הקלטת פוטנציאל עוררה חזותית במודל עכברוש של demyelination עצב אופטי הניסויי

Summary

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Abstract

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Introduction

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הנהלים הקשורים בעלי חיים נערכו בהתאם לקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול והשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות וההנחיות של הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מאוניברסיטת Macquarie.

1. VEP אלקטרודה השרשה

1. להרדים את החיה עם זריקת intraperitoneal של קטמין (75 מ"ג / קילוגרם) וmedetomidine (0.5 מ"ג / קילוגרם).
   שים לב: בעקבות אינדוקציה של הרדמה, להתבונן רפלקסים נסיגה (מבחן קמצוץ, רפלקס מצמוץ וpalpebral, וכו ') והיעדרם כאינדיקציה לניתוח מתחילה. הרף לפקח בעלי החיים במהלך הניתוח ולנהל תרופה נוספת הרדמה (10% ממינון קטמין הראשוני לעליון למעלה) אם רפלקסים נמצאים. חולדות בוגרות (> 12 שבועות) משמשות בניסויים.
2. לגלח את העור של אזור הניתוח.מניחים את החיה על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת גוף במהלך הניתוח. להכין את העור באמצעות יישום מקומי של povidone- יוד. החל כורך כירורגית. החל משחת עיניים אקטואלי למנוע יובש בקרנית בהרדמה כללית. לשמור asepsis ידי שימוש במכשירים סטריליים.
3. לעשות חתך בעור אורך על קו האמצע של עור הראש. נקה את רקמת חיבור כדי להשיג חשיפה טובה של הגולגולת.
4. זהירות, לקדוח חורים בר קטנים באמצעות מקדח יד מיקרו באופן ידני בשעה 7 מ"מ מאחורי גבחת ו -3 מ"מ לרוחב קו האמצע.
5. אלקטרודות שתל בורג דרך הגולגולת לקליפת המוח (אזור 17), חודר הקליפה עד לעומק של כ -0.5 מ"מ. שתל אלקטרודה בורג התייחסות בקו האמצע מקורי מ"מ 3 לגבחת. החל מלט שיניים ללשים בארגז ולתקן את הברגים (לא תמיד חובה).
6. לתפור את העור של הראש, לנהל משחה אנטיביוטית על העור ומאפשר לבעלי החיים לRecoVer מהרדמה על כרית חימום.
   הערה: לחלופין, ניתן להשאיר חשופות אלקטרודות, כך עור שלא צריך להיות מחדש בכל הקלטה. מייד עם ההפסקה של ניתוח, אבל לפני התאוששות הרדמה, לנהל תרופה שאינה סטרואידים אנטי דלקתית (NSAID) (אם לא מנוהל מראש אופרטיבי) או משככי כאבים אופיואידים. צג בעלי החיים כל הזמן עד להחלמה מלאה מההרדמה ואמבולטורי באופן מלא.
7. הרשה שבוע לבעלי החיים להתאושש מהניתוח לפני הקלטת VEP לפחות 1.

2. הזרקת עצב הראייה

1. להרדים את החיה, להכין את העור ולהחיל כורך כאמור לעיל (1.1 ו -1.2).
2. לעשות חתך 1 ל -1.5 סנטימטר בעור מעל המסלול של עין שנבחרה באקראי. פתח את הרקמה התת עורית להגיע חלל מסלולית באמצעות מספריים איריס בסדר. פתח את הלחמית וקדמית הכמוסה של שֶׁגֶם מתחת למיקרוסקופ ההפעלה.
3. לחזור extraocularשרירים ובלוטות דמעות intraobital לחשוף אורך מ"מ כ 3 של עצב הראייה. פתח את שכבות דורה ועניין הארכניאיד סביב עצב הראייה longitudinally באמצעות להב עיניים.
4. הכנס את פיפטה הזכוכית לעצב הראייה במרחק של 2 מ"מ אחורי לגלובוס. Micropipette הזכוכית מחובר למזרק המילטון.
5. הזרק lysolecithin 1% (0.4 - 1.0 מיקרוליטר, עם 0.02% הכחול של אוון שאין לי השפעות על myelination) לאט לתוך העצב על פני תקופה של 30 שניות בערך.
6. לתפור את החתך בעור. החל משחה אנטיביוטית למניעת זיהום. יכולות להיות מוגשות עיני בחור כמו בקרות פנימיות להקלטות אלקטרופיזיולוגיה.
7. מניחים את בעלי החיים על כרית חימום להתאושש מהרדמה.

3. VEP הקלטה

1. להרדים את החיה ולהכין את העור כמו 1.1 ו -1.2.
   הערה: במינון נמוך יותר של חומרי הרדמה יכול לשמש לReco אלקטרוrding (40 מ"ג / קילוגרם קטמין וmedetomidine 0.25 מ"ג / קילוגרם).
2. מניחים את החולדה בחדר חשוך ולאפשר לו להסתגל לחשכה במשך 5 - 30 דקות. במקרים מסוימים חולדות יכולות להיות בהתאמה O הכהה מותאם / N לscotopic או אור מותאם להקלטות VEP photopic ^8.
3. לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס על ידי שמיכת מערכת homoeothermic עם בדיקה מדחום רקטלי.
4. להרחיב את התלמידים עם טיפות עיני tropicamide 1.0%. פתח את העור מעל הגולגולת לגשת באלקטרודות בורג אתר-הונח מראש.
5. חבר את הבורג מעל נגדי קליפת הראייה של העין מגורה ובורג ההתייחסות למגבר. הכנס אלקטרודה מחט לתוך הזנב כקרקע. למדוד ולשמור על עכבת אלקטרודה להלן 5 ק"ג-אוהם.
6. הנח ממריץ מיני Ganzfeld ישירות על העור סביב העפעפיים לספק בידוד עין מעולה ^7. הארת ממריץ צריכה להיות מכוילת מראשעל ידי פוטומטר.
7. לספק גירוי photic באמצעות הבזקי אור פי 100 בתדירות של 1 הרץ, עם הגדרות מסנן להקה עוברת נמוכות וגבוהות של 1 הרץ ו -100, בהתאמה. קצב דגימת האות הוא בשעה 5 kHz.
   הערה: יש שנדגמו אותות לפחות בכ 250-300 הרץ על מנת להבטיח שיותר ששתי דגימות שנאספו במהלך כל מחזור.
8. לתפור את העור בחזרה ולשמור על בעלי החיים על כרית חימום להתאושש מהרדמה. הקלטה ניתן להקליט שוב ​​ושוב על בעלי חיים בודדים לעקוב אחר שינויים פונקציונליים על פני תקופה של זמן.
9. בנקודת הסיום, לנהל הזרקה מנת יתר של pentobarbitone נתרן (100 מ"ג / קילוגרם, IP) להרדימו. לאשר המתת חסד על ידי דום לב, דום נשימה וירידה של טמפרטורת גוף.

4. רקמות הכנה והיסטולוגיה

1. הסר את עצבי ראייה מבעלי חיים מומתים מתחת למיקרוסקופ ולתקן הרקמות ב1% O paraformaldehyde / N.
2. לשטוף את הרקמה ביסודיות עם מי מלח. פנק את הרקמות במעבד רקמות אוטומטיות ולהטביע בפרפין. חלקים חתוכים (5 - 10 מיקרומטר) באמצעות microtome סיבובי.
   הערה: מחקר אימונוהיסטוכימיה, לתקן רקמות בparaformaldehyde 1%, לשטוף עם מי מלח ודגירה עם 30% O סוכרוז / N. רקמת שבץ ב אוקטובר הטבעה בינונית ולעשות cryosections באמצעות cryostat.
3. סעיפי דגירה בפתרון 0.1% כחולים מהיר כגון Luxol O (באתנול 95%) / N ב 56 מעלות צלזיוס. להבדיל הסעיפים ב0.05% ליתיום קרבונט למשך 30 שניות ולאחר מכן אתנול 70% למשך 30 שניות נוספות. לבסוף, counterstain 0.1% בפתרון סגול cresyl למשך 30 שניות לפני ההרכבה החלקים. השתמש בכתמים הכחולים מהירים לזהות המיאלין בעצב הראייה ^5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

עקבות VEP התוך sessional שחזור מוצגות באיור 1 ועיכוב משמעותי בהשהית N1 ניתן לראות לאחר הזרקת עצב הראייה. נגעי עצב ראייה חלקיים של demyelination ניתן לצפות בקטעים היסטולוגית באמצעות מכתים הכחול מהיר Luxol ^5. איור 2 מראה קטע נציג עם נגע demyelinated מוקדי קטן במרכז של ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129