Визуальный вызванных потенциалов Запись в крысиной модели экспериментальной зрительного нерва демиелинизация

Резюме

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Аннотация

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Введение

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

О себе Этика: Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с австралийским Кодекса практики по уходу и использованию животных для научных целей и принципов в заявлении ARVO для использования животных в офтальмологических и Vision Research, и были одобрены Комитет по этике Животное Macquarie University.

1. ВЭП Электрод Имплантация

1. Обезболить животное с внутрибрюшинной инъекции кетамина (75 мг / кг) и медетомидина (0,5 мг / кг).
   Примечание: После индукции анестезии, наблюдать рефлексы отмены (щепотка испытаний, роговицы и глазная рефлекторные и т.д.) и их отсутствие как признак, чтобы начать операцию. Постоянно следить животных на протяжении операции и управлять дополнительной обезболивающий препарат (10% от начальной дозы кетамина на топ-Up), если рефлексы присутствуют. Взрослые крысы (> 12 недель) используют в опытах.
2. Бритье кожи операционного поля.Поместите животное на площадку потепления (37 ° C), чтобы поддерживать температуру тела во время операции. Подготовьте кожу через местного применения повидон-йода. Применить хирургического драпировки. Применить актуальные глазной мази, чтобы предотвратить сухость роговицы под общим наркозом. Поддерживать асептики, используя стерильные инструменты.
3. Сделайте продольный разрез кожи по средней линии кожи головы. Снимите соединительную ткань, чтобы достичь правильной экспозиции черепа.
4. Осторожно, просверлить небольшие отверстия заусенцев вручную с помощью микро ручная дрель на 7 мм за темя и 3 мм сбоку от средней линии.
5. Имплантаты винтовые электроды через череп в коре головного мозга (область 17), проникающие в кору на глубину около 0,5 мм. Имплантат опорный винт электрода на мм ростральной средней линии 3 к темени. Применить зубной цемент накрыть и исправить винты (не всегда обязательно).
6. Шовный кожу головы, управлять мазь с антибиотиком на кожу и позволяют животному ReCoвер от наркоза на потепление площадку.
   Примечание: В качестве альтернативы, электроды могут быть оставлены открытыми, так, чтобы кожа не должны быть возобновлено в каждой записи. Сразу же после прекращения операции, но до анестетика восстановления, управлять нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) (если не вводят до операции) или опиоидного анальгетика. не Монитор животных постоянно до полного восстановления от анестетика и полностью амбулаторно.
7. Позвольте по крайней мере 1 неделю животные, чтобы оправиться от операции до записи ВЭП.

2. Зрительный нерв впрыска

1. Обезболить животное, подготовить кожу и применять драпировки, как описано выше (1,1 и 1,2).
2. Сделайте 1 до 1,5 см разрез в приведенном выше орбиты случайно выбранных кожей вокруг глаз. Откройте подкожной ткани, чтобы достичь орбитального полость, используя тонкие ножницы радужной оболочки глаза. Откройте конъюнктиву и передней капсулы шип под операционным микроскопом.
3. Уберите экстраокулярноймышцы и intraobital слезных желез подвергать примерно 3 мм длины зрительного нерва. Откройте Dura и паутинной материи слои вокруг зрительного нерва в продольном направлении с помощью глазной лезвие.
4. Вставьте стеклянную пипетку в зрительном нерве на расстоянии 2 мм кзади от шара. Стекло микропипетки крепится с помощью шприца Гамильтона.
5. Вводят 1% лизолецитин (0,4 - 1,0 мкл, 0,02% голубой Эванса, который не имеет воздействия на миелинизации) медленно в нерве приблизительно в течение 30 секунд.
6. Шовный разрез кожи. Применить мазь с антибиотиком, чтобы предотвратить инфекцию. Попутчики глаза могут быть поданы как внутреннего контроля для электрофизиологии записей.
7. Поместите животных на площадку потепления, чтобы оправиться от наркоза.

3. Запись ВЭП

1. Обезболить животное и подготовить кожу 1.1 и 1.2.
   Примечание: более низкие дозы анестетиков могут быть использованы для электрофизиологического RECOВИДЕОЗАПИСЬ (кетамин 40 мг / кг и медетомидин 0,25 мг / кг).
2. Поместите крысу в темной комнате и дайте ему адаптироваться к темноте в течение 5 - 30 мин. В некоторых случаях крысы могут быть соответственно адаптируются к темноте O / N для скотопического или света, адаптированной для дневного ЗВП записей ^8.
3. Поддержание температуры тела при 37 ± 0,5 ° С по homoeothermic системы офсетного с ректального термометра зонда.
4. Разбавить учеников с 1,0% тропикамид глазные капли. Откройте кожу над черепом, чтобы получить доступ к предварительно помещают в точке винтовых электродов.
5. Подключите болт на противоположной зрительной коры вынужденного глаза и опорного винта к усилителю. Вставка игольчатым электродом в хвост, как на землю. Измерьте и поддерживать импеданса электрода ниже 5 кОм.
6. Поместите мини-Ganzfeld стимулятор непосредственно на кожу вокруг век, чтобы обеспечить превосходную изоляцию глаз ^7. Освещение стимулятора необходимо калибровать заранеепо фотометр.
7. Доставка фотостимуляция через световых вспышек в 100 раз при частоте 1 Гц, с низким и высоких настройках полосовой фильтр на 1 и 100 Гц, соответственно. Частота дискретизации сигнала на 5 кГц.
   Примечание: сигналы должны быть выбраны по крайней мере, около 250 - 300 Гц, чтобы гарантировать, что более, что два образца, собранные в ходе каждого цикла.
8. Шовный кожу назад и держать животных на площадку потепления, чтобы оправиться от наркоза. Запись может быть повторно записана на отдельных животных, чтобы контролировать функциональные изменения в течение определенного периода времени.
9. В конечной точке, управлять передозировки инъекции пентобарбитона натрия (100 мг / кг, внутрибрюшинно), чтобы усыпить животное. Подтвердите эвтаназию по сердца, остановка дыхания и снижения температуры тела.

4. Подготовка ткани и гистологии

1. Удалить зрительные нервы от эвтаназии животных под микроскопом и фиксировать ткани в 1% параформальдегидом O / N.
2. Вымойте ткань тщательно физиологическим раствором. Лечить ткани в автоматическом процессора ткани и вставлять в парафин. Срезанные секции (5 - 10 мкм) с использованием роторного микротома.
   Примечание: Для иммуногистохимического исследования, исправить ткани в 1% параформальдегида, промывают солевым раствором и инкубировать с 30% сахарозы O / N. Вставить ткани в ОСТ вложение среды и сделать криосрезы помощью криостата.
3. Инкубируйте разделы в 0,1% растворе быстрого голубого, такие как Luxol (в 95% этаноле) O / N при 56 ° С. Различают разделы в 0,05% карбоната лития в течение 30 сек, а затем 70% -ным этанолом в течение еще 30 сек. Наконец, контрастное в 0,1% -ном растворе крезил фиолетовым в течение 30 сек перед установкой секций. Используйте быстрый синий окрашивание для выявления миелин в зрительном нерве ^5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Воспроизводимые Сессионные ЗВП следы показано на рисунке 1, и значительная задержка в N1 ожидания можно увидеть после зрительного нерва инъекции. Частичные зрительного нерва поражений демиелинизации можно наблюдать на гистологических срезах с помощью Luxol быстрый синий окраш?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129