La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

Resumen

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Resumen

El aumento de la demanda de combustibles renovables tiene investigadores que investigan la viabilidad de materias primas alternativas, como las microalgas. Ventajas inherentes incluyen alto potencial de rendimiento, el uso de tierras no cultivables y la integración con los flujos de residuos. Los requisitos de nutrientes de un sistema de producción de microalgas a gran escala requerirán el acoplamiento de los sistemas de cultivo con recursos de los residuos industriales, tales como el dióxido de carbono del gas de combustión y los nutrientes de las aguas residuales. Contaminantes inorgánicos presentes en estos residuos potencialmente pueden conducir a la bioacumulación en la biomasa de microalgas afectar negativamente la productividad y la limitación de su uso final. Este estudio se centra en la evaluación experimental de los efectos y el destino de los 14 contaminantes inorgánicos (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V y Zn) en el crecimiento salina Nannochloropsis . Las microalgas se cultivan en fotobiorreactores iluminados en 984 mol m ^-2 s ^-1 y se mantiene a pH 7 en un crecimiento media contaminado con contaminantes inorgánicos en los niveles esperados en base a la composición que se encuentra en los sistemas de gas de combustión de carbón comerciales. Los contaminantes presentes en la biomasa y el medio al final de un período de 7 días de crecimiento se cuantificaron analíticamente a través de vapor frío espectrometría de absorción atómica para Hg y por medio de ICP-MS para As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V y Zn. Los resultados muestran N. salina es una cepa sensible al entorno multi-metal con una disminución estadística en la biomasa yieldwith la introducción de estos contaminantes. Las técnicas presentadas aquí son adecuados para cuantificar el crecimiento de algas y determinar el destino de los contaminantes inorgánicos.

Introducción

En comparación con los cultivos terrestres tradicionales han demostrado microalgas para lograr altos rendimientos de biomasa y de lípidos debido a las eficiencias inherentes ^1,2 de conversión solar más altos. El cultivo de microalgas a altas tasas de productividad requiere el suministro de varios nutrientes, incluyendo una fuente de carbono externa. Se espera que las instalaciones de crecimiento a gran escala se integrarán con flujos de residuos industriales, tales como gas de combustión industrial con el fin de minimizar los costos de producción y al mismo tiempo proporcionan remediación ambiental. De carbono de residuos industriales es típicamente en forma de dióxido de carbono gaseoso y puede contener contaminantes que tienen el potencial de afectar negativamente a la producción de microalgas. Específicamente, los gases de combustión derivados de carbón tendrá una variedad de contaminantes, incluyendo pero no limitado a los productos de combustión de agua y dióxido de carbono, así como óxidos de azufre y nitrógeno, polvo fino, contaminantes orgánicos, tales como dioxinas y furanos, y con inorgánicacontaminantes como los metales pesados. El impacto de la mayoría de estos contaminantes, incluyendo compuestos inorgánicos con algunos de ellos conocidos como los metales pesados ​​en la productividad de las microalgas no se han explorado. Algunos de estos elementos pueden ser nutrientes en las concentraciones adecuadas, sin embargo a concentraciones más altas pueden producir disfunción de las células e incluso la muerte ^3.

La integración de microalgas con gas de combustión industrial tiene el potencial de introducir directamente los contaminantes inorgánicos en medio de crecimiento. Gas de combustión a base de carbón tiene una variedad de elementos inorgánicos (por ejemplo, As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V y Zn) a diversas concentraciones algunas de las cuales, en baja concentración, representan nutrientes para el crecimiento de microalgas. Contaminantes inorgánicos tienen una alta afinidad para unirse a microalgas y además estar absorbido internamente a través de transportadores de nutrientes. Algunos contaminantes inorgánicos (es decir, Co, Cu, Zn y Mn) son nutrientes que forman parte de enzimas implicand en la fotosíntesis, la respiración y otras funciones ^3,4. Sin embargo, en exceso de metales y metaloides pueden ser tóxicos. Otros elementos, como Pb, Cd, Sn, Sb, Se, As y Hg, no se conocen para apoyar la función celular en cualquier concentración y representar a los metales no nutrientes que podrían afectar negativamente el crecimiento ^3,5,6 cultura. La presencia de cualquiera de estos contaminantes tiene el potencial de producir efectos negativos sobre la función celular de microalgas. Además, la interacción de múltiples metales con microalgas complica la dinámica de crecimiento y tiene el potencial de impactar el crecimiento.

Economía a gran escala han sido directamente vinculados a la productividad del sistema de cultivo ^7-19. Por otra parte, reciclar medio en el sistema de crecimiento de microalgas, ya sea para estanques abiertos de rodadura (ORP) o fotobiorreactores (PBR) es fundamental, ya que representa el 99,9 y el 99,4% de la masa, respectivamente ^20. La presencia de contaminantes inorgánicos en los medios de comunicación en última instancia, podría limitar mproductividad icroalgae y el reciclaje de los medios de comunicación debido a la acumulación de contaminantes. Este estudio determinó experimentalmente el impacto de 14 contaminantes inorgánicos (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V y Zn), en concentraciones esperadas de la integración de los sistemas de cultivo de microalgas con carbón deriva de gases de combustión, en la productividad de N. salina cultiva en PBR transporte aéreo. Los contaminantes utilizados en este estudio se ha demostrado que no sólo estar presente en los gases de combustión a base de carbón, pero los gases de combustión a base de residuos municipales, los gases de combustión biosólidos basada, las aguas residuales municipales, agua producida, deterioro de las aguas subterráneas y el agua de mar ^21-23. Las concentraciones utilizadas en este estudio se basan en lo que se esperaría si los sistemas de crecimiento de microalgas se integraron con una fuente basada en el carbón de CO ₂ con una eficacia demostrada en la captación de los sistemas de derechos de obtentor comerciales ^20. Los cálculos detallados de apoyo las concentraciones de los metales pesados ​​y contaminantes inorgánicos se presentan en Napanet al. se utilizaron ²⁴ técnicas analíticas para entender la distribución de la mayoría de los metales en la biomasa, medios de comunicación y el medio ambiente. Los métodos presentados permitieron la evaluación de la productividad potencial de las microalgas bajo estrés contaminante inorgánico y cuantificación de su destino final.

Protocolo

Sistema 1. Crecimiento

Figura 1. Las microalgas sistema de crecimiento. (A) rotómetro aire, (B) de CO ₂ rotómetro, (C) Regulador del pH con solenoide, (D) registrador de datos, (E) en la línea de filtros de aire, colector de distribución de aire (F), (G) El banco de luz fluorescente, (H) medidores de pH, el sistema (I) de enfriamiento, (J) baño de agua, (K) cable del termopar, (L) fotobiorreactor puente aéreo, (M) calentador, (N) a ras de humos capó, (O) de ventilación, (P) tubo capilar de suministro de aire, (Q) filtros de aire, (R) del tubo de muestreo, (S) tapa de silicona PBR, y (T)así pH en la tapa de silicona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Construir el siguiente sistema de crecimiento de microalgas experimental (Figura 1).
   1. Adquirir doce PBR de transporte aéreo que consisten en tubos de vidrio reactores 4,5 cm de diámetro y 80 cm de altura, con una capacidad de cultivo de 1,1 l con tapa de silicona. Adquirir tubos pre-cortadas capilares de vidrio (5 mm de diámetro externo y 1 mm de diámetro interno) de 10 cm (3 por PBR) y 85 cm (1 por PBR) de longitud.
   2. Congele tapas de silicona en un congelador a -80ºC. Engrasar una broca con glicerol y mientras los párpados están congelados taladro 3 agujeros para alojar los tubos capilares de ventilación, de muestreo y de suministro de gas y 1 agujero de 17 mm de diámetro para acoger una sonda de pH.
   3. Inserte los 3 tubos capilares en su lugar con el tubo más largo que se extiende 2 cm desde la parte inferior de la PBR. En el otro tubo capilar añadir un wi tubo de siliconath un tubo capilar unido al otro extremo que se extiende a un punto de muestreo deseada. Cubra el orificio para el medidor de pH con un tamaño tapón de silicona 21D.
   4. Humedezca el aire ambiente mediante burbujeo a través del agua y entregar el aire húmedo a la cabecera de distribución de aire. Pasar el gas a través de un filtro de 0,2 micras y entregarlo a la suspensión de algas a través del tubo capilar de suministro de vidrio más largo.
   5. Entregar CO comprimido ₂ en la corriente de aire humidificado a fin de mantener un pH neutro de 7,0 ± 0,1 en la suspensión de cultivo. Controlar la velocidad de CO ₂ entrega con un (controlador de pH) sistema dispensario CO ₂ automatizado que se abre un solenoide magnético cuando el cultivo de algas llega a pH 7,1 y se cierra a pH 6,9.
   6. Proporcionar luz utilizando 24 T5 lámparas fluorescentes que producen una iluminación media de 984 mol m ^-2 s ^-1 similar al pico condiciones al aire libre.
   7. Sumerja los derechos de obtentor en un baño de agua con el fin de mantener una temperatura constante de aproximadamente 25 ° C. Controlar la temperatura del sistema mediante el uso de un enfriador de recirculación y un baño de agua de control de la unidad de calentamiento de recirculación automatizado.
   8. Monitor de temperatura y pH en tiempo real y registrar con un registrador de datos.
   9. Asegúrese de que todos los componentes del sistema de crecimiento de microalgas están funcionando correctamente, sobre todo antes de la cosecha de inóculo microalgas o la preparación de contaminantes inorgánicos, ya que no se pueden preservar.

2. Laboratorio de Preparación Ware

1. Lave matraces aforados, PBR, bombonas y los contenedores, con agua corriente y jabón. Enjuague con agua desionizada (DW).
2. Acid enjuagar la vajilla de laboratorio con el fin de eliminar cualquier traza de contaminantes inorgánicos. Esto se puede hacer por uno de dos maneras:
   1. Remoje materiales de laboratorio O / N en 10% de ácido nítrico de grado metales traza (Precaución: No respirar los humos, ácido nítrico concentrado puede producir quemaduras graves y los humos tóxicos, trabajo en un hoo humosd usando guantes de nitrilo, gafas y bata de laboratorio).
   2. Remoje materiales de laboratorio durante 15 minutos en metales traza de ácido nítrico de grado 50%.
   3. Enjuague los utensilios de laboratorio con DW a fondo al menos 3 veces, asegurándose de eliminar todo el ácido. Es fundamental que los derechos de obtentor se enjuagan a fondo, especialmente los tubos de muestreo y los tubos capilares. Si no hace esto producirá la acidificación de la inhibición media y posible de crecimiento. Pruebe el pH del agua de enjuague para verificar todo el ácido se ha eliminado.
   4. Esterilizar PBR, contenedores y los matraces por tratamiento en autoclave de ellos a 120 ° C y presión atmosférica estándar durante al menos 30 min.

3. N. salina Preparación Medio

1. Preparación de la solución A: Llene parcialmente un matraz aforado de 1 L con DW. Inserte una barra de agitación magnética y añadir los productos químicos que se muestran en la Tabla 1, uno tras otro. Asegúrese de que cada ingrediente se disuelve antes de la adición del siguiente componente. Retire el imán y llenar ªe matraz hasta la marca de volumen de 1 L.

Componente	La cantidad a añadir (g)	La concentración final (g / L)
H 3 BO 3	0,900	0,900
Na 2 MoO4 · 2H 2 O	0,012	0,012
MnCl2 · 4H 2 O	0,300	0,300
ZnSO4 · 7H 2 O	0,060	0,060
CuSO 4 · 5H 2 O	0,020	0,020

Tabla 1:. Solución A receta Las cantidades son cantidades necesarias en la preparación de 1 L de solución concentrada.

2. Preparación de solución de vitaminas: En tres vol separadamatraces umetric añaden las vitaminas como se muestra en la Tabla 2. filtrar cada solución de vitaminas a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril a un recipiente estéril. Conservar las vitaminas en -4 ° C en la oscuridad.

Vitaminas	Cantidad (mg)	El volumen final (ml)	Concentración de vitamina final (mg / L)
Biotina	12.22	500	24.43
Vitamina B12	13.50	100	135.00
Clorhidrato de tiamina	977.63	500	1,955.27

Tabla 2:. Solución receta vitamina Las cantidades son cantidades necesarias para la preparación de concentrado Solución.

3. Llene parcialmente un recipiente autoclave 20 L con DW e insertar una barra de agitación magnética. Coloque el recipiente en la parte superior de una placa de agitador magnético y añadir los productos químicos que se muestran en la Tabla 3 (excepto las vitaminas), la adición de ellos uno tras otro y después de cada disuelve completamente. Llene el recipiente para llegar a 20 L.

Componente	La cantidad a añadir a medio	Unidad
NaCl	350.00	g
CaCl 2 · 2H 2 O	3.00	g
KCl	9.60	g
Na 2 SiO 3 · 9H 2 O	1.14	g
MgSO 4 · 7H 2 O	29.60	g
KNO3	20.40	g
KH 2 PO 4	1.36	g
Citrato férrico de amonio	0.10	g
Solución A	20.00	ml
Solución de biotina *	818.00	l
Solución de vitamina B12 *	296.20	l
Solución de clorhidrato de tiamina *	521.60	l
* Añadir a los medios de comunicación en autoclave enfriado

Tabla 3: N. salina medio receta. Las cantidades son cantidades necesarias en la preparación de 20 L de medio rico en nutrientes.

4. Esterilizar el medio en autoclave durante 30 min a 120 ° C y presión atmosférica. Deje que la coo mediol a RT.
5. Coloque el recipiente en un plato agitador magnético. Añadir las vitaminas preparadas en el paso 3.2 y dejar que la mezcla de medio fondo.

4. Contaminantes inorgánicos preparación social

1. Llene parcialmente los matraces volumétricos indicados en la Tabla 4 con DW y añadir la sal persona indicada. Rellenar con DW hasta el volumen final requerido y mezclar bien. No conservar estas poblaciones, ya que algunos elementos se adsorben al matraz paredes
   PRECAUCIÓN: Varios contaminantes inorgánicos utilizados en este protocolo son cancerígenos, teratogénicos y mutagénicos, usar una mascarilla, guantes y bata de laboratorio al manipular sales.

Analito	Fuente de Salt	El volumen de acciones para preparar (L)	Sal al añadir al matraz60; (Sal de mg)	Concentración de analito añadido a la cultura (analito mg / L)
Como	NaAsO 2	0.1	14.8	7.74E-02
CD	CdCl2	0.5	13.5	1.50E-02
Co	CoCl 2 .6H 2 O	0.5	34.7	1.56E-02
Cr	Na 2 Cr 2 O 7 · 2H 2 O	0.1	40.6	1.29E-01
Cu	CuCl 2 • 2H 2 O	0.1	38.3	1.30E-01
Hg	HgCl2	1.0	14.6	9.80E-03
Minnesota	MnCl2 .4H 2 O	0.1	58.8	1.49E-01
Ni	NiCl 2 .6H 2 O	0.1	112.0	2.51E-01
Pb	PbCl2	0.5	39.9	5.41E-02
Sb	Sb 2 O 3	0.5	26.7	4.06E-02
Se	Na 2 3 SEO	0.5	11.8	9.80E-03
Sn	SnCl2 .2H 2 O	0.5	3.9	3.76E-03
V	V 2 O 5	0.1	22.2	1.13E-01
Zn	ZnCl 2	0.1	99.9	4.36E-01

Tabla 4:. Inorgánico preparación contaminantes madre concentradas adición de 1 ml de este caldo concentrado al medio de PBR 1,1 L produce la concentración final se muestra en la última columna.

2. Esterilizar las existencias de contaminantes inorgánicos pasando la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril y recoger el filtrado en un tubo estéril.

5. N. salina inóculo Producción

1. En un matraz Erlenmeyer de 500 ml añadir 200 ml de medio preparado en el paso 3 y luego añadir 3 g de agar. Tapar el matraz con papel de aluminio y autoclave durante 20 minutos a 120 ° C. Vierta la solución en placas petri estériles y dejar enfriar hasta que solidifique. Esto debe ser completado sea una campana estéril o al menos cerca de una llama en un ambiente limpio para reducir el riesgo de contaminación.
2. N. Streak células salina en petri-dis estérileshes preparado en el paso 5.1 usando un bucle de siembra estéril. Coloque las culturas-petri plato en una mesa iluminada con luces T12 mantenidos a temperatura ambiente. Deje microalgas crecen hasta colonias son visibles.
3. Colonias de transferencia de estériles desconcertados matraces Erlenmeyer conteniendo 200 ml de medio rico en nutrientes preparados en el paso 3 y mantenerlos en una mesa vibratoria iluminado (1000 RPM). Deje que la cultura crezca hasta el medio se vuelve verde.
4. Transferir el microalgas a un 1.1 L PBR estéril. Coloque el PBR en un baño de agua inóculo iluminado por 200 mol m ^-2 s ^-1 con luces fluorescentes T8 y se mantiene a 23 ° C por un enfriador de recirculación y un control del baño de agua de calefacción con recirculación automática. Ajuste el aire y CO ₂ rotómetros a 2.5 L min ^-1 y 25 cc min ^-1, respectivamente.
5. Después de una semana de la biomasa dividida crecimiento en nuevos derechos de obtentor 1 0.1 L que contienen nuevo medio y se deja crecer hasta un total de al menos 28 g de peso seco de biomasa seobtenido entre los dos reactores que se pueden determinar a través de la densidad óptica.
6. Cosecha de la biomasa inóculo por centrifugación a 2054 × g durante 15 min a 10 ° C utilizando botellas de centrífuga estériles y técnicas estériles para evitar la contaminación. Deseche el sobrenadante y continuar concentración celular, según sea necesario.
7. Una vez que toda la biomasa se centrifuga, volver a suspender las células en 300 ml de medio estéril fresco.
8. Diluir 0,1 ml de cultivo de microalgas en 3 ml de DW y luego diluir 0,1 ml de esta nueva solución en 3 ml de DW. Asegúrese de que la muestra se mezcla a fondo. Medir la densidad óptica (OD) del concentrado de microalgas a 750 nm () inmediatamente usando un espectrofotómetro.
9. Utilizar la ecuación (1) para determinar la cantidad de biomasa en el concentrado.
   Nota: La ecuación (1) se obtuvo a partir de la regresión lineal entre la frente de sólidos suspendidos totales (en g / L ^-1) para N. Salina (R ² = 0,9995). La ecuación 1 fue desarrollado para la Spectrophotometer modelo en la Tabla de Materiales, generar una nueva calibración si se utiliza otro modelo espectrofotómetro.
   1. Utilizando la ecuación (2) calcular el volumen de concentrado de microalgas (en L) necesaria para obtener una densidad de 4 g / L ^-1 cultura en un PBR de 1,1 L de volumen (en L).

10. Usando técnicas estériles, añadir el volumen de concentrado de microalgas encuentra en la etapa de 5,9 a un PBR autoclave para llegar a una densidad de cultivo inicial de 4 g / L ^-1. Rellene PBR con medio de 1,1 L. Repita este paso hasta que se inoculan 6 PBR. Coloque los derechos de obtentor en el baño de agua inóculo.
11. Deje que las microalgas en los derechos de obtentor crecer durante 8 días y luego cosechar la biomasa (repitiendo los pasos 5.6 a 5.7). Repita el paso 5.8 para calcular el inicialvolumen de inóculo para una densidad de cultivo inicial de 1 g / L ^-1.

6. Reactores Experimentales

1. Usando técnicas estériles, añada aproximadamente 1 L de medio preparado en el paso 3 para cada uno de los 12 PBRs estériles ácido enjuagado. Coloque los derechos de obtentor en el baño de agua del sistema de crecimiento experimental. Girar aire de burbujeo en al 1,5 L min ^-1.
2. Esterilizar un medidor de pH calibrado por la limpieza con etanol al 70%. Medir el pH del medio en el PBR y asegúrese de pH es de aproximadamente 7,0; si no es así, repita el paso 2 para eliminar el ácido lixiviado desde la etapa de aclarado ácido.
3. Calibrar cada controlador de pH usando tampón pH 7, desinfectar las sondas uso de etanol (70%) y luego insertarlos en las tapas de PBR.
4. Para cada PBR (excepto los derechos de obtentor de control) añadir 1 ml de cada una de las poblaciones estériles contaminantes inorgánicos preparados en el paso 4. Deje que los contaminantes se mezclan a fondo en el PBR. La concentración final de los contaminantes inorgánicos en los derechos de obtentor son espectáculon en la última columna de la Tabla 4, y son las concentraciones máximas estimadas que se espera de una integración de carbón planta de energía.
5. Añadir 14 ml de DW estéril para los derechos de obtentor de control.
6. Añadir el inóculo microalgas concentrada obtenida en el paso 5.11 a los derechos de obtentor experimentales con el fin de obtener una densidad de cultivo inicial de 1 g / L ^-1. Deja que la mezcla de biomasa a fondo.
7. Encienda las luces altas de intensidad de luz (de 984 mol m ^-2 s ^-1) y controladores de pH y ajuste de CO ₂ a 30 cc min ^1. Aumenta el flujo de CO ₂ a 50 cc min ^-1 desde el día 3 después. Baja tasa inicial de flujo de CO ₂ es crítico con el fin de evitar grandes cambios en el pH debido a retrasos en / transferencia de líquidos de gas y la medición del pH.
8. Medir y tomar muestras cuando sea necesario. Asegúrese de marcar el nivel del agua después del muestreo. (PRECAUCIÓN: algunos contaminantes inorgánicos en la PBR son cancerígenos, teratogénicos y mutagénicos, guantes de uso y CAPPcontenedores ed al manipular muestras).
9. Añadir estéril DW diario a los derechos de obtentor con el fin de compensar las pérdidas debidas a la evaporación.
10. Después de 7 días de crecimiento, la cosecha de la biomasa por centrifugación a 9936 × g y preservar tanto, la biomasa y el medio sobrenadante, a -80 ° C.
11. Congele secar la biomasa en 0,1 mbar y -50 ° CO / N. Polvo de la biomasa (use una espátula para la biomasa en polvo en el interior del tubo de centrífuga). Preservar congelación biomasa seca a -80 ° C.

7. asistida por microondas La digestión de muestras

Se requiere que la digestión de las muestras de biomasa como una etapa de pre-procesamiento para el análisis de ICP-MS.
Nota: Estos pasos utilizan un sistema de digestión por microondas recipiente cerrado con alivio de presión controlada. (PRECAUCIÓN: Altas presiones desarrollan durante la digestión ácida, inspeccionan la integridad física de los recipientes de digestión y escudos, y remodelar las tapas de los vasos de digestión de microondas antes de cada uso).

1. Lavado de teflón recipientes de digestión de microondas con agua y jabón, enjuague con DW y dejar vasos secar al aire. Para eliminar la contaminación por metales traza en los vasos digerir ácido como se describe en los siguientes pasos.
2. Cambiar la forma de las tapas de los vasos de digestión de microondas y cerrar los frascos herméticamente.
3. Añadir 10 ml de ácido nítrico para cada uno.
4. Introducir el buque en el escudo de seguridad. Asegúrese de que no biomasa, agua o cualquier reactivos se dejan en las paredes de la protección de seguridad o en las paredes exteriores de los recipientes de digestión con el fin de evitar daños en el escudo de seguridad. Tape el escudo de seguridad con la válvula de seguridad asegurarse de la primavera en el vial quede al ras. Busque el escudo en el rotor con los respiraderos capitalización apuntando hacia el exterior en la fila exterior y hacia el interior de la fila interior.
5. En recipiente de número uno, inserte el tubo protector de cerámica y el sensor de temperatura. Este termómetro monitoriza la temperatura interna real en el vial y sirve como el parámetro de control para ejecutar el progr digestiónam. Asegúrese de que el vial número uno contiene las mismas cantidades de muestra y reactivo que los otros viales.
6. Introduzca los parámetros de digestión muestran en la Tabla 5 y comenzar la digestión. Cuando el programa ha terminado, aire enfríe los viales hasta que alcancen la temperatura ambiente.

Paso	Los viales de enjuague			La digestión de la muestra
	Temperatura (° C)	Tiempo (min)	Max. potencia (W)	Temperatura (° C)	Tiempo (min)	Max. potencia (W)
1	RT a 190	25	1000	RT a 180	15	1000
2	190	10	1000	180	15	1000
Escape	-	20	-	-	20	-

Tabla 5: Parámetros utilizados en el programa de digestión por microondas.

7. Dentro de una campana de humos, inserte la herramienta de alivio de presión en la tapa de escudo con las rejillas de capitalización apuntan lejos de ti. Una vez que la presión se libera abierta la tapa (PRECAUCIÓN: viales digeridos siempre abiertos dentro campana de humos desde la digestión de biomasa utilizando ácido produce humos tóxicos).
8. Deshágase del ácido. Enjuague los recipientes de teflón con DW 3 veces. Deje secar al aire viales.
9. Para digerir la biomasa, se añaden 50 mg de biomasa liofilizada para recipientes de digestión de microondas. Para el control de calidad (QC) preparar los siguientes viales: en dos viales de diferentes añadir ya sea 5 ml de Nivel 7 ICPMS o 5 ml de Nivel estándar 7 Hg CVAAS preparado en los pasos 9.1 y 10.1 (la solución digerido de este vial se llama el laboratorio fortificada blanco (LFB)), deje otra (la solución digerida vacío vialde este vial se llama el reactivo de laboratorio en blanco (LRB)).
10. Para digerir medio, agregue 10 ml de medio sobrenadante secar ácido enjuagados recipientes de digestión de microondas. Para el control de calidad (QC) preparar los siguientes viales: En dos viales diferentes añadir 5 ml de Nivel 7 ICPMS o estándar de metal CVAAS preparados en el paso 9.1 y 10.1 (la solución digerida de este vial se llama la LFB), a otro vial añadir 10 ml de DW (la solución digerido de este vial se llama el LRB).
11. Cambiar la forma de las tapas de los vasos de digestión de microondas y cerrar los frascos herméticamente.
12. Añadir 7 ml de ácido nítrico de grado de metal traza concentrado y 3 ml de peróxido de hidrógeno a cada vial. Homogeneizar el contenido girando suavemente la solución. Digerir el contenido de los viales repitiendo los pasos 7.4 a 7.7 (utilizar los parámetros de digestión de microondas para la digestión de la muestra en la Tabla 5).
13. Añadir muestra digerida a un matraz aforado de 25 ml, enjuagando los vasos con DW para una mayor recuperación. Llenar el matraz aforado con DWa la marca.
14. Transferencia digerido muestras a un recipiente tapado. Preservar muestras a 4 ° C hasta su análisis se puede completar. Para este análisis del estudio se hace el mismo día de Hg y el plazo de tres días para los otros elementos.

8. Control de Calidad (QC) Muestras

Nota: Analizar las muestras de control de calidad con el fin de asegurar la fiabilidad de los resultados de las muestras experimentales.

1. Llene parcialmente un ácido enjuagados matraz aforado de 1 l con DW. Añadir 280 ml de ácido nítrico de grado metales traza concentrado y mezclar bien (esta solución también se llama la solución en blanco) (PRECAUCIÓN: añadir siempre el ácido al agua, nunca agregue agua al ácido como la reacción exotérmica puede ser violento). Deje la solución se enfría hasta TA.
2. Además de las muestras de control de calidad elaborados en los pasos 7.9 y 7.10, se preparan las siguientes muestras de control de calidad.
   1. Por la continua verificación de la calibración (CCV): Llenar un tubo de poliestireno con el estándar de calibración (para la preparación véasepaso 9.2 y 10.1). Ponga la solución estándar de Hg en el estante CVAAS y los ICPMS solución estándar en el muestreador automático ICPMS.
   2. Para la calibración continua en blanco (CCB): Llenar dos tubos de poliestireno (16 ml) con el espacio en blanco (solución preparada en el paso 8.1). Coloque una muestra en el rack CVAAS y la otra muestra en el inyector automático ICPMS.
   3. Para la matriz de laboratorio fortificado (LFM): elegir aleatoriamente 1 muestra de cada 12 muestras para cada tipo de muestra (es decir, la biomasa o medio) y lo utilizan para preparar un LFM. Para ICPMS, añadir 0,5 ml de ICPMS Nivel estándar 7 y 3 ml de muestra experimental digerido (ya sea de la biomasa o medio) a un tubo de poliestireno.
   4. Mezcle el contenido y colocar los viales en el inyector automático ICPMS. Para CVAAS, añadir 2 ml Hg Nivel estándar de 7 y 6 ml de la muestra experimental digerido (de la biomasa o en medio) a un tubo de poliestireno. Mezcle el contenido y lugar viales en el estante CVAAS.
   5. Para las muestras duplicadas: elegir aleatoriamente 1 muestra de siemprey 12 muestras para cada tipo de matriz (por ejemplo, biomasa, medio, LFM o cualquier matriz diluida) y duplicar el vial. Colocar los viales repetidas en el inyector automático ICPMS o el rack CVAAS.
   6. Para las muestras duplicadas: elegir aleatoriamente 1 muestra de cada 12 muestras para cada tipo de matriz (por ejemplo, biomasa, medio, LFM o cualquier matriz diluida) y duplicar el vial. Colocar los viales repetidas en el inyector automático ICPMS o el rack CVAAS.
3. Definir los criterios de calidad de datos para el estudio. Para el presente estudio duplicar los criterios de calidad establecidos por Eaton, CLESCERI, Rice y Greenberg ^25. Los parámetros establecidos para el control de calidad son: la diferencia de porcentaje (% D) para CCV dentro de ± 10% ²⁵ (con excepción del Pb y Sb, véase el debate), porcentaje de recuperación LFB (% R) dentro de ± 70 a 130% ^25, por ciento LFM recuperación (% R) dentro de 75 a 125% ^25, y el porcentaje de diferencia relativa (RPD) de ± 20% ^25, y una ca continualibración en blanco (CCB) por debajo del límite de informes método (LMR) ^25. Ver las ecuaciones de cálculo en el paso 9.7.

9. Cuantificación por plasma acoplado inductivamente espectrometría de masas (ICP-MS)

1. En el día del análisis, transferir aproximadamente 5 ml de muestra digerida a tubos de poliestireno y colocarlos en el inyector automático ICPMS. Añadir aproximadamente 15 ml de muestras digeridas a tubos de poliestireno y colocarlos en el bastidor CVAAS.
2. El mismo día del análisis preparar los estándares de calibración. Añadir ICPMS comprados solución estándar y rellene con blanco (solución preparada en el paso 8.1) como se describe en la Tabla 6 (ver descripción solución estándar en la tabla de materiales) a matraces volumétricos de ácido enjuagados.

Parámetro	Nivel 1	Nivel 2	Nivel 3	Nivel 4	Nivel 5	Nivel 6	Nivel 7
Norma Comprado a añadir (ml)	-	-	-	-	-	-	10.0
Nivel 7 a añadir (ml)	0.0	1.0	2.5	5.0	20.0	25.0	-
El volumen final * (ml)	-	50.0	50.0	50.0	100.0	50.0	100.0
La concentración final (mg / L)
75 Como	0.0	2.0	5.0	10.0	20.0	50.0	1000.0
111 Cd	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25.0	50.0
59 Co	0.0	10.0	25.0	50.0	100.0	250.0	500.0
52 Cr	0.0	2.0	5.0	10.0	20.0	50.0	100.0
63 Cu	0.0	5.0	12.5	25.0	50.0	125.0	250.0
55 Mn	0.0	3.0	7.5	15.0	30.0	75.0	150.0
60 Ni	0.0	8.0	20.0	40.0	80.0	200.0	400.0
208 Pb	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25.0	50.0
121 Sb	0.0	12.0	30.0	60.0	120.0	300.0	600.0
51 V	0.0	10.0	25.0	50.0	100.0	250.0	500.0
66 Zn	0,0	4.0	10.0	20.0	40.0	100.0	200.0
* Lograr este volumen mediante la adición de la solución preparada en el paso 8.1

Tabla 6: Concentración de estándares de calibración Niveles 1 a 7..

3. Retire los conos de los ICPMS y sonicar ellos durante 1 minuto en DW. Se secan los conos y ponerlos de nuevo en el instrumento.
4. A su vez en el enfriador de agua, gases (Ar, _H2, He), el ICPMS, líneas de conexión a nivel interno, y llenar los contenedores de enjuague auto-muestreador (DW, el ácido nítrico al 10%, ácido clorhídrico ácido nítrico 1% + 0,5%) .
5. Abra el software de estación de trabajo MassHunter y encienda el plasma, sintonizar la ICPMS y cargar el método establecido en los parámetros en la Tabla 7.

Parámetros	Valores
Los patrones internos	72 Ge, 115 A
De potencia de RF	1500 W
Caudal de gas de plasma	14.98
Caudal de gas nebulizador	/ Min 1.1 L (portador y dilución de gas combined - 0,6 + 0,5 l / min)
Cono de muestreo	Níquel para x lente
Cono Skimmer	Níquel
Tasa de absorción de la muestra	0.3 rps
Bomba nebulizador	0.1 rps
S de temperatura / C	2 ° C
Condición de barrido	El tiempo de permanencia de 1 segundo, el número de replicados 3
Flujo de gas H 2	N / A
El flujo de gas	4,3 ml / min

Tabla 7: condiciones de funcionamiento ICPMS.

6. Coloque estándar de calibración, las muestras de control de calidad y muestras experimentales en el inyector automático. En el software ICPMS agregar la secuencia de análisis y analizar muestras. Aspirar la muestra en el interior del instrumento para el plasma donde se ionizan los elementos. Entonces un vacío retira los iones a un contador. Los iones se separan en función de su peso atómico del más ligero al más pesado.
   PRECAUCIÓN: Recoger los residuos ICPMS en la contención peligrosos y manejar apropiadamente para su eliminación.
7. Asegúrese de que el valor del coeficiente de correlación (R) para la curva de calibración para cada metal o metaloide es mayor que 0.995 ^24.
8. Durante el análisis de la muestra, calcular el% R,% D y RPD como se describe en las ecuaciones 3-6 ²⁶ y comparar los resultados con los criterios de calidad de datos de proyectos en 8.3.
   1. Calcular el porcentaje de recuperación (% R) para determinar las pérdidas / ganando desde el bla laboratorio fortificadank (LFB) y la matriz de interferencia de matriz de laboratorio fortificada (LFM).

2. Calcular la diferencia de porcentaje (% D) para determinar los cambios de rendimiento del instrumento con el tiempo cuando se ejecuta muestras CCV.

3. Calcula diferencia porcentual relativa (RPD) para determinar los cambios en el método de precisión con el tiempo cuando se ejecuta muestras experimentales.

9. Para reducir la interferencia de la matriz (% R fuera del rango aceptable), diluir las muestras para pobres% R a una relación 1: 3 (muestra: DW).

10. Hg cuantificación por Cold Vapor de absorción atómica espectrofotómetro (CVAAS)

1. Preparar estándares de calibración el mismo día de su análisis. Diluir estándar Hg comprado añadiendo 1 ml de solución patrón de Hg comprado a un matraz aforado de 100 ml y llenarlo con la solución preparada en el paso 8.1.
   1. Añadir 2,5 ml de esta solución en un matraz aforado de 100 ml y llenar con la solución preparada en el paso 8.1 (esta nueva solución es el Nivel 7 estándar Hg). Añadir diluido corriente Hg Nivel 7 a matraces volumétricos y rellenar con blanco (solución preparada en el paso 8.1.) Como se describe en la Tabla 8 (véase comprado Hg descripción estándar solución en la tabla de materiales).

Parámetro	Nivel 1	Nivel 2	Nivel 3	Nivel 4	Nivel 5	Nivel 6
Estándar L7 Hg a añadir (ml)	0	1	2.5	5	20	25
El volumen final * (ml)	-	50	50	50	100	50
La concentración final (mg / L)	0	0.5	1.25	2.5	5	12.5
* Lograr este volumen mediante la adición de la solución preparada en el paso 8.1

Tabla 8: Concentración de Hg estándar de calibración niveles 1 a 6..

2. Abra el gas Ar y la válvula de aire, encienda la ABSORCIÓN Atómicación espectrofotómetro y la inyección de flujo Espectroscopia atómica (FIAS). Abra el software CVAAS Winlab, encienda la lámpara de Hg y deje que se caliente hasta que el parámetro de energía del software llega a 79. Cargar el programa para el análisis de Hg con los parámetros de la Tabla 9. Ajuste la trayectoria de la luz en el instrumento para dar la transmitancia máxima.

Parámetros	Valores
Gas portador	Argón, 100 ml / min
Lámpara	Hg lámpara de descarga sin electrodos, instalación a 185 mA
Longitud de onda	253,7 nm
Abertura	0,7 nm
La temperatura de la célula	100 ° C
Volumen de la muestra	500 l
Portador	3% de HCl, 9,23 ml / min
Reductor	10% SnCl2, 5,31 ml / min
Medición	Altura del pico
Leer réplicas	3

Tabla 9: condiciones de funcionamiento CVAAS.

3. Conecte la línea para la solución de soporte hecha de ácido clorhídrico de grado metales traza 3%.
4. Conecte la línea para la solución de agente reductor hecho de cloruro de 10% de estaño (adecuado para el análisis de Hg) en ácido clorhídrico 3% de grado de metales traza. Preparar esta solución el mismo día del análisis, ya que es propenso a la oxidación atmosférica (PRECAUCIÓN: cloruro de estaño es muy peligroso, use ropa de protección cuando se trabaja con él Recoger los residuos CVAAS en la contención peligrosos y disponer adecuadamente.).
5. Coloque las normas de Hg, muestras de control de calidad y muestras experimentales en el rack CVAAS y la entrada de la secuencia en el software CVAAS Winlab. Ejecutar las normas y generar la ecuación de calibrado.
6. Run QC sampios y las muestras experimentales. El CVAAS dibuja aproximadamente 5 ml de muestra en el instrumento, reduce el Hg presente en la muestra a Hg elemental (Hg ⁰⁾ gas y purga el gas de la solución con un gas portador (Ar) en un sistema cerrado. El vapor de mercurio pasa por una celda de la trayectoria de la luz de la lámpara de Hg. Un detector determina la luz absorbida en 253,7 nm y se correlaciona a la concentración. (PRECAUCIÓN: vapor de mercurio es tóxico, asegúrese instrumento campana de extracción está en su lugar).
7. Calcular% R,% D y RPD en el paso 9.7 durante el análisis y comparación de los resultados con los criterios de calidad de los datos del proyecto.

Resultados

Rendimientos de biomasa

Producción de N. salina en el sistema de PBR usado en este estudio creció de 1 g / L ^-1 a 8,5 ± 0,19 g / L ^-1 (N = 12) para los reactores de control y de 4,0 ± 0,3 g / L ^-1 (N = 12) para el multi-metal contaminado en 7 días. Los experimentos producen datos repetibles través de reactores por triplicado y varios lotes. Figura 2A muestra la densidad de cultivo de la media con muy pequeño error estándar ba...

Discusión

N. microalgas Saline salina puede cultivar con éxito en el sistema de crecimiento diseñado con resultados repetibles y altos rendimientos de biomasa. Puente aéreo de la mezcla permitió un cultivo suspendido bien mezclada con sedimentación mínima o la contaminación biológica durante los períodos de crecimiento de 7 días. La variabilidad mínima luz a través del banco de luz fluorescente también se destaca por no producen diferencias notables en el crecimiento.

El...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-500
Sodium meta silicate nonahydrate	Fisher Scientific	S408-500
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
Potassium nitrate	EMD Chemical	PX1520-5
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Ammonium ferric citrate	Fisher Scientific	I72-500
Boric acid	Fisher Scientific	A73-500
Sodium molybdate, dihydrate	EMD Chemical	SX0650-2
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	Z68-500
Cupric sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	C489-500
Biotin	Acros Organics	230090010
Thiamine	Acros Organics	148990100
Vitamin B12	Acros Organics	405920010
Copper (II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	221783-100G	Irritant, Dangerous to the Environment
Lead (II) chloride	Sigma-Aldrich	268690-250G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium dichromate dihydrate	Sigma-Aldrich	398063-100G	Oxidizing, Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Nickel (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	223387-500G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium (meta) arsenite	Sigma-Aldrich	71287	Toxic, Dangerous to the Environment
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908-10G	Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Mercury (II) chloride	Sigma-Aldrich	215465-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Tin (II) chloride dihydrate	Fisher Scientific	T142-500	Corrosive. Suitable for Hg analysis. Very hazardous.
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Vanadium (V) oxide	Acros Organics	206422500	Dangerous to the Environment
Carbon dioxide	Air Liquide	I2301S-1	Compressed
Hydrogen peroxide	H325-500	Fisher Scientific	30% in water
ICP-MS standard	ICP-MS-6020	High Purity Standards
Mercury standard	CGHG1-1	Inorganic Ventures	1000±6 µg/mL in 5% nitric acid
Argon	Air Liquide		Compressed
Helium	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Hydrogen	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Nitric acid	Fisher Scientific	A509-P212	67-70% nitric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A508-P212	35% hydrochloric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Equipment
Scientific prevacuum sterilizer	Steris	31626A	SV-120
Centrifuge	Thermo Fisher	46910	RC-6 Plus
Spectrophotometer	Shimadzu	1867	UV-1800
pH controller	Hanna	BL981411	X4
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-151-SSV	T31Y
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-26-SSV	T35Y
Water bath circulator	Fisher Scientific	13-873-45A
Compact chiller	VWR	13270-120
Freeze dryer	Labconco	7752020
Stir plate	Fisher Scientific	11-100-49S
pH lab electrode	Phidgets Inc	3550
Inductively coupled plasma mass spectrometer	Agilent Technologies	7700 Series ICP-MS	Attached to autosampler CETAC ASX-520
FIAS 100	Perkin Elmer Instruments	B0506520
Atomic absorption spectrometer	Perkin Elmer Instruments	AAnalyst 800
Cell heater (quartz)	Perkin Elmer Instruments	B3120397
Microwave	Milestone		Programmable, maximum power 1,200 W
Microwave rotor	Milestone		Rotor with 24-75 ml Teflon vessels for closed-vessel microwave assisted digestion.
Materials
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-0425
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-1650
0.45 μm syringe filter	Thermo Fisher	F2500-3
Polystyrene tubes	Evergreen	222-2094-050	17 x 100 mm w/cap, 16 ml, polysteryne
Octogonal magnetic stir bars	Fisher scientific	14-513-60	Magnets encased in PTFE fluoropolymer