Préparation de la grande porosité de coordination Polymer Coatings sur macroporeuses Polymer monolithes pour enrichissement accrue des Phosphopeptides

Résumé

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

Résumé

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.

The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

Introduction

Les polymères poreux de coordination (PCP) sont des composés de coordination basé sur des centres métalliques reliés par des ligands organiques de répéter les entités de coordination étendant dans une, deux ou trois dimensions qui peut être amorphe ou cristallin ^3.1. Au cours des dernières années, cette classe de matériaux poreux a attiré une large attention en raison de leur porosité élevée, large accordabilité chimique et leur stabilité. PCP ont été explorées pour une gamme d'applications, y compris le stockage de gaz, la séparation de gaz, et la catalyse ^3-6, et très récemment, les premières applications analytiques du PCP ont été décrits ^7.

En raison de leur fonctionnalité chimique et haute porosité PCP améliorées ont été ciblés pour leur potentiel énorme pour l'amélioration des procédés de purification et de séparations chromatographiques, et un certain nombre de rapports concernant ce sujet ont été publiés ^7-13. Toutefois, la performance des médecins généralistes ne sont pas actuellement à un equivaleniveau nt avec des matériaux chromatographiques existantes probablement en raison de la diffusion rapide grâce à de grands vides interparticulaires dans un garnissage de ces solides en raison de leurs morphologies généralement de forme irrégulière de leurs particules ou de cristaux. Cet emballage irrégulièrement répartis conduit à une performance plus faible que prévu, ainsi que les contre-pressions de haute colonne et indésirables morphologies de forme de pic ^14,15.

Afin de résoudre le problème de la diffusion rapide à travers les vides entre les particules et de façon concomitante améliorer les performances des produits de soins personnels pour des applications d'analyse, l'élaboration d'un matériau hybride à base d'un monolithe de polymère macroporeux ¹⁶ qui contient le PCP sur la surface des macropores serait souhaitable. monolithes de polymères sont autonomes, les matériaux d'une seule pièce qui peuvent soutenir les flux de convection à travers leurs pores, ce qui les rend l'une des alternatives les plus efficaces à perler emballages et ont été commercialisés avec succès par plusieurs c es entreprises ^17,18. Monolithes poreux de polymère sont généralement basés sur la polymérisation d'un monomère et un agent de réticulation en présence d'agents porogènes, qui sont typiquement des mélanges binaires de solvants organiques. Les matériaux monolithiques obtenus présentent une structure de microglobular et une porosité et une perméabilité élevée à l'écoulement.

Une approche simple pour unifier ces matériaux pour préparer un monolithe de polymère contenant un PCP est basée sur l'addition directe de produits de soins personnels tels que synthétisés dans le mélange de polymérisation du monolithe. Cette approche conduit à PCP plupart enterré dans un échafaudage de polymère, et ne pas être actif pour l'application ultérieure du matériau final ^14,15. Une approche synthétique différente est clairement nécessaire afin de, par exemple, développer des films uniformes de PCP ou des cadres organiques de métaux cristallins (MOF) où la majorité des pores contenus dans le cristal sont accessibles depuis les macropores du monolithe polymère.

t "> Nous rapportons ici un protocole simple pour la préparation d'un matériau hybride de polymère organique de métal (MSP) basé sur un support polymère macroporeux avec des groupes fonctionnels appropriés pour la fixation des médecins généralistes, qui peuvent être facilement mises en œuvre comme un autonome unique -Pièce monolithe polymère sous forme de colonne avec des propriétés optimales pour des applications dynamiques. Le mode opératoire de synthèse de polymère est suivie d'une solution sur la base de la température ambiante simple,   Procédé pour faire croître une couche de PCP sur la surface interne des pores du monolithe ^{de 19 à 20.} En tant que premier exemple, on décrit la préparation d'un film de polymère de coordination de fer (III) benzènetricarboxylate (FeBTC) dans un poly macroporeux (styrène-acide méthacrylique-divinylbenzène) monolithe. Ce procédé est efficace pour la préparation de poudres en vrac ainsi que des colonnes capillaires et le protocole décrit est facilement réalisable pour d'autres produits de soins personnels. A titre d'exemple du potentiel de MSPA comme matériaux fonctionnels pour l'écoulement through applications, nous avons appliqué le MDSP FeBTC développé qui contient un revêtement dense de Fe (III) pour enrichir phosphopeptides centres de mélanges de protéines digérées exploitant l'affinité de liaison de phosphopeptides de Fe (III). Le protocole mis au point ²¹ comprend trois parties principales: la préparation du polymère organique support monolithique macroporeuse; la croissance de la couche de PPC sur la surface des pores du monolithe; demande de l'enrichissement de phosphopeptides.

Protocole

NOTE: Avant de commencer, vérifiez que toutes les feuilles de données pertinentes matérielles (FS). Plusieurs des produits chimiques utilisés dans les procédures de synthèse et d'application sont toxiques. S'il vous plaît suivre toutes les pratiques de sécurité appropriées et utiliser l'équipement de protection adéquat (blouse, pantalon pleine longueur, des chaussures fermées, des lunettes de sécurité, gants). S'il vous plaît utiliser tous les équipements de protection individuelle cryogénique lors de la manipulation de l'azote liquide pour les mesures d'adsorption d'azote (gants isolants, écran facial).

1. poreux Polymer Monolith Préparation en vrac et colonne capillaire Format

1. Bulk Polymer Monolith pour la caractérisation
   1. Purifier le styrène, le divinylbenzène et l'acide méthacrylique à travers une colonne d'alumine basique, afin d'éliminer les inhibiteurs de polymérisation. Placez 10 g d'alumine basique dans un ml seringue en plastique jetable 25 avec un bouchon de fibres de laine de verre emballé dans l'embout de la seringue. Percoler à environ 10 ml du monomère à travers la colonne.
   2. Charger les monomères de styrène (50 mg, 100 mg et 50 mg divinylbenzène acide méthacrylique) et les agents formant des pores (300 mg de toluène et 300 mg isooctane) dans un flacon de 1 ml en verre. Ajouter l'initiateur de la polymérisation, 4 mg de 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN, 1% par rapport aux monomères).
   3. Homogénéiser par sonication pendant 10 min. Éliminer l'oxygène dissous par barbotage d'azote à travers le liquide pendant 10 minutes. Sceller le bouchon du flacon avec un film de paraffine et placer dans un bain d'eau à 60 ° C pendant 6 heures pour polymériser le mélange.
   4. Refroidir à la température ambiante et de briser le flacon soigneusement. Transférer le monolithe de polymère dans une cartouche d'extraction en cellulose. Placer la cartouche d'extraction dans une chambre d'extraction Soxhlet et l'assembler à un ballon à fond rond contenant un volume de methanol, qui est au moins trois fois le volume de la chambre d'extraction. Assemblage d'un condenseur à la partie supérieure de la chambre d'extraction. Réaliser une extraction Soxhlet en faisant bouillir le méthanolpendant 16 heures, en veillant à l'élimination complète des monomères non réagis et des agents formant des pores.
   5. Sécher toute la nuit dans une étuve à vide à 60 ° C. Confirmer la présence de groupes fonctionnels carboxyliques pour fixer la PCP par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR). Mesurer la surface par adsorption d'azote porosimétrie.
2. Fonctionnalisation de silice capillaires pour la préparation de colonnes monolithiques
   1. Couper 2 m d'un 100 um id silice fondue capillaire de polyimide revêtu. Connectez-le à une seringue en verre de 0,25-0,50 ml et laver le capillaire avec de l'acétone. Retirer l'acétone par rinçage du capillaire avec de l'eau.
   2. Pour activer le revêtement interne de silice du capillaire, en utilisant une pompe à seringue à couler une solution 0,2 M de NaOH aqueux à 0,25 ul / min pendant 30 min. Rincer à l'eau jusqu'à ce que l'effluent soit neutre.
   3. Utiliser des bandes de papier pH pour vérifier pH de l'effluent. Afin de protoner les groupes silanol du capillaire, une pompe Aqueo 0,2 Mune solution de HCl nous à travers le capillaire à 0,25 ul / min pendant 30 min. Rincer à l'eau jusqu'à ce que l'effluent soit neutre. Rincez avec de l'éthanol.
   4. Pompe à 20% (p / p) de solution éthanolique d'acide 3- (triméthoxysilyl) propyl méthacrylate (pH ajusté avec de l'acide 5 acétique) à 0,25 ul / min pendant 1 heure. Dans cette étape, le capillaire en silice est fonctionnalisée par des groupes vinyle dans le but de fixer le monolithe de polymère à la surface intérieure capillaire.
   5. Rincez avec de l'acétone et au sec dans un courant d'azote et le laisser à température ambiante pendant une nuit avant de l'utiliser. Couper le capillaire dans des pièces plus courtes de longueur 20 cm.
3. Préparation des colonnes monolithiques capillaires
   1. Préparer un mélange de polymérisation identique à celui pour le monolithe de polymère en masse (section 1.1) dans une fiole en verre de 1 ml avec un septum en caoutchouc. Ajouter initiateur 1% par rapport à AIBN monomères. Homogénéiser par sonication pendant 10 min.
   2. Purger le mélange de polymérisation avec de l'azote par couplage d'un capillaire en silice non-fonctionnalisépour un courant d'azote.
      1. Insérer le capillaire de courant d'azote à travers le septum en caoutchouc du flacon et plonger dans le mélange de polymérisation de sorte que l'atome d'azote barbote à travers le liquide. Laissez le bouchon du flacon un peu lâche pour éviter une surpression. Purger pendant 10 min.
      2. Soulevez le capillaire de flux d'azote dans le mélange de polymérisation à l'espace de tête de la fiole, et fermer hermétiquement le bouchon. Insérer un capillaire fonctionnalisé à travers le septum dans le mélange de polymérisation. L'excès de pression dans le capillaire générée par l'azote injecté dans l'espace de tête pompe le mélange de polymérisation à travers le capillaire fonctionnalisé.
      3. Recueillir quelques gouttes de mélange de polymérisation à partir de l'effluent du capillaire pour qu'il soit complètement rempli et refermer avec un septum en caoutchouc. Prenez le capillaire du flacon très soigneusement et fermer l'entrée du capillaire avec un septum en caoutchouc.
   3. Polymériser le mélangeture contenu dans le capillaire dans un bain d'eau à 60 ° C pendant 6 heures. Refroidir à la température ambiante et de couper quelques millimètres des deux extrémités du capillaire. Éliminer les monomères non réagis et des agents formant des pores en rinçant la colonne avec de l'acétonitrile en utilisant une pompe de CLHP à 3 ul / min pendant 30 min. Vérifier la contre-pression de la colonne capillaire.

2. Croissance du Fer-benzenetrycarboxylate (FeBTC) PCP

1. La croissance de l'FeBTC MSP sur un polymère Monolith en vrac pour la caractérisation
   1. Broyer le monolithe préalablement séché en utilisant un mortier et un pilon.
   2. Immerger 100 mg de la poudre de monolithe dans 5 ml de 2 mM de FeCl ₃ · 6H ₂ O dans de l'éthanol pendant 15 min. On filtre sous vide en utilisant un filtre en nylon (0,22 um) et laver la poudre avec de l'éthanol. Immerger la poudre de monolithe dans 5 ml d'acide 2 mM de 1,3,5-benzène tricarboxylique (BTC) dans de l'éthanol pendant 15 min. On filtre sous vide en utilisant un filtre en nylon (0,22 um) et laver la poudre avec de l'éthanol.
   3. Répétez l'étape numéro 2 comme vous le souhaitez. La croissance de la couche organique de métal-finale sera définie par le nombre de cycles appliqués. En règle générale, entre 10 et 30 cycles sont effectués. Confirmer la présence de nouveaux pores par adsorption d'azote porosimétrie. Mesurer la quantité de sites métalliques supplémentaires par analyse thermogravimétrique (TGA).
2. La croissance de la FeBTC MDSP sur une colonne monolithique capillaire pour l'enrichissement de phosphopeptides
   1. En utilisant une pompe à seringue. Rincer le monolithe capillaire avec 2 mM de FeCl ₃ · 6H ₂ O dans de l'éthanol pendant 15 min à 2 ul / min. Laver avec de l'éthanol pendant 15 min à 2 ul / min. Rincer le monolithe avec un capillaire BTC 2 mM dans de l'éthanol pendant 15 min à 2 ul / min. Laver avec de l'éthanol pendant 15 min à 2 ul / min.
   2. Répétez l'étape 1 comme on le souhaite. La croissance de la couche organique de métal final sera défini par le nombre de cycles effectués.

3. la digestion des protéines et Enrichment de Phosphopeptides

1. La digestion des protéines
   1. Dissoudre 0,5 ml de lait écrémé dans 1 ml d'eau et le diviser en fractions de 200 pi.
   2. Pour la digestion de la protéine ajouter 160 ul de 1 M de bicarbonate d'ammonium 50 mM de dithiothréitol et 45 ul de chaque fraction, afin de cliver les liaisons disulfure. Incuber à 50 ° C dans un Thermomixer pendant 15 min.
   3. Ajouter peu à peu 50 ul d'une solution aqueuse d'iodoacétamide 100 mM, tandis que la solution a été refroidie jusqu'à la température ambiante. Iodoacetamide permettra d'éviter la formation de nouvelles liaisons disulfures.
   4. Incuber dans l'obscurité pendant 15 min à température ambiante. Ajouter 1 ml d'eau déminéralisée. Ajouter 2 ug de trypsine et digérer les protéines dans un Thermomixer à 37 ° C pendant 14 h.
   5. Mettre fin à la digestion par acidification avec 10 pi d'acide trifluoroacétique à 1%, et de le placer dans le Thermomixer pendant 5 min à température ambiante. Stocker les protéines digérées à -20 ° C.
2. Enrichissement de phosphopeptides en utilisant une colonne capillaire de MSP.
   1. Rincer la colonne avec 100 ul d'un mélange 4: 1 d'acétonitrile contenant un acide trifluoroacétique à 0,1% pendant 10 min à un débit de 1 pl / min. Pomper la digestion des protéines à travers la colonne à 2 ul / min pendant 30 min.
   2. Laver les peptides non phosphorylés à nouveau avec un mélange 4: 1 d'acétonitrile contenant un acide trifluoroacétique à 0,1% pendant 10 min à un débit de 1 pl / min. Laver à l'eau pendant 10 min à un débit de 1 pl / min.
   3. Phosphopeptides éluées en utilisant une solution tampon de phosphate pH 7 250 mM pompé à 1 pl / min pendant 15 min. Recueillir l'éluant dans un flacon et dessaler la solution en utilisant un protocole standard ^{de 19.} Préparer un acide / ml de 2,5-dihydroxybenzoïque 2 mg de l'utiliser en tant que matrice pour la spectrométrie laser assistée par matrice de désorption / ionisation à temps de vol de masse (MALDI-TOF-MS). Dessiné 2 pi de l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque dans la pointe pour éluer le phosphopeptides et repèrent directement sur la plaque MALDI.
   4. Analyser les taches par MALDI-TOF-MS et régénérer la colonne Bien rincer avec de l'eau puis méthanol.

Résultats

Une illustration schématique de l'évolution de la PCP sur la surface des pores du monolithe de polymère organique est représenté sur la Figure 1. Sur cette figure, on illustre la première Fe (III) atomes retenus sur la surface des pores du monolithe de polymère initial coordonné à groupes fonctionnels carboxyliques . En utilisant le protocole décrit ligand organique présent mémoire supplémentaire et Fe ions (III) sont ajoutés à la surface, formant un réseau de coordination poreux à ...

Discussion

Le monolithe de polymère d'origine contient des groupes fonctionnels carboxyliques capables de se lier aux métaux. Coordonner les sites métalliques initiales sur le matériau d'origine, nous sommes en mesure de développer un revêtement de PCP (figure 1A), intégrant un certain nombre de sites métalliques supplémentaires de mise en forme d'un réseau microporeux. Cela rend les matériaux de MDSP présentés attractifs pour les procédures d'extraction ou de purification, où les es...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyimide-coated capillaries	Polymicro Technologies	TSP100375	100 μm i.d.
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%	Sigma-Aldrich	440159
Styrene, 99%	Sigma-Aldrich	W323306	Technical grade
Divinylbenzene, 80%	Sigma-Aldrich	414565
Methacrylic acid, 98%	Mallinckrodt	MK150659
Toluene, ≥99.5%	EMD chemicals	MTX0735-6
Isooctane, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	650439
2,2'-azobisisobutyronitrile, 98%	Sigma-Aldrich	441090
Aluminium oxide (basic alumina)	Sigma-Aldrich	199443
Iron (III) chloride hexahydrate, 97%	Sigma-Aldrich	236489
1,3,5-benzenetrycarboxylic acid, 95%	Sigma-Aldrich	482749
Acetonitrile, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	360457
Ammonium bicarbonate, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Trifluoroacetic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	302031
Ethanol, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	2854
Iodoacetamide, ≥99%	Sigma-Aldrich	I1149
Dithiothreitol, ≥99%	Sigma-Aldrich	43819
Monobasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71505
Dibasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71643
Phosphoric acid, ≥85%	Sigma-Aldrich	438081
2,5-dihydroxybenzoic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	85707
Trypsin	Sigma-Aldrich	T8003	Bovine pancreas
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905	Bovine milk
ZipTip pipette tips	Merck Millipore	ZTC18S096	C18 resin