Deneysel Optik Sinir demyelinizasyon bir Rat Modelinde Görsel Uyarılmış Potansiyel Kayıt

Özet

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Özet

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Giriş

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Protokol

Etik Beyanı: hayvanlarla ilgili tüm işlemler Bakım ve Bilimsel Amaçlarla Hayvanların Kullanımı ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Tablosu kılavuzlar için Uygulama Avustralyalı Kanunu'na göre yapılmıştır ve ile kabul edildi Macquarie Üniversitesi Hayvan Etik Kurul.

1. VEP Elektrot İmplantasyonu

1. Bir intraperitonal ketamin enjeksiyonu (75 mg / kg) ve medetomidin (0.5 mg / kg) ile hayvan anestezisi.
   Anestezi indüksiyonu takiben ameliyat başlamak için bir gösterge olarak çekilme refleksler (tutam testi, korneal ve palpebral refleks, vb) ve bunların yokluğu dikkat: Not. Sürekli ameliyat boyunca hayvanları izlemek ve refleksleri varsa ek anestezik ilaç (kontör başına ilk ketamin dozunun% 10) yönetmek. Yetişkin sıçanlarda (> 12 haftalık) deneylerde kullanılır.
2. Cerrahi alanın cildi tıraş.Ameliyat sırasında vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için bir ısıtma pedi (37 ° C) hayvan yerleştirin. Povidon-iyot topikal uygulama sayesinde cildi hazırlayın. Cerrahi dökümlü uygulayın. Genel anestezi altında kornea kuruluğunu önlemek için topikal oftalmik merhem sürün. Steril aletler kullanarak asepsi koruyun.
3. Kafa derisinin orta hat üzerinde uzunlamasına bir cilt kesi olun. Kafatasının iyi pozlama elde etmek için bağ dokusu temizleyin.
4. Dikkatle, el bregma arkasında 7 mm ve orta hatta 3 mm yanal bir mikro el matkabı kullanarak küçük çapak delik.
5. Yaklaşık 0.5 mm'lik bir derinliğe kadar korteksi penetre korteks (bölge 17) içerisine kafatası yoluyla implant vidalı elektrotlar. Bregma orta hat, 3 mm rostral bir referans vida elektrot implante. Vidaları örtmek ve düzeltmek için diş çimento uygulayın (her zaman gerekli değildir).
6. Reco hayvan, baş derisini dikin cilde antibiyotik merhem yönetmek ve izinver bir ısınma pad üzerinde anesteziden.
   Not: Alternatif olarak, elektrotlar maruz sol olabilir, bu cilt, her kayıt yeniden açılması gerekmez böylece. Ameliyattan hemen ancak önceden anestezi kurtarma kesilmesiyle, bir steroid olmayan anti-enflamatuar ilaç (NSAID), (eğer Ameliyat öncesi tatbik) veya bir opioid analjezik uygulayın. Anestezi ve tamamen ayaktan tam iyileşme kadar sürekli hayvanların izleyin.
7. Hayvanlar ameliyat öncesi VEP kayıt kurtarmak için en az 1 hafta izin verin.

2. Optik Sinir Enjeksiyon

1. , Hayvan anestezisi cildi hazırlar ve (1.1 ve 1.2) yukarıdaki gibi dökümlü uygulayın.
2. Rasgele seçilen bir göz yörüngede üzerinde deri bir 1- 1.5 cm kesi olun. İnce iris makas kullanarak yörünge boşluğuna ulaşmak için deri altı doku açın. Konjonktiva açın ve işletim mikroskop altında Tenon kapsülü anterior.
3. Ekstraokuler geri çekinkas ve intraobital gözyaşı bezleri optik sinirin yaklaşık 3 mm uzunluk ortaya çıkarmak. Uzunlamasına bir göz bıçak kullanarak optik sinir etrafında dura ve araknoid madde katmanları açın.
4. Dünyanın 2 mm'lik posterior mesafeden optik sinir içine cam pipet yerleştirin. cam mikropipet Hamilton şırınga takılır.
5. Yaklaşık 30 saniyelik bir süre boyunca sinir yavaşça - (miyelinasyon üzerinde etkiye sahip değildir% 0.02 Evan Mavisi ile, 1.0 ul 0.4),% 1 lisolesitin enjekte edilir.
6. Cilt kesisi dikin. Enfeksiyonu önlemek için antibiyotik merhem sürün. Fellow gözler elektrofizyoloji kayıtları için iç kontroller olarak servis edilebilir.
7. Anestezi kurtarmak için bir ısınma pad üzerinde hayvanları yerleştirin.

3. VEP Kaydı

1. Hayvan anestezisi ve 1.1 ve 1.2 olarak cildi hazırlar.
   Not: anestetiklerin daha düşük doz elektrofizyolojik reco için kullanılabilirrding (ketamin 40 mg / kg ve 0.25 mg / kg medetomidin).
2. Karanlık bir odada sıçan yerleştirin ve 5 için karanlığa uyum sağlayacak - 30 dakika. Bazı durumlarda fareler sırasıyla Fotopik VEP kayıtları ⁸ için uyarlanmış scotopic veya ışık karanlık adapte O / N olabilir.
3. Rektal termometre probu ile homoeothermic battaniye sistemi tarafından 37 ± 0.5 ° C'de vücut ısısını korumak.
4. % 1.0 tropikamid göz damlaları ile öğrencileri dilate. Erişmek için kafatası üzerindeki deriyi açıp önceden yerleştirilmiş in situ vida elektrotlar.
5. Uyarılmış gözün kontralateral görme korteksine ve amplifikatör referans vida üzerine vidayı takın. Zemin olarak kuyruk içine bir iğne elektrot yerleştirin. Tedbir ve 5 kohm altında elektrot empedansı korumak.
6. Üstün göz izolasyonu ⁷ sağlamak için göz kapaklarının etrafında cilt üzerinde doğrudan bir mini Ganzfeld uyarıcı yerleştirin. stimülatörü aydınlatma önceden kalibre edilmesi gerekirBir fotometre ile.
7. Sırasıyla 1 ve 100 Hz düşük ve yüksek bant-geçiren filtre ayarları ile, 1 Hz frekansta ışığı yanıp aracılığıyla 100 kez fotik uyarımı sunun. Sinyal örnekleme hızı 5 kHz olduğunu.
   Not: Sinyaller, en az yaklaşık 250 örneklenmelidir - en fazla iki numuneler, her döngü sırasında toplanan sağlamak için 300 Hz.
8. Geri cildi dikin ve anestezi kurtarmak için bir ısınma pad üzerinde hayvanları tutmak. Kayıt sürekli bir zaman süresi boyunca, fonksiyonel değişiklikleri izlemek için, ayrı ayrı hayvanlar üzerine kaydedilebilir.
9. Son noktada, hayvan euthanize sodyum pentobarbıton (100 mg / kg, ip) aşırı dozda enjeksiyon uygulayın. Kardiyak arrest, solunum durması ve vücut sıcaklığının düşmesi ile ötenazi onaylayın.

4. Doku hazırlanması ve Histoloji

1. Mikroskop altında ötenazi hayvanlardan optik sinirleri çıkarın ve% 1 paraformaldehid O / N doku çözmek.
2. tuz çözeltisi ile iyice doku yıkayın. Otomatik doku işlemci doku davranın ve parafin embed. Bir döner mikrotom kullanılarak - (10 mikron 5) Kesim bölümleri.
   Not: immünohistokimya çalışması için,% 1 paraformaldehid doku çözmek tuzlu su ile yıkayın ve% 30 sukroz O / N ile kuluçkaya yatmaktadır. Ekim göm doku gömme orta ve Kriyostat kullanarak cryosections yapmak.
3. 56 ° C 'de bu Luxol (% 95 etanol) O / N olarak% 0.1, hızlı mavi çözelti içinde bölümleri inkübe edin. Daha sonra başka bir 30 saniye için% 70 etanol, 30 saniye için% 0.05 lityum karbonat bölümleri ayırt eder ve. Son olarak, bölümler monte etmeden önce 30 saniye için% 0.1 cresyl mor çözeltisi içinde counterstain. Optik sinir ⁵ miyelini tanımlamak için hızlı mavi boyama kullanın.

Sonuçlar

Tekrarlanabilir içi oturumlar VEP izleri Şekil 1'de gösterilmiştir ve N1 gecikme önemli bir gecikme optik sinir enjeksiyonundan sonra görülebilir. Demiyelinizasyonun Kısmi optik sinir lezyonları Luxol hızlı mavi boyama ⁵ ile histolojik kesitlerde görülebilir. 2 optik sinir merkezinde küçük fokal demiyelinize lezyonu olan temsili bir bölümü göstermektedir. Kesit lezyonun toplam hacmi temsil unutmayın. demiyelinize alan üç boyutlu rek...

Tartışmalar

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129