Création et caractérisation de l'UTI et Cauti dans un modèle de souris

Résumé

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Résumé

Les infections des voies urinaires (IVU) sont très répandus, une cause importante de morbidité et sont plus résistantes aux traitements avec des antibiotiques. Les femmes sont beaucoup affligé par UTI: 50% de toutes les femmes auront une infection urinaire dans leur vie. En outre, 20-40% de ces femmes qui ont une première UTI subira une récidive avec certains souffrant de récidives fréquentes avec grave détérioration de la qualité de vie, la douleur et l'inconfort, la perturbation des activités quotidiennes, l'augmentation des coûts de soins de santé, et quelques options de traitement autres de prophylaxie antibiotique à long terme. Uropathogène Escherichia coli (UPEC) est l'agent causal primaire de la communauté acquise UTI. UTI du cathéter-associé (Cauti) est l'hôpital infection la plus fréquente acquis représente un million occurrences dans les États-Unis chaque année et les coûts de soins de santé dramatiques. Alors que UPEC est également la principale cause de Cauti, d'autres agents pathogènes sont d'une importance accrue, y compris Enterococcusfaecalis. Ici, nous utilisons deux modèles de souris bien établies qui récapitulent plusieurs des caractéristiques cliniques de ces maladies humaines. Pour UTI, un modèle C3H / HeN récapitule la plupart des caractéristiques de virulence UPEC observés chez les humains y compris les réponses de l'hôte, la formation IBC et filamentation. Pour Cauti, en utilisant un modèle souris C57BL / 6, qui conservent les implants cathéter de la vessie, a été montré pour être sensibles à E. faecalis infection de la vessie. Ces modèles représentatifs sont utilisés pour acquérir de nouvelles connaissances frappantes dans la pathogenèse de la maladie UTI, qui conduit à la mise au point de nouveaux traitements et stratégies de gestion ou de prévention.

Introduction

Infections des voies urinaires (IVU) sont l'une des infections bactériennes les plus courantes et peuvent être divisés en deux catégories basées sur le mécanisme d'acquisition, la communauté et nosocomiale acquise UTI. Les infections urinaires se produit souvent chez les femmes et des études, autrement sains acquis communautaire ont montré qu'environ 50% des femmes auront au moins une infection urinaire dans leur vie ^1. En outre, la récidive est un problème majeur. Une femme qui a une infection aiguë initiale a une chance d'avoir une seconde infection dans les six mois malgré un traitement antibiotique approprié et de nombreuses femmes continuent à avoir de fréquentes récidives ² 25-40%. Les bactéries qui causent ces infections sont également de plus en plus de protocoles de traitement de plus en plus résistantes aux antibiotiques de confusion ^3-6. UTI affectent des millions de personnes chaque année coûte environ 2,5 milliards de dollars en frais liés aux soins de santé aux États-Unis, soulignant l'impact et la prévalence de la maladie1,7 .Nosocomial acquis les infections urinaires sont principalement liés à la présence de corps étrangers tels que cathéters. les infections urinaires de cathéter associée (Cauti) restent la nosocomiale la plus fréquente acquise UTI, représentant ~ 70-80% de ces infections ^8. En outre, Cauti est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité et il est la cause la plus fréquente des infections sanguines secondaires ^9.

Communauté associée UPEC acquis les infections urinaires sont pensés pour être causé par l'introduction de bactéries dans la vessie à partir de réservoirs dans le tractus gastro-intestinal par le biais d'une manipulation mécanique pendant les rapports sexuels, le manque d'hygiène ou d'autres dynamique des populations microbiennes entre l'hôte différentes niches ^10. Une fois à l'intérieur de la vessie, UPEC emploient de nombreux facteurs de virulence, y compris la capsule, les systèmes d'acquisition du fer, des toxines, un plasmide de virulence, ARNt, îlots de pathogénicité et de facteurs de colonisation qui ont été montrés à jouer un rôle dans la pathogenèse ^{11-14. Critique à l'établissement de la colonisation UPEC, UPEC codent également plusieurs types de chaperon adhésif huissier voie (CUP) pili qui reconnaissent les récepteurs avec une spécificité stéréochimique 15. Pili de type 1, pointe avec l'adhésine FimH, sont exprimées par l'UPEC et lier uroplakins 16 et α-β-1, 3 intégrines 17, qui sont exprimés sur la surface luminale des deux vessies humaines et de souris 18 mannosylée. Ces interactions à médiation FimH faciliter la colonisation bactérienne et l'invasion des cellules epitheliales superficielles 19,20. Une fois à l'intérieur de la cellule, UPEC peut échapper dans le cytoplasme où une seule bactérie peut rapidement diviser pour former une communauté bactérienne intracellulaire (IBC), qui, lors de la maturation, peut contenir ~ 10 4 21 bactéries. Formation IBC a été démontrée dans au moins six différentes souches de souris, C3H / poule, C3H / HeJ, C57BL / 6, ABC, FVB / NJ et BALB / c, et avec une grande variété de différentes UPESouches de carbone et d'autres Enterobacteriaceae 22-24. Toutefois, des différences temporelles et spatiales de la formation IBC peuvent varier en fonction de l'arrière-plan de la souris et la souche UPEC infecter. Dans C3H / HeN infectées par le UPEC prototypique souches UTI89 ou la formation CFT073, IBC peuvent être visualisés sous forme de petites biomasses de bactéries dès 3 HPI (post-infection h). Cette communauté continue à se développer et atteint un "point médian" de développement d'environ 6 hpi lorsque les bactéries en forme de bâtonnets occupent un grand pourcentage de l'espace cytoplasmique de cellules parapluie superficielles différenciées Ces forme précoce GRV d'une manière relativement synchrone avec la majorité affichant des dimensions similaires et morphologies. ~ 8 hpi les bactéries dans le changement IBC d'une bacilles à Cocci morphologie. GRV sont de nature transitoire. Ainsi, le BAC maturation 12-18 résultats de HPI à l'expansion continue de la population bactérienne, suivi par leur filamentation et la dispersion de la wi cellulaireth propagation ultérieure à des cellules voisines 23. Ainsi, le créneau IBC permet une croissance bactérienne rapide dans un environnement à l'abri de réponses 25 immunitaires et des antibiotiques hôtes. Les étapes distinctes d'infection UPEC qui sont vus dans les souris sont également observées chez l'homme, tels que les GRV et filamentation, soutenant le modèle de la souris de l'UTI comme un outil bénéfique qui peut être utilisé pour modéliser UTI chez les humains 22,26-28.}

Alors que la majorité des femmes ressentent une infection urinaire dans leur vie, le résultat de ces infections peut varier de l'infection de l'auto-limitation aiguë sans récidive, à la cystite récidivante fréquente. En outre, des études ont montré une forte survenue familiale de l'UTI, ce qui suggère une composante génétique contribue à la susceptibilité ²⁹ UTI. Nous avons constaté que les résultats UTI différentes dans les cliniques peuvent être reflétés par les résultats différents de l'infection expérimentale UPEC entre souches consanguines de souris ^30. Par exemple, C3H / poule, l'ABC, Des souris DBA, et C3H / HeOuJ sont sensibles, de manière infectieux dépendante de la dose, de longue durée, la cystite chronique caractérisée par la persistance, les bactéries de titre élevé (> 10 ⁴ unités formant des colonies (CFU) / ml), un titre élevé de bactéries charges de la vessie au sacrifice> 4 semaines post-infection (WPI), l'inflammation chronique, et la nécrose urothelial. Ces souris présentent également des taux sériques élevés de IL-6, G-CSF, KC, et IL-5 dans les 24 premières HPI qui servent de biomarqueurs pour le développement de la cystite chronique. Cela peut représenter fidèlement le cours naturel des infections urinaires chez certaines femmes, que des études contre placebo ont montré qu'un grand pourcentage de femmes victimes de UTI conservera des niveaux élevés de bactéries dans l'urine pendant plusieurs semaines après les premiers symptômes de la cystite si pas donné un traitement antibiotique ^{31 , 32.} En outre, en utilisant des souris C3H / poule, nous avons constaté que des antécédents de cystite chronique est un facteur de risque important pour les infections récurrentes sévères ultérieures. Infection urinaire récidivante est le plus simanifestation clinique gnificant de l'UTI et la souris C3H / HeN est actuellement le seul modèle étudié qui récapitule une prédisposition accrue après l'exposition précédente. Un deuxième résultat UTI est récapitulée dans C57Bl / 6 souris où l'infection aiguë UPEC est auto-limitation, avec une résolution de l'inflammation de la vessie et bactériurie une semaine environ. Fait intéressant, dans ce modèle, UPEC former facilement des réservoirs intracellulaires de repos dans le tissu de la vessie à partir de laquelle UPEC sont capables de sortir d'un état ​​de dormance pour relancer une UTI actif, potentiellement expliquer un mécanisme de même souche UTI récurrent chez l'homme ^{33, 34.}

En plus des influences génétiques sur UTI susceptibilité, l'introduction d'un cathéter dans la vessie augmente considérablement la probabilité d'avoir une infection ainsi que l'augmentation du nombre de bactéries capables de provoquer une infection. Il a été démontré que le cathétérisme urinaire humaine provoque histologique etchangements immunologiques dans la vessie dus au stress mécanique qui entraîne une réponse inflammatoire robuste, exfoliation, œdème de la lamina propria et submucusa, amincissement urothelial et lésion de la muqueuse urothélium et les reins ^35,36. En outre, le cathéter offre une surface pour la fixation bactérienne créant ainsi un environnement utilisé par plusieurs espèces de provoquer Cauti. Alors que UPEC sont encore un contributeur majeur, Enterococcus faecalis représente 15% de ces Cauti ^37. E. faecalis est de plus en plus résistantes aux antibiotiques avec résistance à la vancomycine émergence, posant un grave problème de santé ^38. E. faecalis possèdent de nombreux facteurs de virulence y compris les toxines et adhésines nécessaires pour la fixation à la fois le cathéter et l'épithélium ^38. Pendant sondage urinaire, l'hôte est vulnérable à l'adhésion microbienne, la multiplication et la diffusion dans le ^39,40 urinaire. E. FAECAlis forme un biofilm sur le cathéter dans le cadre d'un mécanisme de persister dans la vessie et de diffuser vers les reins, qui est reproduite dans un modèle de souris Cauti ^41. Récemment, il a été montré pendant un cathétérisme urinaire, fibrinogène (Fg) est libéré dans la vessie dans le cadre de la réponse inflammatoire. Fg accumule dans la vessie, le cathéter couches et est essentielle pour E. faecalis formation de biofilm, fonctionnant comme un échafaudage de fixation. Dans un modèle de souris C57BL / 6 de la souris de Cauti, nous avons découvert que E. faecalis formation de biofilm sur le cathéter, et donc la persistance dans la vessie, était à la charge sur le pili Ebp, spécifiquement son EBPA pointe d'adhésine. Nous avons constaté que le domaine N-terminal de EBPa se lie spécifiquement à FG revêtement du cathéter. En outre, il a été constaté que E. faecalis utilise Fg comme source de métabolite cours de l'infection, améliorant ainsi la formation de biofilm ^42.

Des modèles de souris sont révélés indispensables à undertanding ainsi que la prévision des manifestations cliniques de l'UTI et Cauti ^41. Dans cet article, nous démontrons la préparation de l'inoculum de la cystite UPEC isolons UTI89 et l'inoculation transurétrale de souris C3H / poule. En outre, nous démontrons un protocole pour l'insertion du cathéter dans des souris C57BL / 6 et de l'inoculation E. souche faecalis OG1RF. Ces deux techniques conduisent à UTI ou Cauti cohérente et fiable chez la souris. Nous affichons également des techniques utilisés pour observer la formation IBC au cours cystite aiguë et la collecte d'urine pour l'analyse de la cystite chronique ou récurrente. Souris C3H / HeN ont été utilisées pour étudier les aspects de la pathogenèse UPEC y compris invasion initiale bactérienne, la formation IBC, filamentation et le développement de la cystite chronique ^23,33,43. Ces paramètres de virulence ont également été étudiés dans une variété d'autres milieux de souris ^22,33. Pour Cauti, C57BL / 6 modèle permet pour l'implantation d'un corps étranger dans la vessie avec le co bactérienne ultérieureionisation, qui peut être maintenu pendant 7 jours après l'infection ^41. Ces modèles ont été utiles pour évaluer les mécanismes de virulence bactérienne, les réponses de l'hôte aux infections urinaires et des mécanismes de subvertir réponses de l'hôte, dont une grande partie a été ensuite récapitulées ou observés dans les populations humaines cliniques.

Protocole

Déclaration éthique: Le Comité des études animales Université de Washington a approuvé toutes les infections et les procédures souris dans le cadre de numéro de protocole 20120216, qui a été approuvé et expire 11/01/2013 11/01/2016. Prise en charge globale des animaux était compatible avec le guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches et le Guide des ressources Soins USDA animale. procédures d'euthanasie sont compatibles avec les "directives de l'AVMA pour l'euthanasie des animaux Edition 2013."

1. UPEC Protocole UTI, inoculation aiguille Préparation (Figure S1)

1. Retirez le bouchon de l'aiguille 30 G. Fil d'environ 1 pouce de tube PE10 sur l'arbre de l'aiguille. UV stériliser les ensembles d'aiguille pendant la nuit. Cathétérisés aiguilles peuvent être stockés indéfiniment dans des boîtes de Pétri stériles.

2. UPEC inoculum bactérien Préparation

1. Préparer UTI89 inoculum (début 72 h avant l'inoculumtion de jour)
   1. Streak UTI89 sur un milieu LB (Luria-Bertani) plaque de gélose à partir d'un stock congelé. Incuber une nuit à 37 ° C. Choisir une colonie et inoculer dans 10 ml de LB dans un ballon de 125 ml. Incuber à 37 ° C pendant 24 heures, de façon statique.
   2. Inoculer 10 pi de culture de nuit dans 10 ml de LB dans un nouveau flacon de 125 ml pour un 24 heures supplémentaires à 37 ° C, de manière statique.
   3. Transfert 3 ml (varient en fonction de la souche et la taille de l'inoculum désiré) à 1,5 ml tubes stériles et centrifuger à 7000 g pendant 3 min et remettre en suspension le culot dans 1x PBS et centrifuger une deuxième fois. Reprendre le culot bactérien dans 1 ml de PBS 1X.
2. Mesurer la densité optique et ajuster la concentration bactérienne de l'inoculum de densité souhaitée. La concentration standard de l'inoculum utilisé est de 10 ⁷ bactéries; Cependant, cela peut varier en raison de la conception de l'étude.

3. bactérienne inoculation

1. Nettoyez le poste de travail avec 70% d'éthanol et csur la zone avec du papier absorbant (ou utiliser une hotte à flux stérile).
2. Tirer jusqu'à 0,9 ml de l'inoculum bactérien préparé dans un 1 ml (TB) seringue (éliminer les bulles d'air). Fixez une aiguille d'inoculation stérile préparé avec PE10 tube, sur la seringue contenant l'inoculum, puis couper le tube stérile en polyéthylène.
   REMARQUE: Laissez 1 mm de tube dessus de la pointe de l'aiguille pour éviter la perforation de la vessie.
3. Coupez un morceau carré de 1 pouce de parafilm et de mettre un peu de lubrifiant chirurgicale (environ la taille d'un centime) sur le dessus.
4. Anesthésier les souris C3H / HeN femmes en les mettant dans un bocal en verre de 32 onces contenant une boule de thé-infusion avec des boules de coton imbibées de 3 ml d'isoflurane ou de la chambre de vaporisation (à la suite fabrique protocole) jusqu'à inconsciente mais respire encore normalement (1 respiration / sec) .
   NOTE: Certains comités IACUC ne pas approuver l'utilisation d'un pot ou un vaporisateur. S'il vous plaît suivre les indications du comité IACUC de votre institution.
   NOTE: Si bocal en verreavec du thé-ball et / ou cône de nez avec des boules de coton isoflurane soakd sont utilisés, l'animal doit être observé avec soin pour éviter surdose d'un anesthésique et de la mort. L'avantage d'utiliser une chambre de vaporisation et l'anesthésie est qu'elle permet l'administration de l'isoflurane contrôlée qui évite les surdoses accidentelles. ATTENTION: L'isoflurane est un anesthésique par inhalation. Utiliser dans un endroit bien ventilé et minimiser l'inhalation.
5. Débranchez la souris de la jarre / vaporisateur et placez-le sur le dos sur une serviette en papier et de diffuser les jambes.
6. Couvrir le nez de la souris avec un cône de nez (un tube relié à l'évaporateur qui fournit une dose contrôlée de isoflurance qui est équipé sur certaines unités vaporisateur) ou 50 ml tube conique avec une boule de coton contenant une petite quantité (environ 1-2 ml ) de l'isoflurane.
7. Palpiter doucement la vessie pour induire la miction et d'assurer une vessie annulé. Essuyez la région de l'urètre avec 100% d'éthanol essuyer. Tamponnez l'aiguille d'inoculation / seringue, premier point, dans lelubrifiant chirurgical.
8. Ensemencer chaque souris avec 50 ul de la solution de bactéries en insérant l'aiguille d'inoculation par voie transurétrale, environ 12 mm, et en appuyant vers le bas sur le piston de la seringue pour distribuer doucement l'inoculum dans la vessie doucement (10 ul / sec). Retirez l'aiguille d'inoculation de la souris.
   NOTE: retour immédiat de l'inoculum à l'ouverture de l'urètre en commençant à inoculer indique insertion incorrecte ou incomplète de l'aiguille.
9. Débranchez la souris de cône de nez et de le retourner dans sa cage. Répétez les étapes 3.3 à 3.8 pour chaque souris. Lorsque / si commutation inoculum conditions / souches, disposer de la seringue et l'aiguille d'inoculation dans un récipient pour objets tranchants approuvé et recommencer l'étape 3.2.
   NOTE: L'inoculation avec les organismes uropathogènes ne cause généralement pas de symptômes de douleur sévère. Cependant, dans de rares cas, l'administration de fortes doses d'agents pathogènes peut causer de la fièvre, la réduction de l'apport alimentaire et de l'eau et un comportement anormal. UNEla santé Nimal doit être surveillée tout au long de l'expérience. Si les symptômes de la douleur sont manifestes préavis, un analgésique, comme la buprénorphine (0,05-0,1 mg / kg par voie sous cutanée donnée), peuvent être appliquées. Les procédures devraient être en conformité avec IACUC de chaque institution.

4. Détermination des charges bactériennes

1. Préparer 5 ml des tubes séparés pour chaque paire de la vessie et des reins pour être récolté. Ajouter 1 ml de PBS / tubes / vessie 1x de la souris pour être récolté. Ajouter 0,8 ml de PBS 1x / tubes / paire de reins de souris pour être récolté. Étiqueter chaque tube pour correspondre à une souris donnée. Préparer une plaque de 96 puits contenant 180 pi de PBS 1x dans chaque puits pour 01h10 dilutions en série.
2. Nettoyer la zone de travail avec 70% d'éthanol et couvrir la zone avec une couverture ou une serviette en papier absorbant.
3. Anesthésier la souris avec l'isoflurane (voir l'étape 3.4) jusqu'à ce que la souris cesse de respirer pendant environ 1 min, puis placez-le sur la couverture ou une serviette en papier absorbant. D'autres méthodes de euthanasia sont également acceptés par les comités du IACUC, tels que le dioxyde de carbone, et peut être remplacé par overdose d'isoflurane.
4. Sacrifice la souris par dislocation cervicale rapide qui consiste à retenir le cou à la base de la tête et la queue tirant horizontalement loin du corps jusqu'à dislocation se produit.
   REMARQUE: La plupart des comités IACUC exigent un moyen secondaire de l'euthanasie et la dislocation cervicale est une méthode courante. Cependant, d'autres méthodes peuvent être utilisées si elles sont approuvées par le comité IACUC.
5. Placez la souris morte sur son dos et pulvériser éthanol à 70% sur l'abdomen. On dissèque la souris, la récolte de la vessie et des reins, en ce qu 'afin de minimiser les risques de contamination du sang suivant la dissection du rein. Placez les organes indépendamment préparés dans les tubes de 5 ml contenant 1x PBS (voir l'étape 4.1).
   NOTE: Utiliser différents ciseaux pour la dissection externe et pour le prélèvement d'organes à minimiser la contamination.
6. Appuyez sur le tube pour assurer les organes sont en til 1x PBS. Répétez l'étape 4,3-4,5 pour chaque souris. Ciseaux propres et pince à 70% d'éthanol après chaque souris.

5. bactérienne Recovery

1. Homogénéiser la vessie et des reins récoltée dans les tubes de 5 ml avec un homogénéiseur de tissu, par 15 sec 30 sec rein et par la vessie. Rincer homogénéiseur de façon séquentielle dans du PBS 1x, 70% d'éthanol et 1 x PBS entre les échantillons.
2. Faire des dilutions en série à 1:10 à 10 ^-8 et la plaque pour chaque dilution UFC (unités formant colonie) sur des plaques de gélose LB. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

6. IBC Enumeration

1. Retirer de manière aseptique la vessie et le placer dans 1x PBS dans une plaque à 6 puits avec un fond de silicone. Les plaques peuvent être préparés en utilisant un kit d'élastomère de silicone et en versant d'environ 1 cm de silicone dans chaque puits, voir instructions du fabricant. Couper la vessie dans la moitié avec des ciseaux.
2. En utilisant de petites broches métalliques évasement doucement le bladder de sorte que la lumière de la vessie est orientée vers le haut. Veillez à placer les broches sur les bords extérieurs des sections de la vessie pour assurer la quantité maximale de urothélium est exposée.
3. Après évasement, laver délicatement la vessie une fois avec PBS 1x. Retirez le 1x PBS à la pipette. Fixer la vessie en ajoutant suffisamment de paraformaldehyde à 3% pour couvrir toute la vessie évasée. ATTENTION: Paraformaldéhyde est cancérigène. Équipement de protection approprié, y compris des gants, doit être porté en tout temps. L'élimination doit suivre les directives institutionnelles.
4. Incuber à température ambiante pendant 1 heure. Enlever la solution de paraformaldéhyde. Laver une fois avec PBS 1x.
5. Laver avec une solution de lavage de LacZ (MgCl2 ₂ mM, désoxycholate de sodium à 0,01% et 0,02% nonidet-p40in 1x PBS) trois fois pour 5 min par lavage.
6. Enlever la solution de lavage et ajouter suffisamment LacZ tache (9,5 ml de solution de lavage LacZ, 0,4 ml 25 mg / ml de X-gal et 0,1 ml de 100 mM K-FERROCYANURE / K-FERRICYANURE) pour couvrir les vessies. Incuber à 30 ° C overniGHT abri de la lumière.
7. Retirer vessies écartés de l'incubateur et observer GRV, qui apparaissent puncta bleu comme visualisées avec un microscope à dissection, 40-60X grossissement.
   REMARQUE: Parfois, une souris peut uriner avant le placement du tube sous l'urètre. Dans ce cas, attendre 15-20 minutes avant de tenter de recueillir à nouveau urine.

7. Collection d'urine pour Bactériurie CFU Enumeration (Non applicable pour Cauti)

1. Pour recueillir l'urine avant ou après l'infection doucement retenir la souris en maintenant la queue et en le plaçant sur une surface plane élevée (en haut de la cage de la souris).
2. Maintenir un tube de 1,5 ml stérile sous l'urètre de la souris. Appuyez doucement sur le dos de la souris près de la queue pour faire pression sur la vessie. Catch l'urine dans le tube de 1,5 ml.
3. Assurez-série des dilutions 1:10 à 10 ^-7 et plaque chaque dilution sur LB. appropriée Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

8. Cauti Modèle de protocole, cathéter aiguille Préparation pour Cauti Modèle (Figure S2)

1. Retirez le bouchon de l'aiguille 30 G. Couper un morceau de tube PE10 et 5 mm morceau de tube de silicone tel que RenaSIL 7 mm. Enfilez l'aiguille avec PE10 tube jusqu'à ce que le tube touche la base de l'aiguille.
2. Puis nourrir la pièce de 5 mm sur l'aiguille contenant PE10. UV stériliser les aiguilles assemblées nuit.
   NOTE: En chargeant le tube de silicone, laissez environ 1 mm de la tubulure étendant au-delà de la pointe de l'aiguille.

9. E. faecalis OG1RF inoculum bactérien Préparation

1. Préparer OG1RF inoculum à partir de 48 heures avant le jour de l'inoculation. Streak OG1RF sur une BHI (infusion de coeur de cerveau) plaque à partir d'un stock congelé.
2. Choisissez une colonie et l'inoculer dans 10 ml de BHI et de croître de manière statique pendant 18 heures à 37 ° C. Centrifuger la culture et laver le culot (3 fois) en volumes de 1 ml de PBS stérile 1x.
3. Reprendre le culot bactérien dans PBS 1x. Mesurer la densité optique bactérienne et ajuster la concentration de la taille de l'inoculum souhaité. La concentration standard de l'inoculum utilisé est de 10 ^7; Cependant, cela peut varier en raison de la conception de l'étude

10. cathéter Implantation

1. Nettoyez le poste de travail avec 70% d'éthanol et couvrir la zone avec une couverture absorbante (ou utiliser une hotte à flux stérile).
2. Fixez cathéter-aiguille à un vide de 1 ml (TB) seringue. Coupez un morceau carré de 1 pouce de parafilm et de mettre un peu de lubrifiant chirurgicale (environ la taille d'un centime) sur le dessus.
   REMARQUE: Deux aiguilles différentes sont utilisées pour le dépôt du cathéter et de l'inoculum à l'inoculation accidentelle minimisée en raison de la manipulation mécanique nécessaire pour cathéter implantation. Ceci permet aussi pour des raisons de commodité de préparation moins aiguilles d'inoculation.
3. Anesthésier souris C57BL / 6 en les mettant dans un bocal en verre de 32 onces contenant un thé-infuser balle avec des boules de coton trempé dans 3 ml d'isoflurane ou de la chambre de vaporisation (à la suite fabrique protocole) jusqu'à inconsciente mais respire encore normalement (1 respiration / sec).
4. Ensuite, placez la souris sur le dos sur une serviette en papier et de répandre les jambes. Couvrir le nez de la souris avec un cône de nez ou 50 ml tube conique avec des boules de coton contenant une petite quantité (environ 1-2 ml) de l'isoflurane.
   ATTENTION: L'isoflurane est un anesthésique par inhalation. Utiliser dans un endroit bien ventilé et minimiser l'inhalation par le chercheur.
5. Palpiter doucement la vessie pour induire la miction et d'assurer une vessie annulé. Essuyez région de l'urètre avec un éthanol à 100% essuyer.
6. Désinfectez la région de l'urètre avec une solution de povidone-iode à 10% en utilisant un applicateur coton-tige. Tamponnez l'aiguille d'inoculation / seringue, premier point, dans le lubrifiant chirurgicale.
   REMARQUE: Povidone-iode est utilisé pour l'implantation du cathéter, qui est une solution aseptique plus fort que l'alcool. Cathéter implantation nécessiteplus manipulation mécanique pour insérer le cathéter et donc un plus grand risque de contamination.
7. Insérer le cathéter dans l'ouverture de l'urètre. Une fois dans, l'utilisation des pinces pour pousser le (PE10 7 mm) de long morceau vers la vessie, par conséquent, la poussée (5 mm silicone) petit cathéter et le déposer dans la vessie. Retirez l'aiguille, avec le tube de 7 mm encore attaché, immédiatement.

11. bactérienne inoculation

1. Suivez le protocole d'inoculation bactérienne dans l'article 3, en utilisant l'inoculum préparé à partir de la section 9. Retirer la souris du cône de nez et de le retourner dans sa cage

12. A chaque point Temps de Sacrifice

1. Préparer tubes de 5 ml pour la vessie et les reins (organes Pour suivre l'étape 4.1) et 1,5 ml tube Eppendorf pour les cathéters. Ajouter 1 ml de 1 x PBS à 1,5 ml pour des échantillons tube Eppendorf de cathéter
2. Suivez les étapes 4.3 à 4.5. Disséquer la souris, la récolte de la vessie, les reins et le cathéter, plaCING les tissus indépendamment en 5 ml tubes contenant 1x PBS et le cathéter dans le Eppendorf de 1,5 ml (voir l'étape 12.1).
   NOTE: Utiliser différents ciseaux pour la dissection externe et pour le prélèvement d'organes et de récupération de cathéter pour minimiser la contamination
3. Ensuite, suivez l'étape 4.6.

13. bactérienne Recovery

1. Pour les organes, suivez les étapes 5.1 et 5.2. Pour la récupération des bactéries à partir de cathéters, vortex à la vitesse maximale pendant 30 s, sonication des échantillons de cathéter pendant 5 minutes en utilisant un sonicateur à bain, puis vortex à la vitesse maximale pendant encore 30 secondes.
2. Assurez-série des dilutions 1:10 à 10 ^-8 et plaque chaque dilution pour UFC recensement sur ​​des plaques BHI. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

Résultats

Les modèles intravésicale d'UTI associée simple et le cathéter fournissent des plates-formes flexibles pour élucider les mécanismes moléculaires de la pathogénie bactérienne, l'impact de ces maladies sur les tissus de l'hôte, et le développement et l'essai de nouvelles approches pour gérer ces infections courantes et coûteuses. Selon la souche de souris et pathogène, l'inoculation intravésicale peut être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène à élucider les facteu...

Discussion

Communauté simple acquis UTI est une infection courante et coûteuse qui représente plusieurs millions de visites de soins primaires chaque année ^46. En outre, CAUTIS sont une infection acquise de santé commun qui est devenu extrêmement coûteux pour les fournisseurs de soins de santé que les Centres de services Medicare et Medicaid ne rembourse les fournisseurs pour le coût supplémentaire de traitement résultant de l'hôpital acquis Cauti ^45. Les modèles de souris de l'UTI, tant ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles	BD Precision Glide	305106	30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 inches
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 inches x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1x Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299