Grabación de potencial evocado visual en un modelo de rata de Experimental del Nervio Óptico Desmielinización

Resumen

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Resumen

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Introducción

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos y las directrices de la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Macquarie.

1. VEP Electrodo Implantación

1. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg / kg) y medetomidina (0,5 mg / kg).
   Nota: Después de la inducción de la anestesia, observar los reflejos de retirada (prueba de pellizco, reflejo corneal y palpebral, etc.) y su ausencia como una indicación para comenzar la cirugía. Continuamente observar a los animales durante toda la cirugía y administrar fármaco anestésico adicional (10% de la dosis de ketamina inicial por top-up) si los reflejos están presentes. Las ratas adultas (> 12 semanas) se utilizan en los experimentos.
2. Afeitarse la piel de la zona quirúrgica.Colocar el animal en un cojín de calentamiento (37 ° C) para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Preparar la piel mediante la aplicación tópica de povidona yodada. Aplicar drapeado quirúrgico. Aplicar pomada oftálmica tópica para evitar la sequedad de la córnea bajo anestesia general. Mantener la asepsia utilizando instrumentos estériles.
3. Hacer una incisión en la piel en la línea media longitudinal de la piel de la cabeza. Despeja el tejido conectivo para lograr una buena exposición del cráneo.
4. Con cuidado, perforar pequeños agujeros de trépano manualmente utilizando un taladro micro mano en 7 mm detrás del bregma y 3 mm lateral a la línea media.
5. Electrodos tornillo de implante a través del cráneo en la corteza (zona 17), que penetran en la corteza a una profundidad de aproximadamente 0,5 mm. Implantar un electrodo tornillo de referencia en mm rostral línea media 3 al bregma. Aplicar cemento dental para encajonar y fijar los tornillos (no siempre es necesario).
6. Suturar la piel de la cabeza, administrar pomada antibiótica sobre la piel y permitir que el animal en Recover de la anestesia en un cojín de calentamiento.
   Nota: Como alternativa, los electrodos se pueden dejar expuestos, por lo que la piel no necesita ser reabierto en cada grabación. Inmediatamente después de la cesación de la cirugía, pero antes de la recuperación de la anestesia, administrar un fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID) (si no se administra antes de la cirugía) o un analgésico opioide. Monitorear los animales constantemente hasta que la recuperación total de la anestesia y totalmente ambulatoria.
7. Deje por lo menos 1 semana para que los animales se recuperan de la cirugía antes de la grabación VEP.

2. Inyección Nervio Óptico

1. Anestesiar al animal, preparar la piel y aplicar drapeado que el anterior (1.1 y 1.2).
2. Hacer una incisión de 1 a 1,5 cm en la piel por encima de la órbita de un ojo seleccionados al azar. Abra el tejido subcutáneo para alcanzar la cavidad orbital usando iris finas tijeras. Abra la conjuntiva y anterior de la cápsula de Tenon bajo el microscopio operativo.
3. Retirar la extraoculareslos músculos y las glándulas lagrimales intraobital para exponer aproximadamente 3 mm de longitud del nervio óptico. Abra las capas de duramadre y materia aracnoide alrededor del nervio óptico longitudinal utilizando una cuchilla oftálmica.
4. Inserte la pipeta de vidrio en el nervio óptico a una distancia de 2 mm posterior al globo. La micropipeta de vidrio está unida a una jeringa Hamilton.
5. Inyectar 1% lisolecitina (0,4 a 1,0 l, con 0,02% de azul de Evan que no tiene efectos sobre la mielinización) lentamente en el nervio aproximadamente durante un período de 30 seg.
6. Suturar la incisión de la piel. Aplique ungüento antibiótico para prevenir la infección. Compañeros de ojos se pueden servir como controles internos para grabaciones de electrofisiología.
7. Coloque los animales sobre una almohadilla de calentamiento para recuperarse de la anestesia.

3. VEP grabación

1. Anestesiar el animal y preparar la piel como 1.1 y 1.2.
   Nota: dosis más baja de los anestésicos puede ser utilizado para reco electrofisiológicording (ketamina 40 mg / kg y medetomidina 0,25 mg / kg).
2. Coloque la rata en un cuarto oscuro y deje que se adapte a la oscuridad de 5-30 min. En algunos casos, las ratas pueden ser, respectivamente, adaptada a la oscuridad O / N para escotópica o la luz adaptado para grabaciones VEP fotópica ^8.
3. Mantener la temperatura corporal a 37 ± 0,5 ° C por el sistema manta homeotermos con una sonda de termómetro rectal.
4. Dilatar las pupilas con gotas para los ojos 1,0% tropicamida. Abra la piel sobre el cráneo para acceder al pre-colocado en electrodos de tornillo in situ.
5. Conectar el tornillo sobre la corteza visual del ojo contralateral estimulado y el tornillo de referencia para el amplificador. Inserte un electrodo de aguja en la cola como el suelo. Medir y mantener la impedancia del electrodo por debajo de 5 kW.
6. Coloque un estimulador mini-Ganzfeld directamente sobre la piel alrededor de los párpados para proporcionar aislamiento ojo superiores ^7. La iluminación del estimulador debe calibrarse de antemanopor un fotómetro.
7. Entregar la estimulación fótica través de destellos de luz de 100 veces a una frecuencia de 1 Hz, con bajas y altas configuración del filtro de paso de banda de 1 Hz y 100, respectivamente. La tasa de muestreo de la señal es en 5 kHz.
   Nota: Las señales deben ser muestreados al menos a unos 250 a 300 Hz para asegurar que más de dos muestras se recogen durante cada ciclo.
8. Suturar la piel de la espalda y mantener a los animales en un cojín de calentamiento para recuperarse de la anestesia. La grabación se puede grabar varias veces en animales individuales para monitorear los cambios funcionales en un período de tiempo.
9. En el punto final, administrar una inyección sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg / kg, ip) para la eutanasia del animal. Confirmar la eutanasia por paro cardíaco, parada respiratoria y disminución de la temperatura corporal.

4. Preparación del tejido e Histología

1. Quitar los nervios ópticos de los animales sacrificados bajo el microscopio y fijar el tejido en 1% de paraformaldehído O / N.
2. Lavar el tejido a fondo con solución salina. Tratar el tejido en un procesador automático de tejidos e incrustar en parafina. Secciones fotografica (5-10 micras) con un micrótomo rotatorio.
   Nota: Para el estudio inmunohistoquímico, fijar tejidos en paraformaldehído al 1%, se lava con solución salina y se incuba con un 30% de sacarosa O / N. Incrustar tejidos en octubre medio de inclusión y hacer cryosections usando un criostato.
3. Incubar las secciones en 0,1% solución de azul rápido como Luxol (en el 95% de etanol) O / N a 56 ° C. Diferenciar las secciones de 0,05% de carbonato de litio durante 30 segundos y luego etanol al 70% durante 30 seg. Por último, contrateñir en solución violeta de cresilo 0,1% durante 30 segundos antes de montar las secciones. Utilice la tinción con azul rápido para identificar la mielina en el nervio óptico ^5.

Resultados

Reproducibles rastros VEP intra períodos de sesiones se muestran en la Figura 1 y un retraso significativo en la latencia N1 se pueden ver después de la inyección del nervio óptico. Las lesiones del nervio óptico parciales de desmielinización se pueden observar en las secciones histológicas utilizando Luxol tinción azul rápido ^5. La figura 2 muestra una sección representativa con una pequeña lesión desmielinizada focal en el centro del nervio óptico. Tenga en cue...

Discusión

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129