Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

Riepilogo

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Abstract

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Introduzione

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con il Codice di condotta australiano per la cura e l'uso di animali a scopi scientifici e gli orientamenti della Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e sono stati approvati dalla Animal Comitato Etico della Macquarie University.

1. VEP elettrodi impianto

1. Anestetizzare l'animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg).
   Nota: Dopo l'induzione dell'anestesia, osservare i riflessi di prelievo (test pizzico, riflessi cornea e della palpebra, ecc) e la loro assenza come indicazione per iniziare un intervento chirurgico. Monitorare continuamente gli animali in tutta la chirurgia e amministrare anestetico supplementare (10% della dose di ketamina iniziale per top-up) se sono presenti i riflessi. Ratti adulti (> 12 settimane) sono usati negli esperimenti.
2. Radere la pelle della zona chirurgica.Posto l'animale su un blocco di riscaldamento (37 ° C) per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. Preparare la pelle attraverso l'applicazione topica di povidone-iodio. Applicare drappeggio chirurgica. Applicare attualità pomata oftalmica per prevenire la secchezza della cornea in anestesia generale. Mantenere asepsi utilizzando strumenti sterili.
3. Effettuare una incisione cutanea longitudinale sulla linea mediana della pelle testa. Eliminare il tessuto connettivo, per ottenere una buona esposizione del cranio.
4. Con cautela, praticare dei piccoli fori radica manualmente utilizzando un trapano micro mano a 7 mm dietro il bregma e 3 mm lateralmente alla linea mediana.
5. Elettrodi vite implantare attraverso il cranio nella corteccia (area 17), penetrando la corteccia ad una profondità di circa 0,5 mm. Impiantare un elettrodo di vite di riferimento sulla linea mediana 3 mm rostrale al bregma. Applicare cemento dentale di racchiudere e fissare le viti (non sempre necessario).
6. Suturare la pelle della testa, amministrare pomata antibiotica sulla pelle e consentire all'animale di recover dall'anestesia su un blocco di riscaldamento.
   Nota: In alternativa, gli elettrodi possono essere lasciati esposti, in modo che la pelle non deve essere riaperto in ogni registrazione. Immediatamente al momento della cessazione di un intervento chirurgico, ma prima del recupero anestetico, somministrare un farmaco non steroideo anti-infiammatori (FANS) (se non somministrato in fase preoperatoria) o un analgesico oppiaceo. Monitorare gli animali costantemente fino al pieno recupero da anestetico e completamente ambulatoriale.
7. Lasciare almeno 1 settimana per gli animali di recuperare da un intervento chirurgico prima della registrazione VEP.

2. Optic Nerve iniezione

1. Anestetizzare l'animale, preparare la pelle e applicare drappeggio come sopra (1.1 e 1.2).
2. Fare un 1 a 1,5 cm incisione nella pelle sopra l'orbita di un occhio selezionata casualmente. Aprire il tessuto sottocutaneo per raggiungere la cavità orbitale con iris sottili forbici. Aprire la congiuntiva e la capsula di Tenon anteriore sotto il microscopio operatorio.
3. Ritrarre la extraocularemuscoli e ghiandole lacrimali intraobital per esporre circa 3 mm di lunghezza del nervo ottico. Aprire la dura madre e materia aracnoide strati attorno al nervo ottico longitudinalmente utilizzando una lama oftalmica.
4. Inserire la pipetta di vetro nel nervo ottico ad una distanza di 2 mm posteriormente al globo. La micropipetta di vetro è attaccato ad una siringa Hamilton.
5. Iniettare 1% lisolecitina (0,4-1,0 microlitri, con 0,02% di blu di Evan che non ha effetti sulla mielinizzazione) lentamente nel nervo circa per un periodo di 30 sec.
6. Suturare la incisione cutanea. Applicare una pomata antibiotica per prevenire l'infezione. Occhi Compagni possono essere serviti come controlli interni per le registrazioni elettrofisiologiche.
7. Mettere gli animali su un blocco di riscaldamento di recuperare da anestesia.

3. VEP registrazione

1. Anestetizzare l'animale e preparare la pelle come 1.1 e 1.2.
   Nota: Lower dose di anestetici può essere utilizzato per reco elettrofisiologicarding (ketamina 40 mg / kg e medetomidina 0,25 mg / kg).
2. Mettere il topo in una stanza buia e permettono di adattarsi al buio per 5-30 min. In alcuni casi, i ratti possono rispettivamente essere scuro O adattato / N per scotopica o la luce adatta per le registrazioni fotopica VEP ^8.
3. Mantenere la temperatura corporea a 37 ± 0,5 ° C dal sistema coperta homoeothermic con una sonda termometro rettale.
4. Dilatare le pupille con 1,0% tropicamide collirio. Aprire la pelle sopra il cranio per accedere al pre-posto in elettrodi vite situ.
5. Collegare la vite sulla corteccia visiva controlaterale dell'occhio stimolata e la vite riferimento all'amplificatore. Inserire un elettrodo ago nel coda come la terra. Misurare e mantenere l'impedenza dell'elettrodo sotto 5 kΩ.
6. Mettere uno stimolatore mini-Ganzfeld direttamente sulla pelle intorno alle palpebre per fornire l'isolamento occhio superiore ^7. L'illuminazione dello stimolatore necessario calibrare anticipoda un fotometro.
7. Invia stimolazione luminosa attraverso lampi di luce 100 volte alla frequenza di 1 Hz, con impostazioni del filtro passa-banda bassa e alta di 1 e 100 Hz, rispettivamente. La frequenza di campionamento del segnale è a 5 kHz.
   Nota: I segnali devono essere campionati almeno a circa 250-300 Hz per garantire che più di due campioni vengono raccolti durante ogni ciclo.
8. Suturare la pelle posteriore e tenere gli animali su un blocco di riscaldamento di recuperare da anestesia. La registrazione può essere ripetutamente registrati su singoli animali per monitorare le variazioni funzionali per un periodo di tempo.
9. Al punto finale, somministrare una iniezione sovradosaggio di pentobarbitone sodio (100 mg / kg, ip) euthanize all'animale. Conferma eutanasia arresto cardiaco, arresto respiratorio e diminuzione della temperatura corporea.

4. Preparazione del tessuto e Istologia

1. Rimuovere i nervi ottici da animali eutanasia sotto il microscopio e fissare il tessuto in 1% paraformaldeide O / N.
2. Lavare accuratamente i tessuti con soluzione fisiologica. Trattare il tessuto in un processatore automatico ed incorporare in paraffina. Sezioni tagliate (5-10 micron) utilizzando un microtomo rotativo.
   Nota: per studio immunoistochimica, fissare il tessuto in 1% paraformaldeide, lavare con soluzione fisiologica e incubare con il 30% di saccarosio O / N. Tessuto Incorpora in OCT mezzo di inclusione e fare criosezioni utilizzando un criostato.
3. Incubare sezioni 0,1% soluzione blu veloce come il Luxol (nel 95% di etanolo) O / N a 56 ° C. Differenziare le sezioni a 0,05% di carbonato di litio per 30 sec e poi 70% di etanolo per altri 30 sec. Infine, colorazione di contrasto in soluzione violetto cresolo 0,1% per 30 sec prima di montare sezioni. Utilizzare la veloce colorazione blu per identificare mielina nel nervo ottico ^5.

Risultati

Riproducibili PEV tracce intra-sessione sono mostrati in Figura 1 e un significativo ritardo nella latenza N1 possono essere osservati dopo l'iniezione nervo ottico. Lesioni del nervo ottico parziali di demielinizzazione può essere osservato su sezioni istologiche utilizzando Luxol veloce colorazione blu ^5. La Figura 2 mostra una sezione rappresentativa con una piccola lesione demyelinated focale nel centro del nervo ottico. Si noti che la sezione trasversale non rappres...

Discussione

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129