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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

Abstract

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.

The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

Introduzione

Polimeri di coordinazione porosi (PCP) sono composti di coordinazione basato su centri metallici collegati da leganti organici di ripetere le entità di coordinamento che si estendono a 1, 2 o 3 dimensioni che possono essere amorfa o cristallina 1-3. Negli ultimi anni, questa classe di materiali porosi ha attirato l'attenzione diffusa a causa della loro elevata porosità, ampia modulabilità chimica, e la loro stabilità. PCP sono stati esplorati per una vasta gamma di applicazioni, tra cui lo stoccaggio del gas, separazione di gas, e catalisi 3-6, e poco tempo fa, le prime applicazioni analitiche di PCP sono stati descritti 7.

A causa delle loro avanzate funzionalità chimica ed alta porosità PCP sono stati presi di mira per il loro enorme potenziale per il miglioramento dei processi di depurazione e separazioni cromatografiche, e un certo numero di segnalazioni relative a questo argomento sono stati pubblicati 7-13. Tuttavia, le prestazioni di PCPs non è attualmente in una equivalelivello nt con materiali cromatografici esistenti probabilmente a causa rapida diffusione attraverso le grandi vuoti interparticellari in letti riempiti di questi solidi a causa della loro morfologia in genere di forma irregolare delle loro particelle o cristalli. Questo imballaggio distribuiti irregolarmente porta ad una minore prestazione del previsto, nonché contropressioni alta colonna e indesiderabili morfologie forma del picco 14,15.

Al fine di risolvere il problema della diffusione veloce attraverso i vuoti fra le particelle e contemporaneamente migliorare le prestazioni di PCPs per applicazioni analitiche, lo sviluppo di un materiale ibrida basata su un polimero macroporoso monolite 16 che contiene il PCP sulla superficie dei macropori sarebbe auspicabile. Monoliti di polimeri sono self-contained, materiali pezzo unico in grado di sostenere il flusso convettivo attraverso i pori, che li rende una delle alternative più efficienti da bordare imballaggi e sono stati commercializzati con successo da diversi c ompanies 17,18. Monoliti polimeri porosi sono generalmente basati sulla polimerizzazione di un monomero e un reticolante in presenza di porogens, tipicamente miscele binarie di solventi organici. I materiali monolitici ottenuti hanno una struttura microglobular e un'elevata porosità e permeabilità flusso.

Un approccio semplice per unificare questi materiali per preparare un monolito polimero contenente un PCP si basa sulla aggiunta diretta di PCPs as-sintetizzati nella miscela di polimerizzazione del monolito. Questo approccio provocato PCPs principalmente sepolto entro un scaffold polimerico, e non essere attivi per l'ulteriore applicazione del materiale finale 14,15. Un diverso approccio sintetico è chiaramente necessaria per, per esempio, sviluppare film uniformi di PCP, o strutture metallo-organici cristallini (MOF) dove la maggior parte dei pori contenute all'interno del cristallo sono accessibili dal macropori del monolite polimero.

t "> Qui riportiamo un semplice protocollo per la preparazione di un materiale polimerico ibrido metallo-organici (MOPH) basato su un supporto polimerico macroporoso con gruppi funzionali adatti per il fissaggio di PCPs, che possono essere facilmente implementati come un self-contained singola -piece monolite polimero in un formato colonna con proprietà ottimali per applicazioni a flusso continuo. La procedura di sintesi del polimero è seguita da una soluzione semplice basata temperatura ambiente   metodo per coltivare un rivestimento PCP sulla superficie interna dei pori del monolite 19-20. Come primo esempio, si descrive la preparazione di un ferro da stiro (III) benzenetricarboxylate (FeBTC) film polimerico coordinamento all'interno di un poli macroporoso (acido stirene-divinilbenzene-metacrilico) monolite. Questo metodo è efficace per la preparazione di polveri all'ingrosso così come colonne capillari e il protocollo descritto è facilmente implementabile ad altri PCP. Come esempio delle potenzialità di MOPHs come materiali funzionali per flow-throuapplicazioni gh, abbiamo applicato il sviluppato FeBTC MOPH che contiene un denso strato di Fe (III) centri per arricchire phosphopeptides da miscele proteiche digeriti sfruttando l'affinità di legame di fosfopeptidi a Fe (III). Il protocollo sviluppato 21 comprende tre parti principali: Preparazione del supporto macroporoso monolite polimero organico; la crescita del rivestimento PCP sulla superficie dei pori del monolite; applicazione per l'arricchimento di fosfopeptidi.

Protocollo

NOTA: Prima di iniziare, controllare tutti i fogli competenti, dati materiali (MSDS). Molti dei prodotti chimici utilizzati nelle procedure di sintesi e di applicazione sono tossici. Si prega di seguire tutte le pratiche di sicurezza appropriate e utilizzare attrezzature adeguate di protezione (camice, pantaloni full-length, scarpe chiuse, occhiali di sicurezza, guanti). Si prega di utilizzare tutte le criogeniche dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione di azoto liquido per le misure di adsorbimento di azoto (guanti isolanti, visiera).

1. poroso Polymer Monolith preparazione in massa e capillare Formatta colonna

  1. Bulk Polymer Monolith per la caratterizzazione
    1. Purificare stirene, divinilbenzene e acido metacrilico attraverso una colonna di allumina basica, al fine di rimuovere gli inibitori di polimerizzazione. Introdurre 10 g di allumina basica in una siringa di plastica monouso ml 25 con un tappo in fibra di lana di vetro confezionato nella punta della siringa. Percolare circa 10 ml del monomero attraverso la colonna.
    2. Caricare i monomeri (50 mg stirene, 100 mg divinilbenzene e 50 mg di acido metacrilico) e gli agenti che formano pori (300 mg toluene e 300 mg) in isoottano un flaconcino di vetro da 1 ml. Aggiungere l'iniziatore della polimerizzazione, 4 mg di 2,2'-azobisisobutirronitrile (AIBN, 1% rispetto ai monomeri).
    3. Omogeneizzare mediante sonicazione per 10 min. Rimuovere l'ossigeno dissolto con gorgogliamento di azoto attraverso il liquido per 10 min. Sigillare il cappuccio della fiala con parafilm e metterlo in un bagno di acqua a 60 ° C per 6 ore per polimerizzare la miscela.
    4. Raffreddare a temperatura ambiente e rompere la fiala con attenzione. Trasferire il monolite di polimero in un ditale di estrazione della cellulosa. Porre il ditale di estrazione in una camera di estrazione Soxhlet e assemblare in un pallone a fondo tondo che contiene un volume di metanolo, che è almeno tre volte il volume della camera di estrazione. Assemblare un condensatore per la parte superiore della camera di estrazione. Eseguire l'estrazione Soxhlet facendo bollire il metanoloper 16 ore, assicurando la completa rimozione dei monomeri non reagiti e poro agenti formatura.
    5. Durante la notte a secco in un forno a vuoto a 60 ° C. Confermare la presenza di gruppi funzionali carbossilici per fissare la PCP Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Misurare la superficie da adsorbimento di azoto porosimetria.
  2. Funzionalizzazione di silice capillari per la preparazione di colonne monolitiche
    1. Tagliare 2 m di 100 micron id capillare di silice fusa poliimmide rivestita. Collegare ad una siringa di vetro 0,25-0,50 ml e lavare il capillare con acetone. Rimuovere l'acetone risciacquando capillare con acqua.
    2. Per attivare il rivestimento di silice interna del capillare, utilizzare una pompa a siringa a fluire una soluzione di NaOH 0,2 M acquosa a 0,25 ml / min per 30 min. Risciacquare con acqua fino a quando l'effluente è neutro.
    3. Utilizzare strisce di carta pH per verificare dell'effluente pH. Per protonare i gruppi silanolo del capillare, pompare un aqueo 0.2 Msoluzione ci HCl attraverso il capillare a 0.25 ml / min per 30 min. Risciacquare con acqua fino a quando l'effluente è neutro. Sciacquare con etanolo.
    4. Pompa a 20% (w / w) soluzione etanolica di 3- (trimetossisilil) propil metacrilato (pH 5 regolato con acido acetico) in 0,25 ml / min per 1 ora. In questa fase, il capillare di silice è funzionalizzato con gruppi vinilici per collegare il monolite polimero alla superficie interna capillare.
    5. Risciacquare con acetone, secco in corrente di azoto e lasciare a temperatura ambiente per una notte prima dell'uso. Tagliare il capillare in brevi pezzi di lunghezza 20 cm.
  3. Preparazione di colonne monolitiche capillari
    1. Preparare una miscela di polimerizzazione identico per il polimero monolite bulk (punto 1.1) in una fiala di vetro da 1 ml con un setto di gomma. Aggiungere iniziatore 1% AIBN rispetto ai monomeri. Omogeneizzare mediante sonicazione per 10 min.
    2. Eliminare la miscela di polimerizzazione con azoto accoppiando un capillare di silice non-funzionalizzatoa un flusso di azoto.
      1. Inserire la corrente di azoto capillare attraverso il setto di gomma del flacone ed immergerlo nella miscela di polimerizzazione in modo che l'azoto bolle nel liquido. Lasciare il tappo flacone leggermente allentato per evitare sovrapressione. Purge per 10 min.
      2. Sollevare il capillare corrente di azoto dalla miscela di polimerizzazione allo spazio di testa della fiala, e chiudere ermeticamente il tappo. Inserire un capillare funzionalizzato attraverso il setto nella miscela di polimerizzazione. L'eccesso di pressione generata nel capillare attraverso l'azoto iniettato spazio di testa pompe miscela di polimerizzazione attraverso il capillare funzionalizzato.
      3. Raccogliere alcune gocce di miscela di polimerizzazione dall'effluente del capillare per assicurarsi che sia completamente riempito e chiuderlo con un setto di gomma. Prendere il capillare dal flaconcino con molta attenzione e chiudere l'ingresso del capillare con un setto di gomma.
    3. Polimerizzare il mixture contenuta nel capillare in un bagno di acqua a 60 ° C per 6 ore. Raffreddare a temperatura ambiente e tagliare qualche millimetro di entrambe le estremità del capillare. Rimuovere monomeri non reagiti e agenti che formano pori svuotando la colonna con acetonitrile usando una pompa HPLC a 3 ml / min per 30 min. Controllare contropressione della colonna capillare.

2. Crescita del ferro benzenetrycarboxylate (FeBTC) PCP

  1. La crescita della FeBTC MOPH su una massa Polymer Monolith per la caratterizzazione
    1. Macinare il monolite precedentemente essiccato con un mortaio e pestello.
    2. Immergere 100 mg della polvere monolite in 5 ml di 2 mM FeCl 3 · 6H 2 O in etanolo per 15 min. Filtro a vuoto usando un filtro di nylon (0,22 micron) e lavare la polvere con etanolo. Immergere la polvere monolite in 5 ml di 2 mM di acido 1,3,5-benzenetricarboxylic (BTC) in etanolo per 15 min. Filtro a vuoto usando un filtro di nylon (0,22 micron) e lavare la polvere con etanolo.
    3. Ripetere il passo numero 2 come desiderato. La crescita del rivestimento metallo-organico finale sarà definito dal numero di cicli richiesti. Tipicamente, vengono eseguiti tra 10 e 30 cicli. Confermare la presenza di nuovi pori mediante adsorbimento di azoto porosimetria. Misurare la quantità di siti di metallo supplementari di analisi termogravimetrica (TGA).
  2. La crescita della FeBTC MOPH su una colonna monolitica capillare per l'arricchimento di fosfopeptidi
    1. Utilizzando una pompa a siringa. Lavare il monolite capillare con 2 mM FeCl 3 · 6H 2 O in etanolo per 15 minuti a 2 microlitri / min. Lavare con etanolo per 15 minuti a 2 microlitri / min. Lavare il monolito capillare con un BTC 2 mM in etanolo per 15 minuti a 2 microlitri / min. Lavare con etanolo per 15 minuti a 2 microlitri / min.
    2. Ripetere il passaggio 1 come desiderato. La crescita del rivestimento metallo-organico finale sarà definito dal numero di cicli eseguiti.

3. digestione delle proteine ​​ed Enrichment di fosfopeptidi

  1. Digestione delle proteine
    1. Sciogliere 0,5 ml di latte scremato in 1 ml di acqua e dividerlo in 200 microlitri frazioni.
    2. Per la digestione delle proteine ​​aggiungere 160 microlitri 1 M di bicarbonato di ammonio e ditiotreitolo 50 microlitri 45 mM per ogni frazione, per aderire i legami disolfuro. Incubare a 50 ° C in un thermomixer per 15 min.
    3. Aggiungere gradualmente 50 ml di una soluzione acquosa di iodoacetamide 100 mM, mentre la soluzione raffreddata a temperatura ambiente. Iodoacetamide impedirà la formazione di nuovi legami disolfuro.
    4. Incubare al buio per 15 min a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml di acqua deionizzata. Aggiungere 2 ug tripsina e digerire le proteine ​​in un thermomixer a 37 ° C per 14 ore.
    5. Terminare la digestione per acidificazione con 10 ml di 1% di acido trifluoroacetico, e ponendolo nella thermomixer per 5 min a temperatura ambiente. Conservare le proteine ​​digerite a -20 ° C.
  2. Arricchimento di fosfopeptidi utilizzando una colonna capillare MOPH.
    1. Lavare la colonna con 100 ml di una miscela 4: 1 di acetonitrile contenente un acido trifluoroacetico 0,1% per 10 minuti a una velocità di flusso di 1 ml / min. Pompa la digestione delle proteine ​​attraverso la colonna, 2 microlitri / min per 30 min.
    2. Lavare i peptidi non-fosforilati nuovo con una miscela 4: 1 di acetonitrile contenente un acido trifluoroacetico 0,1% per 10 minuti a una velocità di flusso di 1 ml / min. Lavare con acqua per 10 minuti ad una velocità di flusso di 1 ml / min.
    3. Fosfopeptidi eluire con una soluzione tampone a pH 7 fosfato 250 mM pompato a 1 ml / min per 15 min. Raccogliere il eluente in una fiala e desalt la soluzione con un protocollo standard 19. Preparare un acido / ml 2,5-diidrossibenzoico 2 mg di utilizzarlo come matrice per la spettrometria di matrice laser assistita desorbimento / ionizzazione a tempo di volo di massa (MALDI-TOF-MS). Disegnato 2 ml di acido 2,5-diidrossibenzoico nella punta per eluire il phosphopeptides e individuare direttamente sulla piastra MALDI.
    4. Analizzare i punti di MALDI-TOF-MS e rigenerare la colonna di lavaggio con acqua e poi il metanolo.

Risultati

Una illustrazione schematica della crescita PCP sulla superficie dei pori del monolito polimero organico è mostrato in Figura 1. In questa figura, illustriamo iniziale Fe (III) atomi trattenuti sulla superficie dei pori del polimero monolite originale coordinato ai gruppi funzionali carbossilici . Utilizzando il protocollo qui descritto aggiuntivo legante organico e Fe (III) ioni vengono aggiunti alla superficie, modellare una rete di coordinamento porosa all'interno del monolite polimero. ...

Discussione

Il polimero monolite originale contiene gruppi funzionali carbossilici in grado di legarsi ai metalli. Coordinare i siti metallici iniziali sul materiale originale, siamo in grado di crescere un rivestimento PCP (Figura 1A), che incorpora una serie di siti di metallo supplementari plasmare una rete microporosa. Questo rende i materiali MOPH presentati attraenti per procedure di estrazione o di purificazione in cui sono coinvolti specie metalliche, come la tecnica cromatografia di affinità con ioni meta...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

This work has been performed at the Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory and supported by the Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, Scientific User Facilities Division of the US Department of Energy, under Contract No. DE-AC02–05CH11231. The financial support of F.M. by a ME-Fulbright fellowship and A.S. by Higher Education Commission of Pakistan are gratefully acknowledged.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Polyimide-coated capillariesPolymicro TechnologiesTSP100375100 μm i.d.
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%Sigma-Aldrich440159
Styrene, 99%Sigma-AldrichW323306Technical grade
Divinylbenzene, 80%Sigma-Aldrich414565
Methacrylic acid, 98%MallinckrodtMK150659
Toluene, ≥99.5%EMD chemicalsMTX0735-6
Isooctane, ≥99.5%Sigma-Aldrich650439
2,2'-azobisisobutyronitrile, 98%Sigma-Aldrich441090
Aluminium oxide (basic alumina)Sigma-Aldrich199443
Iron (III) chloride hexahydrate, 97%Sigma-Aldrich236489
1,3,5-benzenetrycarboxylic acid, 95%Sigma-Aldrich482749
Acetonitrile, ≥99.5%Sigma-Aldrich360457
Ammonium bicarbonate, ≥99.5%Sigma-Aldrich9830
Trifluoroacetic acid, ≥99%Sigma-Aldrich302031
Ethanol, ≥99.8%Sigma-Aldrich2854
Iodoacetamide, ≥99%Sigma-AldrichI1149
Dithiothreitol, ≥99%Sigma-Aldrich43819
Monobasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%Sigma-Aldrich71505
Dibasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%Sigma-Aldrich71643
Phosphoric acid, ≥85%Sigma-Aldrich438081
2,5-dihydroxybenzoic acid, ≥99%Sigma-Aldrich85707
TrypsinSigma-AldrichT8003Bovine pancreas
β-caseinSigma-AldrichC6905Bovine milk
ZipTip pipette tipsMerck MilliporeZTC18S096C18 resin

Riferimenti

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