Preparación de altamente poroso Coordinación Polymer Coatings en macroporosas Polymer Monolitos de Enriquecimiento mejorada de Phosphopeptides

Resumen

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

Resumen

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.

The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

Introducción

Polímeros de coordinación poroso (PCP) son compuestos de coordinación basado en centros metálicos unidos por ligandos orgánicos con la repetición de las entidades de coordinación que se extienden en 1, 2 o 3 dimensiones que pueden ser amorfo o cristalino ^1-3. En los últimos años, esta clase de materiales porosos ha atraído una gran atención debido a su alta porosidad, tunability química de ancho, y su estabilidad. PCP se han explorado para una gama de aplicaciones, incluyendo el almacenamiento de gas, separación de gas, y la catálisis ^3-6, y muy recientemente, las primeras aplicaciones analíticas de los PCP se han descrito ^7.

Debido a su mayor funcionalidad química y alta porosidad PCP han sido blanco por su enorme potencial para la mejora de los procesos de purificación y separaciones cromatográficas, y una serie de informes sobre este tema se han publicado ^7-13. Sin embargo, el rendimiento de los PCP no se encuentra actualmente en un Equivalenivel nt con materiales cromatográficos existentes probablemente debido a la rápida difusión a través de grandes huecos entre partículas en lechos de relleno de estos sólidos debido a sus morfologías normalmente de forma irregular de sus partículas o cristales. Este embalaje distribuida irregularmente conduce a un rendimiento menor de lo esperado, así como contrapresiones alta columna e indeseables morfologías forma de pico ^14,15.

Con el fin de resolver el problema de la rápida difusión a través de los huecos entre las partículas y concomitantemente mejorar el rendimiento de los PCP para aplicaciones analíticas, el desarrollo de un material híbrido basado en un monolito de polímero macroporoso ¹⁶ que contiene el PCP en la superficie de los macroporos haría ser deseable. Monolitos de polímeros son materiales de una sola pieza que puedan sostener el flujo convectivo a través de sus poros, lo que los convierte en una de las alternativas más eficientes para cordón de envases y se han comercializado con éxito por varios c autónomo as empresas ^17,18. Monolitos polímero poroso se basan generalmente en la polimerización de un monómero y un reticulante en presencia de porógenos, que son típicamente mezclas binarias de solventes orgánicos. Los materiales monolíticos obtenidos tienen una estructura microglobular y una alta porosidad y el flujo de permeabilidad.

Un enfoque simple para unificar estos materiales para preparar un monolito de polímero que contiene un PCP se basa en la adición directa de los PCP tal como se sintetizan en la mezcla de polimerización del monolito. Este enfoque dio lugar a los PCP enterrado en su mayoría dentro de un esqueleto de polímero, y no ser activo para la aplicación ulterior del material final ^14,15. Un enfoque sintético diferente es claramente necesario con el fin de, por ejemplo, desarrollar películas uniformes de PCP, o marcos de metal-orgánicos cristalinos (MOF) donde la mayoría de los poros contenidos en el cristal son accesibles desde los macroporos del monolito de polímero.

t "> Aquí nos presenta un protocolo simple para la preparación de un material híbrido de metal-polímero orgánico (MSP), basado en un soporte de polímero macroporoso con grupos funcionales adecuados para la unión de PCP, que pueden ser implementados fácilmente como un auto-contenida sola monolito de polímero -piece en un formato de columna con propiedades óptimas para aplicaciones de flujo continuo. El procedimiento de síntesis de polímeros es seguido por una solución basada en la temperatura ambiente sencillo   método para hacer crecer un recubrimiento de PCP en la superficie interna de los poros de la monolito ^19-20. Como el primer ejemplo, se describe la preparación de un hierro (III) benzenetricarboxylate (FeBTC) película de polímero de coordinación dentro de un poli macroporoso (ácido estireno-divinilbenceno-metacrílico) monolito. Este método es eficaz para la preparación de polvos a granel, así como columnas capilares y el protocolo descrito es fácilmente implementable a otros PCP. Como un ejemplo del potencial de MOPHs como materiales funcionales para el flujo-throuaplicaciones gh, que aplican los países desarrollados FeBTC Ministerio de Salud Pública, que contiene una capa densa de Fe (III) centros para enriquecer fosfopéptidos de mezclas de proteínas digeridas explotan la afinidad de unión de fosfopéptidos a Fe (III). El protocolo desarrollado ²¹ se compone de tres partes principales: Preparación del soporte monolito de polímero orgánico macroporoso; el crecimiento del revestimiento PCP en la superficie de los poros de la monolito; aplicación para el enriquecimiento de fosfopéptidos.

Protocolo

NOTA: Antes de comenzar, compruebe todas las hojas de datos de materiales pertinentes (MSDS). Varios de los productos químicos utilizados en los procedimientos de síntesis y de aplicación son tóxicos. Siga todas las prácticas de seguridad apropiadas y utilizar el equipo adecuado de protección (bata, pantalones largos, zapatos cerrados, gafas de seguridad, guantes). Utilice todo el equipo de protección personal al manipular criogénica de nitrógeno líquido para las medidas de adsorción de nitrógeno (guantes aislantes, careta).

1. poroso polímero Preparación Monolito a Granel y Formato de columna capilar

1. Bulk Polymer Monolith para la caracterización
   1. Purificar estireno, divinilbenceno y ácido metacrílico a través de una columna de alúmina básica, con el fin de eliminar los inhibidores de la polimerización. Colocar 10 g de alúmina básica en un ml jeringa de plástico desechable 25 con una torunda de lana de vidrio de envasado en la punta de la jeringa. Hacer pasar aproximadamente 10 ml de monómero a través de la columna.
   2. Cargar los monómeros (50 mg estireno, divinilbenceno 100 mg y 50 mg de ácido metacrílico) y los agentes formadores de poros (300 mg de tolueno y 300 mg isooctano) en un vial de vidrio de 1 ml. Añadir el iniciador de la polimerización, 4 mg de 2,2'-azobisisobutironitrilo (AIBN, 1% con respecto a los monómeros).
   3. Homogeneizar por sonicación durante 10 min. Eliminar el oxígeno disuelto por burbujeo de nitrógeno a través del líquido durante 10 min. Sellar la tapa del frasco con la película de parafina y colocarlo en un baño de agua a 60 ° C durante 6 horas para polimerizar la mezcla.
   4. Enfriar a temperatura ambiente y romper el frasco con cuidado. Transferir el monolito de polímero en un dedal de extracción de celulosa. Colocar el cartucho de extracción en una cámara de extracción Soxhlet y ensamblar a un matraz de fondo redondo que contiene un volumen de metanol, que es al menos tres veces el volumen de la cámara de extracción. Montar un condensador a la parte superior de la cámara de extracción. Realizar la extracción Soxhlet por ebullición del metanoldurante 16 h, asegurando la eliminación completa de los monómeros sin reaccionar y agentes formadores de poros.
   5. Secar durante la noche en un horno de vacío a 60 ° C. Confirmar la presencia de grupos funcionales carboxílicos para unir el PCP por Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Medir el área de superficie por porosimetría de adsorción de nitrógeno.
2. La funcionalización de sílice Capilares para la Preparación de columnas monolíticas
   1. Cortar 2 m de 100 micras Identificación del capilar de sílice fundida de poliamida recubierto. Conéctelo a una jeringa de vidrio desde 0,25 hasta 0,50 ml y lavar el capilar con acetona. Eliminar la acetona por aclarado el capilar con agua.
   2. Con el fin de activar el recubrimiento de sílice interna del capilar, utilizar una bomba de jeringa a fluir una solución 0,2 M acuosa de NaOH a 0,25 l / min durante 30 min. Enjuague con agua hasta que el efluente es neutral.
   3. Utilice tiras de papel de pH para comprobar el pH del efluente. Con el fin de protonar los grupos silanol del capilar, bombear un aqueo 0,2 Msolución de HCl nosotros a través del capilar a 0,25 l / min durante 30 min. Enjuague con agua hasta que el efluente es neutral. Enjuague con etanol.
   4. Bombear un 20% (w / w) solución de etanol de 3- (trimetoxisilil) propil metacrilato (pH 5 ajustado con ácido acético) en 0,25 l / min durante 1 hora. En este paso, el capilar de sílice está funcionalizado con grupos vinilo con el fin de fijar el monolito de polímero a la superficie interior capilar.
   5. Enjuague con acetona y seco, en una corriente de nitrógeno y dejar a temperatura ambiente durante la noche antes de su uso. Cortar el capilar en pedazos más cortos de longitud 20 cm.
3. Preparación de columnas monolíticas capilares
   1. Preparar una mezcla de polimerización idénticas como para el monolito de polímero a granel (sección 1.1) en un vial de vidrio de 1 ml con un septo de caucho. Añadir iniciador AIBN 1% con respecto a los monómeros. Homogeneizar por sonicación durante 10 min.
   2. Purgar la mezcla de polimerización con nitrógeno mediante el acoplamiento de un capilar de sílice no funcionalizadoa una corriente de nitrógeno.
      1. Insertar el capilar corriente de nitrógeno a través del septo de caucho del vial y sumergirlo en la mezcla de polimerización de manera que el nitrógeno burbujas a través del líquido. Deje la tapa del frasco ligeramente suelto para evitar sobrepresiones. Purgar durante 10 min.
      2. Levantar el capilar corriente de nitrógeno de la mezcla de polimerización para el espacio de cabeza del vial, y cerrar herméticamente la tapa. Insertar un capilar funcionalizado a través del septo en la mezcla de polimerización. El exceso de presión generada en el capilar a través del nitrógeno inyectado en el espacio de cabeza bombea la mezcla de polimerización a través del capilar funcionalizado.
      3. Recoger varias gotas de mezcla de polimerización a partir del efluente del capilar para asegurarse de que está completamente lleno y cerrarlo con un tapón de caucho. Tome el capilar fuera del vial muy cuidadosamente y cerrar la entrada del capilar con un septum de goma.
   3. Polimerizar la mezclatura contenida en el capilar en un baño de agua a 60 ° C durante 6 horas. Enfriar a temperatura ambiente y cortar unos pocos milímetros de ambos extremos del capilar. Eliminar los monómeros sin reaccionar y agentes formadores de poros mediante el lavado de la columna con acetonitrilo utilizando una bomba de HPLC a 3 l / min durante 30 min. Compruebe contrapresión de la columna capilar.

2. Crecimiento del Hierro-benzenetrycarboxylate (FeBTC) PCP

1. Crecimiento del FeBTC MSP en un polímero a granel Monolito para la caracterización
   1. Moler el monolito previamente secado utilizando un mortero.
   2. Sumergir 100 mg del polvo monolito en 5 ml de 2 mM FeCl ₃ · 6H ₂ O en etanol durante 15 min. Filtro de vacío usando un filtro de nylon (0,22 micras) y se lava el polvo con etanol. Sumergir el polvo monolito en 5 ml de 2 mM de ácido 1,3,5-bencenotricarboxílico (BTC) en etanol durante 15 min. Filtro de vacío usando un filtro de nylon (0,22 micras) y se lava el polvo con etanol.
   3. Repita el paso número 2 como se desee. El crecimiento de la capa de metal-orgánica final será definido por el número de ciclos aplicados. Típicamente, se realizan entre 10 y 30 ciclos. Confirmar la presencia de nuevos poros por porosimetría de adsorción de nitrógeno. Medir la cantidad de sitios de metal adicionales por análisis termogravimétrico (TGA).
2. Crecimiento de la FeBTC Ministerio de Salud Pública en una columna monolítica capilar para el enriquecimiento de fosfopéptidos
   1. El uso de una bomba de jeringa. Enjuague el monolito capilar con 2 mM FeCl ₃ · 6H ₂ O en etanol durante 15 min a 2 l / min. Lavar con etanol durante 15 min a 2 l / min. Enjuague el monolito capilar con una mM BTC 2 en etanol durante 15 min a 2 l / min. Lavar con etanol durante 15 min a 2 l / min.
   2. Repita el paso 1 como se desee. El crecimiento de la capa de metal-orgánica final será definido por el número de ciclos realizados.

3. La proteína de digestión y Enrichment de Phosphopeptides

1. La digestión de proteínas
   1. Disolver 0,5 ml de leche desnatada en 1 ml de agua y se divide en 200 l fracciones.
   2. Para la digestión de las proteínas añadir bicarbonato de amonio 160 l 1 M y ditiotreitol 50 l 45 mM de cada fracción, con el fin de escindir los enlaces disulfuro. Incubar a 50 ° C en un termomezclador durante 15 min.
   3. Añadir poco a poco 50 l de una solución acuosa de yodoacetamida 100 mM, mientras que la solución se enfrió a temperatura ambiente. Yodoacetamida evitará la formación de nuevos enlaces disulfuro.
   4. Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente. Añadir 1 ml de agua desionizada. Añadir 2 g de tripsina y digerir las proteínas en un termomezclador a 37 ° C durante 14 horas.
   5. Terminar la digestión por acidificación con 10 l de ácido trifluoroacético al 1%, y colocándolo en el termomezclador durante 5 min a temperatura ambiente. Guarde las proteínas digeridas a -20 ° C.
2. Enriquecimiento de fosfopéptidos utilizando una columna capilar Ministerio de Salud Pública.
   1. Lavar la columna con 100 l de una mezcla 4: 1 de acetonitrilo que contiene un ácido trifluoroacético al 0,1% durante 10 min a un caudal de 1 l / min. Bombear la digestión de la proteína a través de la columna a 2 l / min durante 30 min.
   2. Lavar los péptidos no fosforilados de nuevo con una mezcla 4: 1 de acetonitrilo que contiene un ácido trifluoroacético al 0,1% durante 10 min a un caudal de 1 l / min. Lavar con agua durante 10 min a un caudal de 1 l / min.
   3. Fosfopéptidos eluir utilizando una solución tampón de pH 7 de fosfato 250 mM bombeado a 1 l / min durante 15 min. Recoger el eluyente en un vial y desalar la solución utilizando un protocolo estándar ^19. Preparar un ácido / ml de 2,5-dihidroxibenzoico 2 mg de utilizarlo como la matriz para la espectrometría de láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo de masas (MALDI-TOF-MS). Dibujado 2 l de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en la punta para eluir el phosphopeptides y detectar directamente sobre la placa de MALDI.
   4. Analizar las manchas por MALDI-TOF-MS y regenerar la columna mediante el lavado a fondo con agua y luego metanol.

Resultados

Una ilustración esquemática de la PCP crecimiento en la superficie de los poros del monolito de polímero orgánico se muestra en la Figura 1. En esta figura, se ilustra el inicial Fe (III) átomos retenidas en la superficie de los poros del monolito de polímero original, coordinado a grupos funcionales carboxílicos . Utilizando el protocolo descrito en el presente documento ligando orgánico adicional y Fe iones (III) se añaden a la superficie, la conformación de una red de coordinación poroso d...

Discusión

El monolito de polímero original contiene grupos funcionales carboxílicos capaces de unirse a los metales. La coordinación de los sitios de metal iniciales sobre el material original, somos capaces de hacer crecer una capa PCP (Figura 1), la incorporación de una serie de sitios de metales adicionales que configuran una red microporosa. Esto hace que los materiales presentados MSP atractivos para los procedimientos de extracción o purificación donde están involucrados especies metálicas, tales co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyimide-coated capillaries	Polymicro Technologies	TSP100375	100 μm i.d.
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%	Sigma-Aldrich	440159
Styrene, 99%	Sigma-Aldrich	W323306	Technical grade
Divinylbenzene, 80%	Sigma-Aldrich	414565
Methacrylic acid, 98%	Mallinckrodt	MK150659
Toluene, ≥99.5%	EMD chemicals	MTX0735-6
Isooctane, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	650439
2,2'-azobisisobutyronitrile, 98%	Sigma-Aldrich	441090
Aluminium oxide (basic alumina)	Sigma-Aldrich	199443
Iron (III) chloride hexahydrate, 97%	Sigma-Aldrich	236489
1,3,5-benzenetrycarboxylic acid, 95%	Sigma-Aldrich	482749
Acetonitrile, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	360457
Ammonium bicarbonate, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Trifluoroacetic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	302031
Ethanol, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	2854
Iodoacetamide, ≥99%	Sigma-Aldrich	I1149
Dithiothreitol, ≥99%	Sigma-Aldrich	43819
Monobasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71505
Dibasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71643
Phosphoric acid, ≥85%	Sigma-Aldrich	438081
2,5-dihydroxybenzoic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	85707
Trypsin	Sigma-Aldrich	T8003	Bovine pancreas
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905	Bovine milk
ZipTip pipette tips	Merck Millipore	ZTC18S096	C18 resin