Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Riepilogo

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono altamente prevalenti, una causa importante di morbilità e sono sempre più resistenti al trattamento con antibiotici. Le femmine sono sproporzionatamente afflitti da UTI: il 50% di tutte le donne avranno un UTI nella vita. Inoltre, il 20-40% di queste donne che hanno un primo UTI subirà una ricorrenza con qualche sofferenza recidive frequenti con un grave deterioramento della qualità della vita, il dolore e il disagio, interruzione delle attività quotidiane, l'aumento dei costi sanitari, e poche opzioni di trattamento diverso di profilassi antibiotica a lungo termine. Uropatogeni Escherichia coli (UPEC) è l'agente eziologico principale di acquisita in comunità UTI. Catetere-associata UTI (CAUTI) è la più comune infezione acquisita in ospedale pari a un milione di eventi negli Stati Uniti ogni anno e costi sanitari drammatici. Mentre UPEC è anche la causa primaria di CAUTI, altri agenti causali sono di maggiore importanza tra cui Enterococcusfaecalis. Qui utilizziamo due modelli murini consolidate che ricapitolano molte delle caratteristiche cliniche di queste malattie umane. Per UTI, un modello C3H / nubilato ricapitola molte delle caratteristiche di virulenza UPEC osservati negli esseri umani, tra cui le risposte di accoglienza, formazione e IBC filamentazione. Per CAUTI, un modello con topi C57BL / 6, che mantengono gli impianti vescica catetere, ha dimostrato di essere sensibili a E. faecalis infezione della vescica. Questi modelli rappresentativi vengono utilizzati per ottenere sorprendenti nuove informazioni sulla patogenesi della malattia UTI, che sta portando allo sviluppo di nuove terapie e strategie di gestione e di prevenzione.

Introduzione

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono una delle più comuni infezioni batteriche e possono essere suddivisi in due categorie a seconda del meccanismo di acquisizione, comunità e nosocomiali acquisita UTI. IVU si verificano spesso nelle donne e negli studi altrimenti sane acquisita in comunità hanno dimostrato che circa il 50% delle donne avranno almeno un UTI nella vita ^1. Inoltre, la recidiva è un grave problema. Una donna che ha una infezione acuta iniziale ha una probabilità del 25-40% di avere una seconda infezione entro sei mesi, nonostante adeguato trattamento antibiotico e molte donne continuano ad avere recidive frequenti ^2. I batteri che causano queste infezioni stanno diventando resistenti ulteriori protocolli terapeutici sempre più confondenti antibiotico ^3-6. UTI colpiscono milioni di persone ogni anno costano circa 2,5 miliardi di dollari di spese relative di assistenza sanitaria negli Stati Uniti, sottolineando l'impatto e prevalenza della malattia1,7 .Nosocomial acquisito IVU sono associati principalmente con la presenza di corpi estranei, quali cateteri. Catetere-associate infezioni del tratto urinario (CAUTI) rimangono il nosocomiale più comune acquisito UTI, pari al ~ 70-80% di tali infezioni ^8. Inoltre, CAUTI è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità ed è la causa più comune delle infezioni del sangue secondarie ^9.

UPEC comunità associata acquisita IVU sono pensato per essere causato dall'introduzione di batteri nella vescica da giacimenti nel tratto gastrointestinale attraverso la manipolazione meccanica durante il rapporto sessuale, scarsa igiene o di altri dinamica delle popolazioni microbiche tra host differenti nicchie ^10. Una volta dentro la vescica, UPEC impiegano numerosi fattori di virulenza, tra cui capsule, sistemi di acquisizione di ferro, le tossine, un plasmide di virulenza, tRNA, isole di patogenicità e fattori di colonizzazione che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi ^{11-14. Fondamentale per la creazione di colonizzazione UPEC, UPEC codificare anche più tipi di chaperone adesivo usciere pathway (CUP) pili che riconoscono i recettori con specificità stereochimica 15. Tipo 1 pili, rovesciato con l'adesina FimH, sono espressi da UPEC e BIND uroplakins 16 e α-1, β-3 integrine 17, che si esprimono sulla superficie luminale di entrambe le vesciche umane e di topo 18 mannosylated. Queste interazioni FimH mediata facilitano la colonizzazione batterica e l'invasione delle cellule epiteliali superficiali 19,20. Una volta all'interno della cellula, UPEC può sfuggire nel citoplasma dove un singolo batterio può rapidamente dividere per formare una comunità batterica intracellulare (IBC), che A maturazione, può contenere circa 10 4 21 batteri. Formazione IBC è stata dimostrata in almeno sei diversi ceppi di topi, C3H / nubilato, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / NJ e BALB / c, e con una grande varietà di differenti UPECeppi C e altri enterobatteri 22-24. Tuttavia le differenze temporali e spaziali della formazione IBC può variare a seconda del fondo mouse e il ceppo infettante UPEC. In topi C3H / HeN infettati con il prototipo UPEC ceppi UTI89 o formazione CFT073, IBC possono essere visualizzati come piccoli biomasse di batteri già il 3 HPI (infezione post hr). Questa comunità continua ad espandersi e raggiunge un "punto medio" di sviluppo circa 6 hpi quando i batteri astiformi occupano una grande percentuale di spazio citoplasmatica di cellule superficiali ombrello terminalmente differenziate Questi prima forma GIR in maniera relativamente sincrono con la maggioranza visualizzazione dimensioni simili e morfologie. ~ 8 hpi i batteri nel cambiamento IBC da un bacilli a Cocci morfologia. IBC sono di natura transitoria. Così, IBC maturazione 12-18 risultati HPI in continua espansione della popolazione batterica, seguito dal loro filamentazione e dispersione dal wi cellulareth successiva diffusione di cellule vicine 23. Così, la nicchia IBC consente per la crescita batterica rapida in un ambiente protetto dalle risposta immunitaria e antibiotici 25. Le fasi distinte di infezione UPEC che si vedono nei topi si osservano anche negli esseri umani, come i GIR ei filamentazione, sostenendo il modello murino di UTI come uno strumento utile che può essere utilizzato per modellare UTI nell'uomo 22,26-28.}

Mentre la maggioranza delle donne sperimenta un UTI nella vita, l'esito di queste infezioni può variare da infezione autolimitante acuta senza recidiva, a frequentare cistiti ricorrenti. Inoltre, gli studi hanno dimostrato una forte presenza familiare di UTI, il che suggerisce una componente genetica contribuisce alla UTI suscettibilità ^29. Abbiamo scoperto che i diversi risultati UTI visto in cliniche possano essere riprese dai risultati diversi di infezione sperimentale UPEC tra ceppi di topi inbred ^30. Ad esempio, C3H / nubilato, CBA, Topi DBA e C3H / HeOuJ sono suscettibili, in maniera dose-dipendente infettiva, a lunga durata, cistite cronica caratterizzata da persistente, batteri alto titolo (> 10 ⁴ unità formanti colonie (CFU) / ml), alto titolo batteriche oneri vescica al sacrificio> 4 settimane dopo l'infezione (WPI), infiammazione cronica, e necrosi uroteliale. Questi topi mostrano anche elevati livelli sierici di IL-6, G-CSF, KC, e IL-5 entro il primo 24 HPI che servono come biomarcatori per lo sviluppo di cistite cronica. Questo può rappresentare accuratamente il corso naturale della UTI in alcune donne, come gli studi placebo hanno dimostrato che una grande percentuale di donne che subiscono UTI manterrà livelli elevati di batteri nelle urine per diverse settimane dopo i primi sintomi della cistite se non somministrato il trattamento antibiotico ^{31 , 32.} Inoltre, utilizzando topi C3H / nubilato, abbiamo scoperto che una storia di cistite cronica è un fattore di rischio significativo per le successive gravi infezioni ricorrenti. Ricorrente UTI è la più significant manifestazione clinica della UTI e il topo C3H / nubilato è attualmente il modello studiato solo che riassume una maggiore predisposizione dopo l'esposizione precedente. Un altro risultato UTI è ricapitolato in C57Bl / 6 topi in cui l'infezione acuta UPEC è autolimitante, con una risoluzione di infiammazione della vescica e batteriuria entro circa una settimana. È interessante notare che, in questo modello, UPEC facilmente formare riserve intracellulari di riposo all'interno del tessuto della vescica da cui UPEC sono capaci di emergere da uno stato inattivo a ricominciare una UTI attivo, potenzialmente spiegare uno dei meccanismi per lo stesso ceppo UTI ricorrente negli esseri umani ^{33, 34.}

Oltre alle influenze genetiche sulla UTI suscettibilità, introduzione di un catetere in vescica aumenta notevolmente la probabilità di avere un'infezione nonché aumentare la gamma di batteri in grado di causare un'infezione. È stato dimostrato che la cateterizzazione urinaria umana provoca istologico ecambiamenti immunologici nella vescica a causa di stress meccanico che si traduce in una risposta infiammatoria robusto, esfoliazione, edema della lamina propria e submucusa, assottigliamento uroteliale, e mucosa lesioni dell'urotelio e rene ^35,36. Inoltre, il catetere fornisce una superficie di attacco batterico creando così un ambiente utilizzato da diverse specie di causare CAUTI. Mentre UPEC sono ancora una delle principali cause, Enterococcus faecalis rappresenta il 15% di questi CAUTI ^37. E. faecalis sta diventando sempre più resistenti agli antibiotici con vancomicina resistenza emersione, che presentano un grave problema per la salute ^38. E. faecalis possiedono numerosi fattori di virulenza tra cui tossine e adesine necessari per il fissaggio sia per il catetere e epitelio ^38. Durante cateterizzazione urinaria, l'host è vulnerabile a microbica adesione, moltiplicazione e diffusione del ^39,40 tratto urinario. E. faecalis forma un biofilm sul catetere come parte di un meccanismo a persistere nella vescica e diffondere ai reni, che viene riprodotto in un modello di topo CAUTI ^41. Recentemente, è stato dimostrato durante cateterizzazione urinaria, fibrinogeno (Fg) viene rilasciato nella vescica come parte della risposta infiammatoria. Fg accumula nella vescica, ricopre il catetere ed è essenziale per E. faecalis formazione di biofilm, funzionando come un ponteggio allegato. In un modello C57BL / 6 del mouse di CAUTI, abbiamo scoperto che E. formazione di biofilm faecalis sul catetere, e quindi la persistenza nella vescica, era dipendente dalla pilus Ebp, in particolare la sua EBPA punta adesina. Abbiamo trovato che il dominio N-terminale di EBPA lega specificamente a FG rivestimento del catetere. Inoltre, si è riscontrato che E. faecalis utilizza Fg come fonte metabolita durante l'infezione, rafforzando in tal modo la formazione di biofilm ^42.

Modelli murini hanno dimostrato fondamentale per underdagiato nonché prevedere manifestazioni cliniche di UTI e CAUTI ^41. In questo articolo abbiamo dimostrato la preparazione inoculo della cistite UPEC isolare UTI89 e inoculazione transuretrale di topi C3H / celibato. Inoltre, dimostriamo un protocollo per l'inserimento del catetere in topi C57BL / 6 e inoculazione del E. ceppo faecalis OG1RF. Entrambe queste tecniche portano a UTI coerente e affidabile o CAUTI nei topi. Mostriamo anche le tecniche utilizzate per osservare la formazione di IBC durante cistite acuta e raccolta delle urine per l'analisi di cistite cronica o ricorrente. Topi C3H / nubilato sono stati utilizzati per studiare gli aspetti della UPEC patogenesi tra cui l'invasione iniziale batterica, la formazione di IBC, filamentazione e lo sviluppo di cistite cronica ^23,33,43. Questi parametri di virulenza sono stati studiati anche in una varietà di altri ambiti del mouse ^22,33. Per CAUTI, il / 6 modello C57BL permette per l'impianto di corpi estranei nella vescica con conseguente co battericalonization, che può essere mantenuta per 7 giorni dopo l'infezione ^41. Questi modelli sono stati utili per valutare i meccanismi di virulenza batterica, le risposte di accoglienza per UTI e meccanismi per sovvertire risposta dell'ospite, gran parte del quale è stato successivamente ricapitolato o osservati nella popolazione umana clinici.

Protocollo

Affermazione Etica: Il Comitato Washington University Animal Studies approvato tutte le infezioni del mouse e procedure nell'ambito del numero di protocollo 20120216, che è stato approvato 2013/01/11 e 2016/01/11 scade. Cura generale degli animali era in linea con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio da parte del Consiglio Nazionale delle Ricerche e la cura Resource Guide USDA animale. Eutanasia procedure sono in linea con le "linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali edizione 2013".

1. UPEC UTI protocollo, inoculazione Ago Preparazione (Figura S1)

1. Togliere il tappo del G 30 ago. Infilare circa 1 pollice di tubo PE10 sull'albero dell'ago. UV sterilizzare i gruppi di aghi durante la notte. Aghi cateterizzati possono essere conservati a tempo indeterminato in piastre Petri sterili.

2. UPEC batterica Inoculum Preparazione

1. Preparare UTI89 inoculo (inizio 72 ore prima della inoculizione giorno)
   1. Streak UTI89 su un LB (Luria-Bertani) piastra di agar da uno stock congelato. Incubare per una notte a 37 ° C. Scegliere una colonia e inoculare in 10 ml di LB in un pallone da 125 ml. Incubare a 37 ° C per 24 ore, in modo statico.
   2. Seminare 10 ml di coltura durante la notte in 10 ml di LB in un pallone nuovo 125 ml per altre 24 ore a 37 ° C, in modo statico.
   3. Trasferimento 3 ml (variano in base alla tensione e alle dimensioni inoculo desiderato) per sterili provette da 1,5 ml e centrifugare a 7.000 xg per 3 min e risospendere il pellet in 1x PBS e centrifugare una seconda volta. Risospendere il pellet batterico in 1 ml di PBS 1x.
2. Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla densità inoculo desiderato. La concentrazione standard dell'inoculo utilizzato è 10 ⁷ batteri; Tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio.

3. batterica Inoculazione

1. Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e csu area con carta assorbente (o usare cappa a flusso sterile).
2. Disegna fino a 0,9 ml di inoculo batterico preparato in un 1 ml (TB) siringa (rimuovere le bolle d'aria). Collegare un ago sterile inoculazione preparata con tubi PE10, sulla siringa contenente l'inoculo, quindi sterilmente tagliare il tubo in polietilene.
   NOTA: Lasciare 1 mm tubo sopra la punta dell'ago per evitare la puntura della vescica.
3. Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore.
4. Anestetizzare femminile topi C3H / nubilato mettendoli in un vaso di vetro 32 once contenente una sfera di tè-infusore con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec) .
   NOTA: Alcuni comitati IACUC non approvano l'uso di un vaso o vaporizzatore. Si prega di seguire le indicazioni del comitato IACUC della vostra istituzione.
   NOTA: Se vaso di vetrocon tè-ball e / o di cono con batuffoli di cotone vengono utilizzate isoflurano-soakd, l'animale deve essere osservato con attenzione per evitare overdose di anestetico e la morte. Il vantaggio di utilizzare una camera di vaporizzatore e anestesia è che fornisce somministrazione isoflurano controllato che evita overdose accidentale. ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l'inalazione.
5. Rimuovere il mouse dal vaso / vaporizzatore e posizionarlo sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe.
6. Coprire il naso del mouse con un cono (un tubo collegato al vaporizzatore che fornisce una dose controllata isoflurance che è dotato su alcune unità vaporizzatore) o 50 ml tubo conico con un batuffolo di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml ) di isoflurano.
7. Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire la zona periuretrale con il 100% di etanolo pulire. Tamponare l'inoculazione ago / siringa, primo punto, nelLubrificante chirurgico.
8. Inoculare ciascuna mouse con 50 microlitri della soluzione batteri inserendo l'ago inoculazione transurethrally, di circa 12 mm, e premendo sullo stantuffo della siringa delicatamente per dispensare l'inoculo in vescica delicatamente (10 ml / sec). Rimuovere l'ago inoculazione dal mouse.
   NOTA: il ritorno immediato di inoculo in apertura uretrale quando si inizia per inoculare indica l'inserimento improprio o incompleta dell'ago.
9. Rimuovere il mouse dal cono e tornare alla sua gabbia. Ripetere i passaggi 3,3-3,8 per ogni mouse. Quando / se il passaggio di inoculo condizioni / ceppi, gettare la siringa e l'ago inoculazione in un apposito contenitore approvato e ricominciare punto 3.2.
   NOTA: inoculazione di organismi uropatogeni generalmente non causa gravi sintomi di dolore. Tuttavia, in rari casi, la somministrazione di forti dosi di agenti patogeni può causare febbre, riduzione di cibo e acqua e l'assunzione di un comportamento anomalo. LaNimal salute deve essere monitorato durante tutto l'esperimento. Se i sintomi di dolore sono evidenti preavviso, un analgesico, come la buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea), può essere applicato. Le procedure dovrebbero essere in accordo con IACUC di ciascuna istituzione.

4. Determinazione degli oneri batteriche

1. Preparare separati 5 ml provette per ogni coppia vescica e reni per essere raccolto. Aggiungere 1 ml di PBS 1x / tubo / mouse vescica per essere raccolte. Aggiungere 0,8 ml di PBS 1x / tubo / coppia di reni del mouse per essere raccolto. Etichettare ogni provetta corrispondere ad un determinato mouse. Preparare una piastra a 96 pozzetti contenenti 180 ml di PBS 1x in ogni pozzetto per 01:10 diluizioni seriali.
2. Pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l'area con una copertura o tovagliolo di carta assorbente.
3. Anestetizzare il mouse con isoflurano (vedi punto 3.4) fino a quando il mouse smette di respirare per circa 1 minuto, poi posizionarlo sul coperchio o tovagliolo di carta assorbente. Altri metodi di euthanaSia sono accettati anche da comitati IACUC, come l'anidride carbonica, e può essere sostituito in caso di sovradosaggio isoflurano.
4. Sacrificare il mouse rapida dislocazione cervicale che consiste di immobilizzare la collo alla base della testa e tirando la coda distanza orizzontale dal corpo finché non si verifica dislocazione.
   NOTA: La maggior parte dei comitati IACUC richiedono un mezzo secondario di eutanasia e dislocazione cervicale è un metodo comune. Tuttavia, altri metodi possono essere utilizzati, se approvato dal comitato IACUC.
5. Posizionare il mouse guasto sul dorso e spruzzare 70% di etanolo sull'addome. Sezionare il mouse, raccogliere la vescica e reni, in questo ordine per minimizzare la contaminazione potenziale dal sangue dopo la dissezione rene. Posizionare gli organi in modo indipendente nei preparati da 5 ml provette contenenti 1x PBS (vedi punto 4.1).
   NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per il prelievo di organi per ridurre al minimo la contaminazione.
6. Toccare il tubo per assicurare gli organi sono in tegli 1x PBS. Ripetere il passaggio 4,3-4,5 per ogni mouse. Forbici pulite e pinze in etanolo al 70% dopo ogni mouse.

5. batterica Recovery

1. Omogeneizzare vescica raccolti e reni nelle provette da 5 ml con un omogeneizzatore tessuto, 15 sec per rene e 30 sec per la vescica. Sciacquare omogeneizzatore sequenzialmente in 1x PBS, il 70% di etanolo e 1x PBS tra i campioni.
2. Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 ^-8 e piastra ogni diluizione per UFC (unità formanti colonie) su piastre di agar LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo.

6. IBC Enumeration

1. Asetticamente rimuovere la vescica e posizionarlo in 1x PBS in una piastra da 6 pozzetti con fondo silicone. Le piastre possono essere preparati utilizzando un kit di elastomero di silicone e versando circa 1 cm di silicone in ogni pozzetto, vedere produce istruzioni. Tagliare la vescica a metà con le forbici.
2. Utilizzando piccoli perni metallici splay delicatamente la fogliader modo che il lume della vescica è rivolto verso l'alto. Assicurarsi di posizionare i perni sui bordi più esterni delle sezioni vescica per garantire la quantità massima di dell'urotelio è esposto.
3. Dopo strombatura, lavare delicatamente la vescica una volta con PBS 1x. Rimuovere la PBS 1x per pipetta. Fissare la vescica aggiungendo abbastanza 3% paraformaldeide per coprire l'intera vescica strombato. ATTENZIONE: Paraformaldeide è cancerogeno. Attrezzatura protettiva adatta, compresi i guanti, deve essere indossato in ogni momento. I rifiuti devono seguire le linee guida istituzionali.
4. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere la soluzione paraformaldeide. Lavare una volta con PBS 1x.
5. Lavare con soluzione di lavaggio LacZ (2 mM MgCl _2, 0,01% sodio desossicolato e 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) tre volte per 5 minuti a lavaggio.
6. Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere abbastanza macchia LacZ (9,5 ml di soluzione di lavaggio LacZ, 0,4 ml di 25 mg / ml di X-gal e 0,1 ml di 100 mM K-ferrocianuro / K-ferricianuro) per coprire le vesciche. Incubare a 30 ° C overniGHT al riparo dalla luce.
7. Rimuovere vesciche strombate da incubatore e osservare IBC, che appaiono come blu puncta come visualizzato con un ambito dissezione, 40-60X ingrandimento.
   NOTA: A volte un mouse può urinare prima del posizionamento del tubo sotto l'uretra. In questo caso, attendere 15-20 minuti prima di tentare di raccogliere di nuovo le urine.

7. raccolta di urine per batteriuria CFU Enumeration (non applicabile per CAUTI)

1. Per la raccolta delle urine pre o post infezione frenare dolcemente il mouse tenendo la coda e collocata su una superficie elevata piatta (parte superiore della gabbia del mouse).
2. Tenere una provetta sterile da 1,5 ml sotto l'uretra mouse. Premere delicatamente verso il basso sul retro del mouse vicino alla coda per esercitare una pressione alla vescica. Cattura l'urina nella provetta da 1,5 ml.
3. Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 ^-7 e piastra ogni diluizione adeguati LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo.

8. CAUTI modello di protocollo, catetere Ago Preparazione per CAUTI Model (figura S2)

1. Togliere il tappo del G 30 ago. Tagliare un pezzo 7 millimetri di tubo PE10 e 5 mm pezzo di tubo in silicone come RenaSIL. Infilare l'ago con tubi PE10 finché il tubo tocca la base dell'ago.
2. Poi alimentare il pezzo 5 millimetri sul ago-PE10 contenenti. UV sterilizzare i aghi assemblee durante la notte.
   NOTA: Quando si carica il tubo di silicone, lasciare circa 1 millimetro del tubo che si estende oltre la punta dell'ago.

9. E. faecalis OG1RF batterica Inoculum Preparazione

1. Preparare OG1RF inoculo di partenza 48 ore prima del giorno inoculazione. Streak OG1RF su un BHI (Brain Heart Infusion) piatto da uno stock congelato.
2. Scegli una colonia e inoculare in 10 ml di BHI e coltivarla staticamente per 18 ore a 37 ° C. Centrifugare la cultura e lavare il pellet (3 volte) in 1 ml di volume di PBS sterile 1x.
3. Risospendere il pellet batterico in 1x PBS. Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla dimensione inoculo desiderato. La concentrazione standard dell'inoculo utilizzato è 10 ^7; tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio

10. Catetere impianto

1. Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l'area con una copertura assorbente (o usare cappa a flusso sterile).
2. Fissare il catetere-ago a un vuoto 1 ml (TB) siringa. Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore.
   NOTA: Due aghi differenti sono utilizzati per la deposizione del catetere e per l'inoculo di minimizzato inoculazione accidentale dovuto alla manipolazione meccanica necessaria per l'impianto del catetere. Questo permette anche per la comodità di preparare un minor numero di aghi di inoculazione.
3. Anestetizzare C57BL / 6 topi mettendoli in un vaso di vetro contenente 32 once un tèpalla -infuser con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec).
4. Poi mettere il mouse sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe. Coprire il naso del mouse con un cono di naso o tubo da 50 ml con batuffoli di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml) di isoflurano.
   ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l'inalazione dal ricercatore.
5. Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire zona periuretrale con etanolo al 100% pulire.
6. Disinfettare la zona periuretrale con soluzione di iodio-povidone al 10% con un applicatore di cotone-punta. Tamponare l'inoculazione ago / siringa, primo punto, nel lubrificante chirurgico.
   NOTA: povidone-iodio viene utilizzato per l'impianto del catetere, che è una soluzione asettica forte di alcol. Catetere impianto richiedepiù manipolazione meccanica per inserire il catetere e quindi un maggiore potenziale di contaminazione.
7. Inserire il catetere nell'apertura uretrale. Una volta in, utilizzare pinzette per spingere la (7 millimetri PE10) lungo pezzo verso la vescica, quindi spingendo la (5 mm silicone) piccolo catetere e depositarlo nella vescica. Rimuovere l'ago, con il tubo 7 millimetri ancora attaccato, immediatamente.

11. batterica Inoculazione

1. Seguire il protocollo di inoculazione batterica nella sezione 3, utilizzando l'inoculo preparato dalla sezione 9. Rimuovere il mouse dal cono naso e tornare alla sua gabbia

12. A ciascun intervallo di Sacrifice

1. Preparare provette da 5 ml per la vescica e del rene (per organi seguire passo 4.1) e 1,5 ml provetta Eppendorf per cateteri. Aggiungere 1 ml di PBS 1x in 1,5 ml provetta Eppendorf per i campioni catetere
2. Seguire i passaggi 4,3-4,5. Sezionare il mouse, la raccolta della vescica, reni e del catetere, placing i tessuti in modo indipendente in 5 provette ml contenenti 1x PBS e il catetere nel 1,5 ml Eppendorf (vedi punto 12.1).
   NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per la raccolta di organi e il recupero del catetere per minimizzare la contaminazione
3. Poi seguire passo 4.6.

13. batterica Recovery

1. Per gli organi, seguire i passi 5.1 e 5.2. Per il recupero batterica da cateteri, vortex alla velocità massima per 30 sec, sonicare campioni catetere per 5 minuti utilizzando un bagno sonicatore, e poi vortex alla velocità massima per altri 30 sec.
2. Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 ^-8 e piastra ogni diluizione per CFU enumerazione su piastre BHI. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo.

Risultati

I modelli intravescicali di semplice e catetere IVU associate forniscono piattaforme flessibili per chiarire i meccanismi molecolari della patogenesi batterica, l'impatto di queste malattie sulla tessuto ospite, e lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci per gestire queste infezioni comuni e costosi. A seconda del ceppo di topi e patogeno, inoculazione intravesical può essere usato per studiare le interazioni ospite-patogeno per chiarire fattori necessari per avviare o modulante acuta (Figura 1

Discussione

Comunità Semplice acquisito UTI è un'infezione comune e costosa contabilità per diversi milioni di visite di assistenza primaria ogni anno ^46. Inoltre, Cautis sono un sanitario comune infezione acquisita che è diventato estremamente oneroso per gli operatori sanitari, come i Centri di Medicare e Medicaid Services non rimborsa i fornitori per il costo aggiunto di trattamento risultante dall'ospedale acquisito CAUTI ^45. I modelli murini di UTI, sia cistite non complicata e CAUTI, descritt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles	BD Precision Glide	305106	30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 inches
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 inches x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1x Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299