может варьироваться от острой самоограничения инфекции не рецидива, частым рецидивирующим циститом. Кроме того, исследования показали сильную семейной возникновение ИМП, предполагая, генетический компонент способствует ИМП восприимчивости 29. Мы обнаружили, что различные УТИ результаты видны в клиниках может быть зеркальным по различающихся результатов экспериментальной УПЭК-инфекции среди инбредных линий мышей 30. Например, С3Н / курица, ЦБМышей DBA, и С3Н / HeOuJ подвержены, в инфекционном дозозависимо, чтобы длительной, хронический цистит характеризуется стойким, высокие бактерий титр (> 10 4 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл), высокий титр бактерий бремя пузыря в жертву> 4 недели после заражения (WPI), хроническое воспаление, некроз и уротелиальная. Эти мыши также отображать повышенные сывороточные уровни IL-6, G-CSF, КЦ, и IL-5 в течение первых 24 HPI, которые служат в качестве биомаркеров для развития хронического цистита. Это может точно представлять естественный ход ИМП у некоторых женщин, как показали исследования плацебо показали, что большой процент женщин, испытывающих ИМП сохранит высокие уровни бактерий в моче в течение нескольких недель после появления первых симптомов цистита, если не назначено лечение антибиотиками 31 , 32. Кроме того, с помощью С3Н / Курица мышей, мы обнаружили, что история хронического цистита является существенным фактором риска для последующих тяжелых рецидивирующих инфекций. Периодические ИМП наиболее сиgnificant клиническим проявлением ИМП и С3Н / Курица мыши в настоящее время только учился модель повторяет повышенный предрасположенность после предыдущего воздействия. Второй исход ИМП обобщено мышей C57BL / 6, где острой инфекции УПЭК самоограничивает, с разрешением воспаления мочевого пузыря и бактериурию в течение примерно недели. Интересно, что в этой модели, УПЭК легко образуют покоящиеся внутриклеточные резервуары в ткани мочевого пузыря, из которого УПЭК способны выходит из состоянии покоя, чтобы возобновить активное ИМП, потенциально пояснения одного механизма же штамма рецидивирующей ИМП у человека 33, 34.

В дополнение к генетических факторов, влияющих на УИП восприимчивости, введение катетера в мочевой пузырь значительно увеличивает вероятность наличия инфекции, а также расширение спектра бактерий, способных вызвать инфекцию. Было показано, что катетеризация мочевого пузыря человек вызывает гистологические ииммунологические изменения в мочевом пузыре из-за механического напряжения, что приводит к прочной воспалительной реакции, пилинга, отек собственной пластинки и submucusa, мочевых путей и истончение слизистой поражением почек и уротелии 35,36. Кроме того, катетер обеспечивает поверхность для прикрепления бактерий, тем самым создавая среду, используемую несколькими видами, чтобы вызвать CAUTI. В то время как все еще ​​УПЭК из основных причин, Enterococcus фекальный составляет 15% от этих 37 CAUTI. Е. фекальный становится все более устойчивыми к антибиотикам ванкомицин сопротивления появление, создавая серьезную озабоченность здоровья 38. Е. фекальный обладают многочисленные факторы вирулентности, включая токсины и адгезинов, необходимых для присоединения к так катетера и эпителия 38. Во время катетеризации мочевого, хозяин уязвимыми для микробов адгезии, размножения и распространения в 39,40 мочевыводящих путей. Е. faecaЛис образует биопленку на катетере, как часть механизма сохраняются в мочевом пузыре и распространять почек, которая приводится в мыши CAUTI модели 41. Недавно было показано, во мочевого катетера, фибриногена (Fg) поступает в мочевой пузырь, как часть воспалительной реакции. Fg накапливается в мочевом пузыре, пальто катетера и имеет важное значение для E. фекальный образование биопленки, функционирует в качестве эшафот вложения. В модели мышей C57BL / 6 мышей CAUTI, мы обнаружили, что Е. формирование биопленки фекальный на катетер, и, таким образом, сохранение в мочевом пузыре, зависит от пилуса EBP, в частности, ее кончик адгезин EbpA. Мы обнаружили, что N-концевой домен EbpA специфически связывается с FG покрытия катетер. Кроме того, было установлено, что Е. фекальный использует Fg в качестве источника инфекции во время метаболита, таким образом, увеличивая образование биопленки 42.

Мышиные модели доказали решающее значение для Understanding а также прогнозирования клинических проявлений ИМП и CAUTI 41. В этой статье мы покажем, подготовку посевной в цистита УПЭК изолировать UTI89 и трансуретральная прививку С3Н / HeN мышей. Кроме того, мы продемонстрировать протокол для катетера в C57BL / 6 мышей и инокуляции Е. фекальный OG1RF штамм. Оба из этих методов приводит к последовательной и надежной ИМП или CAUTI у мышей. Мы также отображать методы, используемые для наблюдения образование IBC во время острого цистита и сбора мочи для анализа хронического рецидивирующего цистита или. С3Н / HeN мышей были использованы для изучения аспектов патогенеза УПЭК в том числе начального бактериальной инвазии, формирования IBC, филаментации и развития хронического цистита 23,33,43. Эти параметры вирулентности также были изучены в различных других слоев мыши 22,33. Для CAUTI, C57BL / 6 модель позволяет иностранным имплантации тела в мочевой пузырь с последующим бактериальной сотрудничестваионизация, которая может поддерживаться в течение 7 дней после заражения 41. Эти модели были полезны для оценки механизмов бактериальной вирулентности, принимающих ответов на ИМП и механизмы, чтобы ниспровергать ответов хозяев, большая часть которых была впоследствии воспроизводятся или наблюдаемые в клинических популяциях человека.

протокол

Заявление по этике: Университет Комитет животных Исследования Вашингтон одобрил все инфекции мыши и процедуры как часть протокола числа 20120216, который был одобрен 01/11/2013, истекает 01/11/2016. В целом уход за животными согласуется с гидом по уходу и использованию лабораторных животных от Руководства Министерства сельского хозяйства США по уходу за животными ресурсами Национального исследовательского совета и. Процедуры эвтаназии в соответствии с руководящими принципами "AVMA для эвтаназии животных 2013 издание."

1. УПЭК ИМП протокол, Прививка иглы Подготовка (рис S1)

  1. Снимите крышку 30 G иглы. Автор около 1 дюйм PE10 трубки на вал иглы. УФ стерилизации игл сборки ночь. Катетер иглы могут храниться бесконечно в стерильные чашки Петри.

2. УПЭК бактериального инокулята Получение

  1. Подготовка UTI89 прививочный (начало 72 ч до посевногодень ния)
    1. Серия UTI89 на качестве LB (Лурия-Bertani) агаром из замороженного складе. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С. Выберите колонию и привить его в 10 мл LB в колбе 125 мл. Инкубируют при 37 ° С в течение 24 ч, статически.
    2. Посев 10 мкл ночной культуры в 10 мл LB в новую колбу 125 мл в течение дополнительных 24 ч при 37 ° С, статически.
    3. Передача 3 мл (будет варьироваться в зависимости от штамма и нужного размера посевной) к стерильным 1,5 мл пробирки и центрифуге при 7000 мкг в течение 3 мин и ресуспендируют осадок в 1x PBS и центрифуги второй раз. Ресуспендируют бактериальных гранул в 1 мл PBS 1x.
  2. Измерение оптической плотности бактериальной и отрегулировать концентрацию до нужной плотности инокулята. Стандарт концентрация инокулята, используемого в 10 7 бактерий; Однако, это может варьироваться в зависимости от дизайна исследования.

3. Бактериальные Прививка

  1. Очистите рабочее место с 70% этанола и Cпо площади с впитывающей бумагой (или использовать стерильную капот потока).
  2. Нарисуйте до 0,9 мл приготовленного бактериального инокулята в 1 мл (ТБ) шприца (удалить воздушные пузырьки). Приложите подготовленный стерильный прививки иглу с PE10 трубки, на шприц, содержащий посевной, то стерильно обрезать трубы из полиэтилена.
    Примечание: Оставьте 1 мм трубки над кончиком иглы, чтобы избежать прокалывания пузыря.
  3. Вырезать 1 дюйм квадратный кусок парафильмом и положить мазок хирургического смазки (примерно размером с монету) на вершине.
  4. Обезболить женщин С3Н / Курица мышей, помещая их в стеклянную банку 32 унций, содержащий чай для заварки мяч с ватными шариками, смоченными 3 мл ИФ или испарителя камеры (после не производит протокол), пока без сознания, но еще дышал нормально (1 вдох / сек) ,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые комитеты IACUC не одобряют использование банку или испаритель. Пожалуйста, следуйте указание комитета IACUC вашей организации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если стеклянный сосудс чайной мяч и / или носовой конус изофлураном-soakd ватные шарики используются, животное должно быть тщательно соблюдать, чтобы не обезболивающий передозировки и смерти. Преимущество использования испарителя и анестезии камеру, что обеспечивает контролируемое управление ИФ что позволяет избежать случайных передозировок. ВНИМАНИЕ: Изофлюран является вдыхание обезболивающий. Используйте в хорошо проветриваемом помещении и минимизировать вдыхания.
  5. Отключив мышь от JAR / испаритель и поместить его на спину на бумажное полотенце и распространяется ноги.
  6. Накройте нос мыши с носовой конус (трубки, подключенного к испаритель, который обеспечивает дозу, isoflurance, который оснащен на некоторых испарителя единиц) или 50 мл коническую трубку с ватным тампоном, содержащей небольшое количество (примерно 1-2 мл ) изофлурана.
  7. Аккуратно трепетать мочевого пузыря, чтобы вызвать мочеиспускание и обеспечить аннулированный мочевого пузыря. Протрите периуретральной зона с 100% этанола салфеткой. Приложите прививка иглы шприца /, выберите пункт первый, вхирургическое смазки.
  8. Посев каждой мыши с 50 мкл раствора бактерий путем вставки иглы инокуляции трансуретрально, около 12 мм, а нажимая на поршень шприца аккуратно, чтобы обойтись инокулята в мочевой пузырь аккуратно (10 мкл / сек). Удалить прививка иглу из мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленный возврат посевного в отверстие мочеиспускательного канала, когда начинают прививать указывает неправильное или неполное введение иглы.
  9. Отключив мышь от носового конуса и вернуть его в клетку. Повторите шаги 3,3-3,8 для каждой мыши. Когда / если переключение инокуляции условия / штаммов, избавиться от шприца и иглы прививки в утвержденной контейнер для острых предметов и начинают снова шаг 3.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заражение уропатогенных организмов, как правило, не вызывает тяжелые симптомы боли. Тем не менее, в редких случаях, введение больших доз патогенов может вызвать лихорадку, снижение пищи и воды потребления и аномального поведения.Нимал здоровья должны контролироваться в течение эксперимента. Если симптомы явные болевые уведомление, анальгетик, такой как бупренорфина (0,05-0,1 мг / кг подкожно), могут быть применены. Процедуры должны быть в соответствии с IACUC каждого учреждения.

4. Определение бактериальных обременениях

  1. Подготовьте отдельные 5 мл трубки для каждой пары мочевого пузыря и почек, которые будут собраны. Добавить 1 мл 1x PBS / трубки / мыши мочевого пузыря будет собрано. Добавить 0,8 мл 1x PBS / трубки / пара почек мыши, чтобы быть собраны. На каждом трубки, чтобы соответствовать заданной мыши. Подготовка 96-луночный планшет, содержащий 180 мкл 1х PBS в каждую лунку по 1:10 серийных разведений.
  2. Очистите рабочую зону с 70% этанола и покрыть площадь с абсорбирующим обложки или бумажным полотенцем.
  3. Обезболить мышь с изофлуран (см шаг 3,4) до тех пор, пока мышь перестает дышать в течение примерно 1 мин, а затем поместить его на впитывающей обложки или бумажным полотенцем. Другие методы euthanaSIA также приняты IACUC комитетами, таких как двуокись углерода, и может быть заменен на изофлуран передозировки.
  4. Жертвоприношение мышь быстрым смещением шейных позвонков, который состоит из сдерживая шею у основания головы и тянет хвост горизонтально от тела, пока дислокации не происходит.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство IACUC комитеты требуют вторичные средства эвтаназии и шейки дислокации распространенным методом. Тем не менее, другие методы могут быть использованы в случае одобрения комитета IACUC.
  5. Поместите мертвую мышь на спине и спрей 70% этанола на животе. Проанализируйте мыши, урожай мочевого пузыря и почек, в том, чтобы минимизировать потенциальное загрязнение от крови следующую вскрытия почек. Поместите органы самостоятельно в подготовленных 5 мл пробирки, содержащие 1x PBS (см шаг 4.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте различные ножницы для вскрытия внешней и извлечение органов для минимизации загрязнения.
  6. Нажмите трубку, чтобы обеспечить органы в тон 1x PBS. Повторите шаг для каждого 4,3-4,5 мыши. Чистые ножницы и щипцы в 70% этанола после каждой мыши.

5. Бактериальная Восстановление

  1. Перемешать Собранную мочевого пузыря и почки в 5 мл пробирки с тканевой гомогенизатор, 15 сек в почках и 30 сек на мочевой пузырь. Промыть гомогенизатор последовательно в 1x PBS, 70% этанола и 1x PBS между образцами.
  2. Сделать серийные разведения 1:10 к 10 -8 и пластины для каждого разведения КОЕ (колониеобразующих единиц) на чашках с агаром LB. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи и рассчитывать колоний на следующий день.

6. Перечень МКБ

  1. Соблюдая правила асептики, удалить мочевой пузырь и поместить его в 1x PBS в 6-луночного планшета с силиконового дна. Плиты могут быть получены с использованием набора силиконовой эластомерной и заливки примерно 1 см силикона в каждую лунку, см инструкции производителя. Разрежьте пополам мочевого пузыря с помощью ножниц.
  2. Использование малых металлических штифтов мягко вывихнуть в BLADдер, так что просвет мочевого пузыря вверх. Будьте уверены, чтобы поместить булавки в крайних ребер секций мочевого пузыря, чтобы обеспечить максимальное количество уротелии подвергается.
  3. После splaying, аккуратно мыть мочевого пузыря сразу с 1x PBS. Снимите 1x PBS с пипеткой. Fix мочевого пузыря, добавив достаточно 3% параформальдегида, чтобы покрыть всю растопыренными мочевого пузыря. ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является канцерогенным. Правильное защитное оборудование, включая перчатки, следует носить в любое время. Утилизация должна следовать институциональных руководящих принципов.
  4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Удалить параформальдегида решение. Вымойте раз с 1x PBS.
  5. Промыть LacZ промывочного раствора (2 мМ MgCl 2, 0,01% дезоксихолатом натрия и 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) три раза в течение 5 мин на промывку.
  6. Удалить промывочного раствора и добавить достаточно LacZ пятно (9,5 мл, LacZ промывочного раствора, 0,4 мл 25 мг / мл X-Gal и 0,1 мл 100 мМ K-ферроцианидных / K-кровяной), чтобы покрыть пузыри. Выдержите на 30 ° C overniОТВ защищен от света.
  7. Удалить растопыренными пузыри из инкубатора и наблюдать КСГМГ, которые появляются, как синий, как Puncta визуализируются с рассекает сферу, 40-60X увеличения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда мышь может мочиться до размещения трубки под уретры. В этом случае подождите 15-20 мин перед тем, как снова сбора мочи.

7. Моча Коллекция для бактериурии КОЕ Перечень (не применяется для CAUTI)

  1. Для сбора мочи до или после инфекции мягко сдерживать мыши, удерживая хвост и размещение его на ровной поверхности (повышенной вершину мыши клетку).
  2. Удержание стерильный 1,5 мл трубки под уретры мыши. Аккуратно надавите на спине мыши около хвоста, чтобы оказать давление на мочевой пузырь. Поймать мочи в 1,5 мл трубки.
  3. Сделайте серийные разведения 1:10 из 10 -7 и пластины каждого разведения на соответствующей LB. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи и рассчитывать колоний на следующий день.

8. CAUTI Модель Протокол, катетер игла Подготовка к CAUTI модели (рис S2)

  1. Снимите крышку 30 G иглы. Вырезать 7 мм кусок трубы PE10 и 5 мм кусок силиконовой трубки, такие как RenaSIL. Нить в иглу с PE10 трубки до трубки не коснется базы иглы.
  2. Затем кормить 5 мм кусок на PE10, содержащих иглы. УФ стерилизации игл сборки ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При загрузке силиконовые трубки, оставить примерно 1 мм трубки, проходящей мимо кончика иглы.

9. Е. фекальный OG1RF бактериального инокулята Получение

  1. Подготовка посевного материала OG1RF начиная 48 ч до дня прививки. Серия OG1RF на BHI в (мозг сердца настой) пластины из замороженного складе.
  2. Выбор колонию и привить его на 10 мл BHI и расти статически в течение 18 часов при 37 ° С. Центрифуга культуры и мыть гранул (3 раза) в объеме 1 мл стерильной PBS 1x.
  3. Ресуспендируют бактериальных гранул в 1x PBS. Измерение оптической плотности бактериальной и регулировать концентрацию до требуемого размера инокулята. Стандарт концентрация инокулята, используемого 10 7; Однако, это может варьироваться в зависимости от дизайна исследования

10. Катетер Имплантация

  1. Очистите рабочее место с 70% этанола и покрыть площадь с абсорбирующим крышкой (или использовать стерильную капот потока).
  2. Прикрепите катетер иглу в пустую 1 мл (ТБ) шприца. Вырезать 1 дюйм квадратный кусок парафильмом и положить мазок хирургического смазки (примерно размером с монету) на вершине.
    Примечание: Две разные иглы для осаждения катетера и для инокулята в свернутом случайного прививки из-за механических манипуляций, необходимых для имплантации катетера. Это также позволяет для удобства приготовления меньше иглы инокуляции.
  3. Обезболить C57BL / 6 мышей, помещая их в стеклянную банку 32 унций, содержащий чай-infuser мяч с ватными шариками, смоченными в 3 мл ИФ или испарителя камеры (после не производит протокол) до бессознательного, но все еще дышит нормально (1 дыхания / сек).
  4. Затем положить мышь на спине на бумажное полотенце и распространяется ноги. Накройте нос мыши с носового конуса или 50 мл коническую трубку с ватными шариками, содержащих небольшое количество (примерно 1-2 мл) изофлурана.
    ВНИМАНИЕ: Изофлюран является вдыхание обезболивающий. Используйте в хорошо проветриваемом помещении и минимизировать вдыхания исследователем.
  5. Аккуратно трепетать мочевого пузыря, чтобы вызвать мочеиспускание и обеспечить аннулированный мочевого пузыря. Протрите периуретральной область с 100% этанола салфеткой.
  6. Лечить периуретральной зона с 10% повидон-йода с использованием хлопка-аппликатора. Приложите прививка иглы шприца /, выберите пункт первый, в хирургической смазки.
    Примечание: повидин-йод используется для имплантации катетера, который является более сильным, чем асептического раствора спирта. Катетер имплантация требуетсяболее механических манипуляций, чтобы вставить катетер и, таким образом, больший потенциал для загрязнения.
  7. Вставьте катетер в отверстие уретры. После того как в, С помощью пинцета, чтобы подтолкнуть (7 мм) PE10 длинную сторону мочевого пузыря, следовательно, толкая (5 мм) силикон небольшой катетер и осаждение его в мочевом пузыре. Снимите иглу, с 7 мм трубки еще привязаны, немедленно.

11. Бактериальный Прививка

  1. Следуйте бактериальной протокол прививки в разделе 3, используя подготовленную прививочный из раздела 9. Снять мышь от носового конуса и вернуть его в клетку

12. В каждый момент времени жертвоприношения

  1. Подготовьте 5 мл пробирки для мочевого пузыря и почек (Для органы следовать шаг 4.1) и 1.5 мл Eppendorf трубки для катетеров. Добавить 1 мл 1x PBS в 1,5 мл Eppendorf трубки для образцов катетер
  2. Выполните шаги 4,3 до 4,5. Проанализируйте мыши, уборка мочевого пузыря, почек и катетер, плаCing тканей независимо в 5 мл пробирки, содержащие 1X PBS и катетер в 1,5 мл Eppendorf (этап 12.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте различные ножницы для вскрытия внешней и извлечении органов и извлечения катетера, чтобы минимизировать загрязнение
  3. Затем выполните шаг 4.6.

13. Бактериальный Восстановление

  1. Для органов, выполните шаги 5.1 и 5.2. Для бактериального восстановления от катетеров, вихря на максимальной скорости в течение 30 сек, разрушать ультразвуком образцов катетер в течение 5 мин с помощью ультразвукового ванну, а затем вихрь на максимальной скорости в течение дополнительных 30 секунд.
  2. Сделайте серийные разведения 1:10 из 10 -8 и пластины каждого разведения для перечисления КОЕ на BHI пластин. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи и рассчитывать колониям на следующий день.

Результаты

Внутрипузырное модели неосложненных и катетера, связанной ИМП обеспечивают гибкие платформы для выяснения молекулярных механизмов патогенеза бактериальной, влияние этих заболеваний на ткани хозяина, а также разработки и испытания новых подходов в управлении этих общих и дорогостоя...

Обсуждение

Несложный внебольничная ИМП общей и дорогостоящей инфекции составляет несколько миллионов посещений ПМСП каждый 46 год. Кроме того, Cautis являются общим здравоохранения приобрели инфекция, которая не стала чрезвычайно дорого медицинских работников как центры Medicare и Medicaid Services бол?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Финансирование этой работы была предоставлена ​​ORWH СКОР P50 DK064540, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171 и F32 DK 104516-01.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needlesBD Precision Glide30510630 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubingBD427400Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubingBraintree Scientific, IncSIL 025inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – IsothesiaButler Schein29405250 ml
Clear Glass Straight-Sided JarKimble Chase5413289V 21
Stainless Steel Tea InfuserSchefs-AmazonPremium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton ballsFisherbrand22-456-880
50 ml Falcon tubesVWR89039-660
Isotec 3 -vaporizerOhmeda1224478
Ear punchFisher Scientific13-812-201(when necessary)
Betadine solutionBetadine solution10% Povidie-iodine topical solution
Q-tipsFisher Scientific22-037-9246 inches
Diapers for benchFisherbrand14206 63Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricantSurgilube0281-0205-36
Dissecting scissorFine Science tools, INC14084-08
Micro-Adson ForcepsFine Science tools, INC11018-12
1 ml syringeBD309659Tuberculin slip tip
ParafilmBemisPM9964 inches x 125 FT
Eppendorf rackFisherbrand05-541-1
Eppendorf tubesMIDSCIAVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
HomogenizerPRO Scientific INCBio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tubeBD352063for organ homogenization
Paper towelGeorgia-Pacific
EthanolPharmco-AAPER11100020S200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well PlatesCorning3788
1x Phosphate sodium salineSigma-AldrichP3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210Branson Ultrasonics Corporation1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plateTechno Plastic Products92006
PinsFine Science Tools26002-20
Sylgard 184Dow Corning3097358-1004Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)Invitrogen15520-034Ultrapure
N, N-DimethylformamideSigma AldrichD4551
MgCl2 (Magnesium chloride)Sigma AldrichM8266
Sodium deoxycholateSigma AldrichD6750
Nonidet-P40Roche11754599001Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)Sigma AldrichP3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)Sigma Aldrich60299

Ссылки

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli.. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli.. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John, ., L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -. S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 8/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

100Enterococcus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены