JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

זיהומים בדרכי שתן (UTI) הם נפוצים ביותר, גורם משמעותי לתחלואה והם עמידים יותר ויותר לטיפול באנטיביוטיקה. נקבות נגועות באופן לא פרופורציונאלי על ידי דלקת בדרכי שתן: 50% מכלל הנשים יהיו UTI בחייהם. בנוסף, 20-40% מהנשים האלה שיש להם דלקת בדרכי שתן ראשוני יסבלו הישנות עם כמה הישנויות תכופות הסובלות מהידרדרות חמורה באיכות חיים, כאב ואי נוחות, שיבוש של פעילויות יומיומיות, גדלו עלויות בריאות, וכמה אפשרויות טיפול אחרים מטיפול מונע באנטיביוטיקה לטווח ארוך. coli Uropathogenic Escherichia (UPEC) הוא הסוכן סיבתי העיקרי של קהילה רכש UTI. הדלקת בדרכי השתן הקשורים צנתר (CAUTI) הוא הזיהום השכיח ביותר בבית החולים רכשו היווה מיליון התרחשויות בארה"ב מדי שנה, ועלויות בריאות דרמטיות. בעוד UPEC הוא גם הגורם העיקרי לCAUTI, סוכני סיבה אחרים הם בעלי חשיבות מוגברת כוללים אנטרוקוקוסfaecalis. כאן אנו מנצלים שני מודלים עכבר מבוססים היטב כי לשחזר רב של המאפיינים הקליניים של מחלות בבני אדם אלה. לדלקת בדרכי שתן, מודל C3H / חן משחזר רב מהתכונות של אלימות UPEC נצפו בבני אדם ובכלל זה תגובות מארחות, היווצרות מבני תעשייה וfilamentation. לCAUTI, מודל באמצעות C57BL / 6 עכברים, אשר שומרים על שתלי שלפוחית ​​השתן קטטר, הוכח להיות רגיש לE. faecalis דלקת בשלפוחית ​​השתן. מודלים נציג אלה נמצאים בשימוש כדי להשיג תובנות חדשות בולטות לפתוגנזה של מחלה בדרכי שתן, שמובילה לפיתוח תרופות חדשניות ואסטרטגיות ניהול או מניעה.

Introduction

זיהומים בדרכי שתן (זיהומים בדרכי שתן) הם אחד הזיהומים חיידקיים הנפוצים ביותר וניתן לחלק לשתי קטגוריות המבוססות על המנגנון של רכישה, קהילה וnosocomial רכש UTI. זיהומים בדרכי השתן מתרחשים לעתים קרובות בנשים ומחקרים בריאים נרכשה בקהילה הראה כי כ -50% מהנשים יהיו לפחות אחד UTI בחייהם 1. בנוסף, הישנות היא בעיה עיקרית. יש אישה שיש הדבקה ראשונית סיכוי 25-40% שיש לו זיהום שני בתוך שישה חודשים למרות טיפול אנטיביוטי מתאים, ונשים רבות ממשיכים להיות הישנויות תכופות 2. החיידקים הגורמים לזיהומים אלה גם הופכים יותר ויותר עמידים לאנטיביוטיקה פרוטוקולים נוספים של בלבול טיפול 3-6. דלקת בדרכי השתן משפיעים על מיליוני אנשים בכל שנה עולים כ -2.5 מליארד דולרים בהוצאות הקשורות בריאות בארה"ב, מה שמדגיש את ההשפעה והשכיחות של המחלה1,7 .Nosocomial רכש זיהומים בדרכי שתן קשורים בעיקר עם הנוכחות של גופים זרים כגון צנתרים שכינה. הזיהומים בדרכי השתן הקשורים צנתר (CAUTI) יישאר nosocomial הנפוץ ביותר רכש UTI, והיוו ~ 70-80% מזיהומים כגון 8. יתר על כן, CAUTI קשור עם תחלואה ותמותה מוגברות וזה הגורם הנפוץ ביותר לזיהומים בדם משניים 9.

הקהילה קשורה UPEC רכשה זיהומים בדרכי השתן הם חשבו להיגרם על ידי ההקדמה של חיידקים לשלפוחית ​​השתן ממאגרים במערכת העיכול באמצעות מניפולציה מכאנית במהלך קיום יחסי מין, היגיינה הלקויה או דינמיקת אוכלוסיית חיידקים אחרת בין מארח שונה נישות 10. ברגע שנכנס לשלפוחית ​​השתן, UPEC להעסיק גורמים ארסי רבים, כולל כמוסה, מערכות רכישת ברזל, רעלים, פלסמיד ארסיות, tRNAs, איי פתוגניות וגורמי התישבות שהוכחו לשחק תפקיד בפתוגנזה 11-14. קריטי להקמתה של התישבות UPEC, UPEC גם לקודד סוגים שונים של פילי מלווה דבק סדרן מסלול (CUP) שמכירים קולטנים עם סגוליות stereochemical 15. פילים מסוג 1, הטו עם adhesin FimH, באים לידי הביטוי על ידי UPEC ולאגד mannosylated uroplakins 16 וα-1, β-3 integrins 17, אשר באים לידי ביטוי על פני השטח luminal של שני שלפוחיות האדם ועכבר 18. אינטראקציות בתיווך FimH אלה להקל קולוניזציה ופלישה של תאי האפיתל השטחיים 19,20 חיידקים. פעם בתוך התא, UPEC יכול לברוח לתוך הציטופלסמה שבי חיידק בודד במהירות יכול לחלק ליצירת קהילה תאית חיידקים (IBC), אשר על התבגרות, יכול להכיל ~ 10 4 חיידקים 21. היווצרות IBC הודגמה בלפחות שישה זנים שונים עכבר, C3H / חן, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / ניו ג'רזי וBALB / ג, ועם מגוון רחב של UPE שונהזני C וEnterobacteriaceae 22-24 אחר. עם זאת הבדלי זמן ומרחב של היווצרות IBC יכולים להשתנות בהתאם לרקע העכבר ומתח UPEC הדבקה. בC3H / עכברי חן נגועים בUPEC הטיפוסי זני UTI89 או היווצרות CFT073, IBC ניתן דמיינו כbiomasses הקטן של חיידקים מוקדם ככל 3 HPI (לאחר זיהום שעות). קהילה זו ממשיכה להתרחב ומגיעה "נקודת אמצע" של הפיתוח כ -6 HPI כאשר חיידקי המוט בצורה לכבוש אחוז גדול של מרחב cytoplasmic של תאי מטרייה שטחיים סופני הבדיל צורת IBCs המוקדם אלה באופן יחסי סינכרוני עם הרוב בו מוצגות ממדים דומים ומורפולוגיות. ~ 8 HPI החיידקים בשינוי IBC מחיידקים לCocci מורפולוגיה. IBCs הם בעלת האופי ארעי. לפיכך, התבגרות IBC 12-18 תוצאות HPI בהמשך ההתרחבות של אוכלוסיית החיידקים, ואחריו filamentation ופיזורם מחוץ לתא with התפשטות לאחר תאים שכנים 23. כך, הנישה IBC מאפשרת התפתחות חיידקים מהירה בסביבה המוגנת מפני תגובה חיסונית מארח ואנטיביוטיקה 25. השלבים שונים של זיהום UPEC כי הם ראו בעכברים גם הם נצפו בבני אדם, כגון IBCs וfilamentation, התומכים במודל העכבר של UTI ככלי מועיל שיכול לשמש מודל UTI בבני האדם 22,26-28.

בעוד שרוב הנשים חווים UTI בחייהם, התוצאה של זיהומים אלה יכול לנוע בין זיהום הגבלה עצמית חריף ללא הישנות, לדלקת שלפוחית ​​השתן חוזרת ונשנית בתדירות גבוהה. יתר על כן, מחקרים הראו התרחשות משפחתית חזקה של דלקת בדרכי שתן, המצביע על מרכיב גנטי תורם לרגישות UTI 29. מצאנו כי תוצאות UTI השונות ראו במרפאות יכולות להיות שיקוף על ידי התוצאות השונות של זיהום UPEC הניסיוני בין זנים טהורים עכבר 30. לדוגמא, C3H / חן, CBA, עכברי DBA, וC3H / HeOuJ רגישים, באופן תלוי מינון זיהומיות, לדלקת שלפוחית ​​השתן לטווח ארוך, כרונית המאופיין על ידי חיידקים מתמשכים, גבוהים כייל (> 10 4 יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מיליליטר), חיידקים גבוה כייל נטל שלפוחית ​​השתן בהקרבה> 4 שבועות לאחר זיהום (WPI), דלקת כרונית, ונמק urothelial. עכברים אלה גם להציג רמות גבוהות בסרום של IL-6, G-CSF, KC, וIL-5 בתוך 24 HPI הראשון המשמשות כסמנים ביולוגיים להתפתחות דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית. זה עשוי לייצג במדויק את המהלך הטבעי של דלקת בדרכי שתן בנשים מסוימות, כמו מחקרי פלצבו הראו כי אחוז גדול של נשים חווים UTI ישמור על רמות גבוהות של חיידקים בשתן שלהם במשך כמה שבועות לאחר התסמינים הראשונים של דלקת שלפוחית ​​השתן אם לא ניתן טיפול אנטיביוטי 31 , 32. יתר על כן, שימוש בעכברי C3H / חן, מצאנו כי היסטוריה של דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית מהווה גורם סיכון משמעותי לזיהומים חוזרים ונשנים חמורים שלאחר מכן. חוזר ונשנה בדרכי השתן הוא הכי siביטוי קליני gnificant של UTI ועכבר C3H / חן הוא כיום המודל למד רק שמשחזר נטייה מוגברת לאחר החשיפה קודמת. תוצאת UTI שנייה סכמה בC57Bl / 6 עכברים שבו זיהום UPEC החריף הוא הגבלה עצמית, עם רזולוציה של דלקת שלפוחית ​​השתן ובקטרוריה בתוך כשבוע. מעניין לציין, במודל זה, UPEC ליצור בקלות מאגרים תאיים שקטים בתוך רקמת שלפוחית ​​השתן ממנו UPEC מסוגל מתעורר ממצב רדום כדי לחדש את UTI פעיל, שעלול להסביר מנגנון אחד לדלקת בדרכי שתן חוזר אותו זן בבני אדם 33, 34.

בנוסף להשפעות גנטיות על רגישות UTI, הקדמה של קטטר לשלפוחית ​​השתן מגדילה מאוד את הסיכוי שיש זיהום, כמו גם להגדיל את הטווח של חיידקים מסוגלים לגרום לזיהום. הוכח כי צנתור שתן אנושי גורם היסטולוגית ושינויים חיסוניים בשלפוחית ​​עקב לחץ מכאני שגורם לתגובה דלקתית חזקה, קילוף, בצקת של propria lamina וsubmucusa, הדליל urothelial, ונגע ברירית של urothelium וכליות 35,36. בנוסף, קטטר מספק משטח לקובץ מצורף חיידקים ובכך ליצור סביבה מנוצלת על ידי כמה מינים לגרום CAUTI. בעוד UPEC עדיין תורם רב, אנטרוקוקוס faecalis מהווה 15% מCAUTI אלה 37. א faecalis הופך עמיד יותר ויותר לאנטיביוטיקה עם vancomycin הופעת התנגדות, שהתחזה לדאגה בריאותית רצינית 38. א faecalis להחזיק גורמים ארסי רבים, כולל רעלים וadhesins הכרחי לקובץ מצורף לשני קטטר ואפיתל 38. במהלך צנתור שתן, המארח הוא פגיע להידבקות של חיידקים, כפל והפצה ב39,40 בדרכי השתן. א faecaליס יוצר biofilm על קטטר כחלק ממנגנון להתמיד בשלפוחית ​​השתן ולהפיץ לכליות, אשר הוא לשחזר במודל עכבר CAUTI 41. לאחרונה, זה הוכח במהלך צנתור שתן, פיברינוגן (FG) הוא שוחרר לתוך שלפוחית ​​השתן כחלק מהתגובה הדלקתית. FG מצטבר בשלפוחית ​​השתן, מעילי קטטר וחיוני לE. faecalis היווצרות biofilm, מתפקד כפיגום מצורף. במודל C57BL / 6 עכבר של CAUTI, גילה שE. היווצרות faecalis biofilm על קטטר, ובכך ההתמדה בשלפוחית ​​השתן, הייתה תלוי בpilus EBP, במיוחד EbpA adhesin קצהו. מצאנו כי תחום N- המסוף של EbpA נקשר במיוחד לFG ציפוי קטטר. בנוסף, נמצא כי א faecalis מנצל FG כמקור המטבוליט במהלך זיהום, וכך לשפר את היווצרות biofilm 42.

מודלים של העכברים הוכיחו קריטיים לאחורייםtanding כמו גם חיזוי הקליני של דלקת בדרכי השתן וCAUTI 41. במאמר זה אנו מדגימים הכנת הבידוד של דלקת שלפוחית ​​השתן UPEC לבודד UTI89 וחיסון של עכברים דרך השופכה C3H / חן. בנוסף, אנחנו מדגימים פרוטוקול להכנסה קטטר בעכברי C57BL / 6 וחיסון של א ' זן faecalis OG1RF. שתי טכניקות אלו להוביל לדלקת בדרכי שתן עקבית ואמינים או CAUTI בעכברים. אנחנו גם להציג טכניקות המשמשות להתבונן היווצרות IBC בדלקת שלפוחית ​​השתן חריפה ואיסוף שתן לניתוח דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני או חוזר ונשנה. עכברי C3H / חן שימשו ללמוד היבטים של הפתוגנזה UPEC כולל פלישה ראשונית חיידקים, היווצרות IBC, filamentation והפיתוח של דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני 23,33,43. פרמטרים אלה גם ארסיות נחקרו במגוון רחב של רקעי עכבר אחרים 22,33. לCAUTI, C57BL / 6 המודל מאפשר להשתלת גוף זרה לתוך שלפוחית ​​השתן עם עמיתי חיידקים הבאיםlonization, שיכול להישמר במשך 7 ימים לאחר הזיהום 41. מודלים אלה היו שימושיים להערכת מנגנוני אלימות של חיידקים, תגובות מארחות לדלקת בדרכי השתן ומנגנונים לערער תגובות מארחות, הרבה מהם כבר סכמו או שנצפו באוכלוסיות אנושיות קליניות לאחר מכן.

Protocol

הצהרת אתיקה: ועדת בעלי החיים באוניברסיטת וושינגטון המחקרים אישרה את כל זיהומי העכבר ונהלים כחלק מפרוטוקול מספר 20120216, אשר אושר על 2013/01/11 ויפוג 2016/01/11. טיפול כולל של בעלי החיים היה בקנה אחד עם הוראות לטיפול ושימוש בחי המעבדה מהמועצה הלאומית למחקר וטיפול במשאבי מדריך משרד החקלאות בעלי החיים. נהלי המתת חסד בקנה אחד עם "הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים 2,013 מהדורה."

1. UPEC UTI פרוטוקול, הרכבה מחט הכנה (איור S1)

  1. הסר את מכסה מחט G 30. נושא כ 1 אינץ 'של צינור PE10 על הפיר של המחט. UV לעקר את מכלולי מחט לילה. ניתן לאחסן מחטי צינתור ללא הגבלת זמן בצלחות פטרי סטרילי.

2. UPEC קטריאלי הבידוד הכנה

  1. הכן הבידוד UTI89 (להתחיל 72 שעות לפני inoculaיום tion)
    1. פס UTI89 על צלחת אגר LB (לוריא-Bertani) ממניות קפוא. דגירה הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס. פיק מושבה ולחסן אותו לתוך 10 מיליליטר של LB בבקבוק 125 מיליליטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, באופן סטטי.
    2. לחסן 10 μl של תרבות הלילה ל -10 מיליליטר של LB בבקבוק 125 מיליליטר חדש ל24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, באופן סטטי.
    3. העברת 3 מיליליטר (משתנה בהתאם לזן וגודל הבידוד רצוי) לצינורות 1.5 מיליליטר סטרילי וצנטריפוגות ב 7000 XG במשך 3 דקות וresuspend גלולה ב1x PBS ו צנטריפוגות בפעם שנייה. Resuspend גלולה החיידקים ב 1 מיליליטר 1x PBS.
  2. למדוד צפיפות אופטית חיידקים ולהתאים ריכוז לצפיפות הבידוד הרצוי. הריכוז הסטנדרטי של הבידוד המשמש הוא 10 7 חיידקים; עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם לעיצוב של המחקר.

3. בקטריאלי חיסון

  1. נקה את תחנת העבודה עם 70% אתנול ו גמעל האזור עם נייר סופג (או להשתמש בזרימת מכסה המנוע סטרילי).
  2. לצייר עד 0.9 מיליליטר של הבידוד החיידקים מוכן לתוך מזרק 1 מיליליטר (TB) (להסיר בועות אוויר). צרף מחט סטרילית חיסון מוכן עם צינור PE10, על המזרק המכיל את הבידוד, אז סטרילי לקצץ צינורות פוליאתילן.
    הערה: השאר 1 מ"מ של צינורות מעל קצה המחט כדי למנוע ניקוב שלפוחית ​​השתן.
  3. חותכי חתיכה מרובעת 1 אינץ 'של parafilm ולשים טיפה של חומר סיכה כירורגית (בערך בגודל של מטבע) על גבי.
  4. הרדימי עכברי C3H / חן נשיים על ידי לשים אותם בצנצנת זכוכית 32 אונקיה מכילה תה infuser כדור עם כדורי צמר גפן טבול עם 3 מיליליטר של isoflurane או תא אידוי (הבאות מייצר פרוטוקול) עד ​​מחוסר הכרה אך עדיין נושם באופן נורמלי (נשימת 1 / sec) .
    הערה: ועדות IACUC חלק לא לאשר את השימוש בצנצנת או מאדה. בצע את אינדיקציה לועדת IACUC של המוסד שלך.
    הערה: אם צנצנת זכוכיתעם תה-כדור ו / או חרטום עם כדורי צמר גפן isoflurane-soakd משמשים, בעלי החיים חייבים להיות שנצפו בזהירות למניעת מינון יתר ומות הרדמה. היתרון של שימוש בתא אידוי והרדמה הוא שהיא מספקת ממשל isoflurane מבוקר שימנע מינון יתר מקרי. זהירות: Isoflurane היא הרדמה משאיפת. השתמש באזור מאוורר היטב ולמזער שאיפה.
  5. הסר את העכבר מהצנצנת / מאדה ולמקם אותו על הגב שלה על מגבת נייר ולהפיץ את הרגליים.
  6. מכסה את האף של העכבר עם חרטום (צינור המחובר למכשיר האדים המספק מינון מבוקר isoflurance שמגיע מאובזר בכמה יחידות מאדה) או צינור חרוטי 50 מיליליטר עם כדור צמר גפן המכיל כמות קטנה (כ 1-2 מיליליטר ) של isoflurane.
  7. בעדינות פועם שלפוחית ​​שתן ולגרום להבטיח שלפוחית ​​השתן בטלה. נגב את אזור periurethral עם אתנול 100% לנגב. מורח את מחט חיסון / מזרק, הנקודה ראשונה, לחומר סיכה כירורגית.
  8. לחסן כל עכבר עם 50 μl של פתרון חיידקים על ידי החדרת מחט חיסון transurethrally, כ 12 מ"מ, ולחיצה על בוכנת המזרק בעדינות לוותר הבידוד לתוך שלפוחית ​​השתן בעדינות (10 μl / sec). הסר את מחט החיסון מהעכבר.
    הערה: תמורה מיידי של הבידוד בפתיחת השופכה כאשר מתחיל לחסן מציינת הכנסה תקינה או לא שלמה של המחט.
  9. הסר את העכבר מהחרטום ולהחזיר אותו לכלוב שלה. חזור על שלבים 3.3-3.8 עבור כל עכבר. כאשר / אם מיתוג תנאים / זני הבידוד, להשליך את המזרק ומחט חיסון במכל חדים אושר ומתחילים שלב 3.2 שוב.
    הערה: חיסון עם אורגניזמים uropathogenic בדרך כלל אינו גורם לתסמיני כאב חמורים. עם זאת, במקרים נדירים, מתן מינונים גדולים של פתוגנים עלול לגרום לחום, ירידה בצריכת מזון ומים והתנהגות חריגה.בריאות nimal צריכה להיות במעקב לאורך כל הניסוי. אם תסמיני כאב גלויים הם הודעה, משכך כאבים, כגון עצירות (0.05-0.1 מ"ג תת עורי / קילוגרם נתון), יכול להיות מיושם. נהלים צריכים להיות בהתאם לIACUC של כל מוסד.

4. קביעת הניטל בקטריאלי

  1. הכן 5 מיליליטר צינורות נפרדים לכל זוג בשלפוחית ​​השתן ובכליות להיות שנקטפו. הוסף 1ml של PBS / צינור / שלפוחית ​​השתן עכבר 1x להיות שנקטפו. להוסיף 0.8 מיליליטר של 1x PBS / צינור / זוג כליות עכבר כדי לקצור. תווית צינור אחד למתאים לעכבר נתון. הכן צלחת 96-היטב המכילה 180 μl של 1x PBS בכל טוב לדילולים 1:10 סדרתי.
  2. נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% ולכסות את האזור עם מגבת או נייר סופג כיסוי.
  3. להרדים את העכבר עם isoflurane (ראה שלב 3.4) עד העכבר מפסיק לנשום למשך כ 1 דק ', ואז למקם אותו על מגבת כיסוי או נייר הסופג. שיטות אחרות של euthanaSIA גם מתקבלים על ידי ועדות IACUC, כגון פחמן דו חמצני, וניתן להחליף למנת יתר isoflurane.
  4. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם מהיר שמורכב מריסון הצוואר בבסיס הראש ומושך את הזנב אופקי מהגוף עד פריקה מתרחשת.
    הערה: ועדות רוב IACUC דורשות אמצעים משניים של המתת חסד ונקע בצוואר הרחם היא שיטה נפוצה. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטות אחרות אם אושרו על ידי ועדת IACUC.
  5. מניחים את העכבר המת על הגב שלה ולרסס אתנול 70% על הבטן. לנתח את העכבר, לקצור את שלפוחית ​​השתן וכליות, על מנת שכדי למזער אפשרות של זיהום מהדם לאחר נתיחת הכליות. מניחים את האיברים באופן עצמאי לתוך 5 מיליליטר הצינורות מוכנים המכילים 1X PBS (ראה שלב 4.1).
    הערה: השתמש במספריים שונים לנתיחה החיצונית ולקצירת איברים כדי למזער זיהום.
  6. הקש הצינור כדי להבטיח את האיברים נמצאים בtהוא 1X PBS. חזור על שלב 4.3-4.5 עבור כל עכבר. מספריים נקיים ומלקחיים באתנול 70% לאחר כל עכבר.

שחזור קטריאלי 5.

  1. Homogenize שלפוחית ​​השתן וכליות שנקטפו ב 5 מיליליטר הצינורות עם homogenizer רקמות, 15 שניות לכליות ושלפוחית ​​שתן 30 שניות ל. יש לשטוף ברצף homogenizer ב1x PBS, 70% אתנול ו 1x PBS בין דגימות.
  2. הפוך דילולים 1:10 סדרתי החוצה עד 10 -8 וצלחת כל דילול לCFU (יחידות מושבה להרכיב) על צלחות אגר LB. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור מושבות למחרת.

6. IBC ספירה

  1. הסביבה נקיה מחיידקים להסיר את שלפוחית ​​השתן ולמקם אותו בPBS 1x בצלחת 6-היטב עם תחתית סיליקון. ניתן להכין צלחות באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון ולשפוך כ 1 סנטימטר של סיליקון בכל טוב, לראות מייצר הוראות. חותך את שלפוחית ​​השתן במחצית באמצעות מספריים.
  2. באמצעות סיכות מתכת קטנות בעדינות פסוק את bladder כך שלומן שלפוחית ​​השתן פונה כלפי מעלה. הקפד למקם את הסיכות בקצוות החיצוניים של חלקי שלפוחית ​​השתן כדי להבטיח את הסכום המקסימאלי של urothelium חשוף.
  3. לאחר נתלכסנו, לשטוף בעדינות את שלפוחית ​​השתן פעם עם PBS 1x. הסר את PBS 1x ידי pipet. תקן את שלפוחית ​​השתן על ידי הוספת paraformaldehyde 3% מספיק כדי לכסות את שלפוחית ​​השתן פרושות כולו. זהירות: Paraformaldehyde הוא מסרטנת. ציוד מתאים מגן, כוללים כפפות, צריך להיות משוחק בכל העת. רשות צריכה לעקוב אחר הנחיות מוסדיות.
  4. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. הסר פתרון paraformaldehyde. לשטוף פעם אחת עם 1X PBS.
  5. לשטוף עם פתרון לשטוף LacZ (2 מ"מ MgCl 2, 0.01% deoxycholate נתרן ושל 0.02% nonidet-p40in 1x PBS) שלוש פעמים במשך 5 דקות לכל לשטוף.
  6. הסר פתרון לשטוף ולהוסיף מספיק כתם LacZ (9.5 מיליליטר הפתרון לשטוף LacZ, 0.4 מיליליטר 25 מ"ג / מיליליטר X-gal ו 0.1 מיליליטר של 100 מ"מ K-ferrocyanide / K-ferrIcyanide) כדי לכסות את השלפוחיות. לדגור על 30 מעלות צלזיוס overnigHt מוגן מפני אור.
  7. הסר שלפוחיות פרושות מחממה ולבחון IBCs, המופיעים puncta הכחול כמו דמיין עם היקף לנתח, הגדלת 40-60X.
    הערה: לפעמים עכבר עשוי להשתין לפני המיקום של הצינור מתחת לשופכה. במקרה זה, לחכות 15-20 דקות לפני שתנסה לאסוף שתן שוב.

אוסף 7. תן לבקטרוריה CFU ספירה (לא ישים לCAUTI)

  1. לאסוף מראש שתן או לאחר זיהום בעדינות לרסן את העכבר על ידי לחיצה על הזנב ולמקם אותו על משטח מוגבה שטוח (החלק העליון של כלוב עכבר).
  2. החזק צינור 1.5 מיליליטר סטרילי תחת השופכה העכבר. לחץ בעדינות על הגב של העכבר ליד הזנב כדי להפעיל לחץ על שלפוחית ​​השתן. לתפוס את השתן בצינור 1.5 מיליליטר.
  3. הפוך דילולים 1:10 סדרתי אל 10 -7 וצלחת כל דילול על יטראות מתאימות דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור מושבות למחרת.

8. CAUTI דגם פרוטוקול, צנתר מחט ההכנה לCAUTI דגם (איור S2)

  1. הסר את מכסה מחט G 30. חותכי חתיכה של צינור PE10 ו -5 מ"מ חתיכה של צינורות סיליקון כגון RenaSIL 7 מ"מ. השחל את המחט עם צינור PE10 עד צינורות נוגעים הבסיס של המחט.
  2. לאחר מכן להאכיל את פיסת 5 מ"מ על המחט המכיל PE10. UV לעקר את מכלולי מחטי לילה.
    הערה: בעת טעינת צינורות סיליקון, להשאיר כ 1 מ"מ של צינורות הארכת עבר קצה המחט.

9. E. faecalis OG1RF קטריאלי הבידוד הכנה

  1. הכן הבידוד OG1RF מתחיל 48 שעות לפני יום החיסון. פס OG1RF על צלחת BHI (עירוי לב מוח) ממניות קפוא.
  2. פיק מושבה ולחסן אותו לתוך 10 מיליליטר של BHI ולגדל אותו באופן סטטי במשך 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התרבות ולשטוף את הכדור (3 פעמים) ב 1 מיליליטר כרכים של סטרילי 1X PBS.
  3. Resuspend גלולה חיידקים לתוך 1x PBS. למדוד צפיפות אופטית חיידקים ולהתאים את הריכוז לגודל הבידוד הרצוי. הריכוז הסטנדרטי של הבידוד המשמש הוא 10 7; עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם לעיצוב של המחקר

10. צנתר השרשה

  1. נקה את תחנת העבודה עם 70% אתנול ולכסות את האזור עם כיסוי סופג (או להשתמש בזרימת מכסה המנוע סטרילי).
  2. צרף צנתר-מחט למזרק 1 מיליליטר ריק (שחפת). חותכי חתיכה מרובעת 1 אינץ 'של parafilm ולשים טיפה של חומר סיכה כירורגית (בערך בגודל של מטבע) על גבי.
    הערה: שתי מחטים שונות משמשות לתצהיר של הצנתר ולבידוד לחיסון מקרי ממוזער בשל המניפולציה המכנית הנדרשת להשתלת צנתר. זה גם מאפשר לנוחיות הכנת מחטי חיסון פחות.
  3. הרדימי עכברי C57BL / 6 על ידי לשים אותם בצנצנת זכוכית 32 אונקיה מכילה תהכדור -infuser עם כדורי צמר גפן טבול ב3 מיליליטר של isoflurane או תא אידוי (הבא מייצר פרוטוקול) עד ​​מחוסר הכרה אך עדיין נושם באופן נורמלי (נשימת 1 / sec).
  4. ואז לשים את העכבר על גבה על מגבת נייר ולהפיץ את הרגליים. מכסה את האף של העכבר עם חרטום או צינור חרוטי 50 מיליליטר עם כדורי צמר גפן המכילים כמות קטנה (כ 1-2 מיליליטר) של isoflurane.
    זהירות: Isoflurane היא הרדמה משאיפת. השתמש באזור מאוורר היטב ולמזער משאיפת על ידי חוקר.
  5. בעדינות פועם שלפוחית ​​שתן ולגרום להבטיח שלפוחית ​​השתן בטלה. נגב אזור periurethral עם אתנול 100% לנגב.
  6. לחטא את אזור periurethral עם 10% פתרון povidone- יוד באמצעות מוליך כותנה-טיפ. מורח את מחט חיסון / מזרק, הנקודה ראשונה, לחומר הסיכה כירורגית.
    הערה: Povidine-יוד משמשת להשתלת צנתר, שהוא פתרון ספטית חזק יותר מאלכוהול. השתלת צנתר דורשתמניפולציה מכאנית יותר להכניס את הצנתר ובכך פוטנציאל גדול יותר לזיהום.
  7. הכנס את קטטר לתוך הפתח השופכה. פעם אחת ב, פינצטה השימוש לדחוף (PE10 7 מ"מ) החתיכה הארוכה לכיוון שלפוחית ​​השתן, וכתוצאה מכך דוחפת (סיליקון 5 מ"מ) צנתר קטן והפקדתו לשלפוחית ​​השתן. הסר את המחט, עם צינורות 7 מ"מ עדיין מחוברים, באופן מיידי.

11. בקטריאלי חיסון

  1. בצע את פרוטוקול חיסון החיידקים בסעיף 3, באמצעות הבידוד מוכן מסעיף 9. הסר את העכבר מהחרטום ולהחזיר אותו לכלוב שלה

12. בכל נקודת זמן של קורבן

  1. הכן 5 מיליליטר צינורות לשלפוחית ​​שתן וכליות (לאיברים אחרי שלב 4.1) ו -1.5 מיליליטר צינור Eppendorf לצנתרים. הוסף 1 מיליליטר של 1x PBS לתוך 1.5 מיליליטר צינור Eppendorf לדגימות קטטר
  2. בצע את השלבים 4.3-4.5. לנתח את העכבר, קצירת שלפוחית ​​השתן, הכליות וקטטר, PLAcing הרקמות באופן עצמאי לצינורות 5 מיליליטר מכילים 1X PBS וקטטר לתוך 1.5 מיליליטר Eppendorf (ראה שלב 12.1).
    הערה: השתמש במספריים שונים לנתיחה החיצונית ולקצירת איברים ואחזור קטטר כדי למזער זיהום
  3. לאחר מכן בצע צעד 4.6.

שחזור קטריאלי 13.

  1. לאיברים, בצע את השלבים 5.1 ו -5.2. להתאוששות חיידקים מצנתרים, מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות, sonicate דגימות קטטר למשך 5 דקות באמצעות sonicator אמבטיה, ולאחר מכן מערבולת במהירות המרבית ל30 שניות נוספות.
  2. הפוך דילולים 1:10 סדרתי החוצה עד 10 -8 וצלחת כל דילול לספירת CFU על צלחות BHI. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור מושבות למחרת.

תוצאות

המודלים השלפוחית ​​של UTI קשור מסובך וקטטר לספק פלטפורמות גמישות להבהרת המנגנונים המולקולריים של פתוגנזה של חיידקים, ההשפעה של מחלות אלה ברקמת מארח, והפיתוח ובדיקות של גישות חדשות לניהול הזיהומים הנפוצים ויקרים הללו. בהתאם לזן העכבר והפתוגן, חיסון שלפוחית ​​יכול ל...

Discussion

הקהילה מסובכת רכשה UTI הוא זיהום שכיח ויקר והיוו כמה מיליוני ביקורי טיפול ראשוני בכל שנה 46. בנוסף, Cautis הוא זיהום שנרכש בריאות משותפת שהפך יקר מאוד לספקי שירותי בריאות כמרכזים רפואיים Medicaid Services כבר לא משיב לספקי העלות הנוספת של טיפול וכתוצאה מבית החולים רכשו CAUTI

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מימון עבור עבודה זו סופק על ידי DK064540 P50 ORWH SCOR, RO1 DK 051,406, RO1 AI 108,749-01, F32 DK 101,171, וF32 DK 104,516-01.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needlesBD Precision Glide30510630 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubingBD427400Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubingBraintree Scientific, IncSIL 025inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – IsothesiaButler Schein29405250 ml
Clear Glass Straight-Sided JarKimble Chase5413289V 21
Stainless Steel Tea InfuserSchefs-AmazonPremium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton ballsFisherbrand22-456-880
50 ml Falcon tubesVWR89039-660
Isotec 3 -vaporizerOhmeda1224478
Ear punchFisher Scientific13-812-201(when necessary)
Betadine solutionBetadine solution10% Povidie-iodine topical solution
Q-tipsFisher Scientific22-037-9246 inches
Diapers for benchFisherbrand14206 63Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricantSurgilube0281-0205-36
Dissecting scissorFine Science tools, INC14084-08
Micro-Adson ForcepsFine Science tools, INC11018-12
1 ml syringeBD309659Tuberculin slip tip
ParafilmBemisPM9964 inches x 125 FT
Eppendorf rackFisherbrand05-541-1
Eppendorf tubesMIDSCIAVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
HomogenizerPRO Scientific INCBio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tubeBD352063for organ homogenization
Paper towelGeorgia-Pacific
EthanolPharmco-AAPER11100020S200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well PlatesCorning3788
1x Phosphate sodium salineSigma-AldrichP3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210Branson Ultrasonics Corporation1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plateTechno Plastic Products92006
PinsFine Science Tools26002-20
Sylgard 184Dow Corning3097358-1004Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)Invitrogen15520-034Ultrapure
N, N-DimethylformamideSigma AldrichD4551
MgCl2 (Magnesium chloride)Sigma AldrichM8266
Sodium deoxycholateSigma AldrichD6750
Nonidet-P40Roche11754599001Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)Sigma AldrichP3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)Sigma Aldrich60299

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli.. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli.. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John, ., L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -. S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 8/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100Coli EscherichiaUPECFaecalisUropathogenicIBC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved