Quantification des métaux lourds et d'autres contaminants inorganiques sur la productivité des microalgues

Résumé

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Résumé

Augmentation de la demande pour les carburants renouvelables a chercheurs qui étudient la faisabilité de matières premières alternatives, telles que les microalgues. Avantages inhérents comprennent haut rendement potentiel, l'utilisation des terres non arables et l'intégration avec les flux de déchets. Les besoins nutritionnels d'un système de production de micro-algues à grande échelle, il faudra le couplage de systèmes de culture avec des ressources de déchets industriels, tels que le dioxyde de carbone du gaz et des nutriments provenant des eaux usées fumée. Contaminants inorganiques présents dans ces déchets peuvent potentiellement conduire à la bioaccumulation dans la biomasse de microalgues un impact négatif sur la productivité et de limiter l'utilisation finale. Cette étude porte sur l'évaluation expérimentale de l'impact et le sort de 14 contaminants inorganiques (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V et Zn) sur Nannochloropsis croissance salina . Les microalgues sont cultivées dans des photobioréacteurs illuminés à 984 pmol m ^-2 s ^-1 et maintenu à pH 7 dans une m de croissanceedia polluée par des contaminants inorganiques à des niveaux prévus en fonction de la composition trouvé dans les systèmes de gaz de charbon de combustion commerciaux. Les contaminants présents dans la biomasse et le milieu à la fin d'une période de croissance de 7 jours ont été analytiquement quantifiés par vapeur froide spectrométrie d'absorption atomique pour le mercure et par couplage inductif spectrométrie de masse à plasma pour As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V et Zn. Les résultats montrent N. salina est une souche sensible à l'environnement multi-métal avec une baisse statistique de la biomasse yieldwith l'introduction de ces contaminants. Les techniques présentées ici sont suffisantes pour quantifier la croissance des algues et de déterminer le sort des contaminants inorganiques.

Introduction

Par rapport aux cultures traditionnelles terrestres ont été montré microalgues pour atteindre des rendements plus élevés de la biomasse et de lipides en raison de rendements de conversion inhérents solaire élevés ^1,2. La culture des micro-algues à des taux de productivité élevés nécessite la fourniture de divers éléments nutritifs comprenant une source de carbone externe. Il est prévu que les installations de croissance à grande échelle seront intégrés aux flux de déchets industriels tels que les gaz de combustion industrielle afin de minimiser les coûts de production et en même temps fournir assainissement de l'environnement. Carbone des déchets industrielle est généralement sous la forme de dioxyde de carbone gazeux et peut contenir des contaminants qui ont le potentiel d'avoir un impact négatif sur la production de microalgues. En particulier, les gaz de combustion provenant de charbon aura une variété de contaminants, y compris mais non limité à des produits de combustion de l'eau et du dioxyde de carbone, ainsi que les oxydes de soufre et d'azote, les poussières fines, les contaminants organiques, tels que les dioxines et les furannes, et con inorganiquecontaminants tels que les métaux lourds. L'impact de la majorité de ces contaminants inorganiques, y compris avec certains d'entre eux connu que les métaux lourds sur la productivité de microalgues ont pas été explorée. Certains de ces éléments peuvent être des éléments nutritifs à des concentrations appropriées, mais à des concentrations plus élevées, ils peuvent produire un dysfonctionnement cellulaire et même la mort ^3.

L'intégration des micro-algues avec un gaz de combustion industrielle a le potentiel de présenter directement contaminants inorganiques dans un milieu de croissance. gaz de fumée à base de charbon a une variété d'éléments inorganiques (par exemple, As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V et Zn) à diverses concentrations dont certains, en bas concentration, représenter nutriments pour la croissance de microalgues. Des contaminants inorganiques ont une haute affinité à se lier à des micro-algues et en outre être adsorbé à l'intérieur à travers les transporteurs de nutriments. Certains contaminants inorganiques (c.-à-Co, Cu, Zn et Mn) sont des nutriments qui font partie des enzymes impliquentd dans la photosynthèse, la respiration et d'autres fonctions ^3,4. Cependant, dans les métaux et métalloïdes excès peut être toxique. D'autres éléments, tels que Pb, Cd, Sn, Sb, Se, As et Hg, ne sont pas connus pour soutenir la fonction des cellules dans toute concentration et de représenter les métaux non-nutritifs qui pourraient influer négativement ^3,5,6 de croissance de la culture. La présence de l'un de ces contaminants est susceptible de produire des effets négatifs sur la fonction des cellules de micro-algues. En outre, l'interaction de plusieurs métaux avec microalgues complique la dynamique de croissance et a le potentiel d'affecter la croissance.

L'économie à grande échelle ont été directement liés à la productivité du système de culture ^7-19. En outre, à moyen recyclage dans le système de croissance des microalgues soit pour bassins ouverts de chemin de roulement (ORP) ou photobioréacteurs (PBR) est essentiel car il représente 99,9 et 99,4% de la masse, respectivement ^20. La présence de contaminants inorganiques dans les médias pourrait finalement limiter microalgae productivité et le recyclage des médias en raison de l'accumulation de contaminants vers le haut. Cette étude déterminée expérimentalement l'impact de 14 contaminants inorganiques (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V et Zn), à des concentrations attendues de l'intégration de systèmes de culture de microalgues avec du charbon dérivé gaz de combustion, sur la productivité de N. salina cultivé dans PBRs de transport aérien. Les contaminants utilisés dans cette étude ont montré non seulement d'être présent dans à base de charbon de gaz de combustion, mais les gaz de combustion à partir de déchets municipaux, gaz de combustion à base biosolides, les eaux usées municipales, l'eau produite, une altération de l'eau souterraine et l'eau de mer ^21-23. Les concentrations utilisées dans cette étude sont basés sur ce qui serait attendu si les systèmes de croissance de microalgues ont été intégrés avec une base de source de CO ₂ de charbon avec une efficacité démontrée dans l'absorption des systèmes de PBR commerciales ^20. Des calculs détaillés supportant les concentrations des métaux lourds et des contaminants inorganiques sont présentés dans Napanet al. ²⁴ techniques analytiques ont été utilisés pour comprendre la distribution de la plupart des métaux dans la biomasse, des médias et de l'environnement. Les méthodes présentées ont permis l'évaluation du potentiel de productivité de microalgues sous stress polluant minéral et la quantification de leur fin destin.

Protocole

1. système de croissance

Figure 1. Les microalgues système de croissance. (A) rotomètre de l'air, (B) CO ₂ rotomètre, (C) contrôleur de pH avec électrovanne, (D) enregistreur de données, (E) en ligne de filtres à air, (F) de la tête de distribution d'air, (G) banque de lumière fluorescente, (H) pH-mètres, le système (I) de refroidissement, (J) bain d'eau, (K) fil de thermocouple, (L) air lift photobioréacteur, (M) de chauffage, (N) de plain-pied dans la fumée hotte, (O) de ventilation, (P) tube capillaire de distribution d'air, (Q) filtres à air, (R) tube de prélèvement, (S) couvercle PBR de silicone, et (T)pH bien dans couvercle en silicone. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Construire le système de croissance des microalgues expérimental suivant (Figure 1).
   1. Acquérir douze PBRs de transport aérien composé de verre tubes réacteurs 4,5 cm de diamètre et 80 cm de hauteur avec une capacité de culture de 1,1 L avec couvercles en silicone. Acquérir tubes prédécoupés capillaires en verre (5 mm de diamètre extérieur et de 1 mm de diamètre interne) de 10 cm (3 par PBR) et 85 cm (1 par PBR) de longueur.
   2. Congeler couvercles de silicone dans un congélateur à -80 ° C. Graisser un foret avec le glycérol et tandis que les couvercles sont gelés percez 3 trous pour accueillir les tubes capillaires ventilation, d'échantillonnage et de livraison de gaz, et 1 trou de 17 mm de diamètre pour accueillir une sonde de pH.
   3. Insérez les 3 tubes capillaires en place avec le tube le plus long étendant à 2 cm du bas de la PBR. Dans l'autre tube capillaire ajouter un tube de silicium with un tube capillaire fixé à l'autre extrémité se prolongeant à un point d'échantillonnage souhaité. Couvrez le trou pour le pH-mètre avec une taille silicone bouchon 21D.
   4. Humidifier l'air ambiant par barbotage dans l'eau et délivrer l'air humidifié à l'en-tête de distribution d'air. Passez le gaz à travers un filtre de 0,2 um et de le livrer à la suspension d'algues à travers le tube capillaire la plus longue de la livraison de verre.
   5. Livrer CO ₂ comprimé dans le flux d'air humidifié afin de maintenir un pH neutre de 7,0 ± 0,1 dans la suspension de la culture. Contrôler le taux de CO ₂ avec une livraison (régulateur de pH) automatisé CO ₂ du système du dispensaire qui ouvre un solénoïde magnétique lorsque la culture d'algues atteint un pH de 7,1 et se termine à pH 6,9.
   6. Fournir de la lumière en utilisant 24 T5 lampes fluorescentes qui se traduisent par une illumination moyenne de 984 pmol m ^-2 s ^-1 similaire à pic conditions extérieures.
   7. Plonger les droits des phytogénéticiens dans un bain d'eau afin de maintenir une température constante d'environ 25 ° C. Contrôler la température du système à l'aide d'un refroidisseur de recirculation et d'un chauffage à circulation bain d'eau de l'unité de contrôle automatisé.
   8. Surveiller la température et du pH en temps réel et d'enregistrer avec un enregistreur de données.
   9. Veiller à ce que toutes les composantes du système de croissance de microalgues sont correctement travaillent, en particulier avant la récolte microalgues inoculum ou la préparation des contaminants inorganiques comme ils ne peuvent pas être conservés.

2. Préparation Lab Ware

1. Laver fioles jaugées, les droits des phytogénéticiens, bonbonnes et tous les contenants avec de l'eau du robinet et du savon. Rincez avec de l'eau déminéralisée (DW).
2. Acid rincer la vaisselle de laboratoire afin d'éliminer toutes traces de contaminants inorganiques. Cela peut être fait par une des deux manières suivantes:
   1. Faire tremper du matériel de laboratoire O / N dans 10% d'acide nitrique de qualité trace de métal (Attention: Ne pas respirer les vapeurs, l'acide nitrique concentré peuvent produire de graves brûlures et des fumées toxiques, le travail dans un hoo de fuméesD en utilisant des gants en nitrile, lunettes et une blouse de laboratoire).
   2. Faire tremper du matériel de laboratoire pendant 15 min dans 50% des métaux traces d'acide nitrique de qualité.
   3. Rincez la vaisselle de laboratoire avec DW à fond au moins 3 fois en veillant tout l'acide est éliminé. Il est essentiel que les COV sont rincés à fond, en particulier les tubes de prélèvement et les tubes capillaires. Sinon, cela va produire l'acidification de l'inhibition moyenne et possible de la croissance. Tester le pH de l'eau de rinçage pour vérifier l'acide tout a été supprimée.
   4. Stériliser PBR, contenants et flacons par eux à l'autoclave à 120 ° C et la pression atmosphérique normale pendant au moins 30 min.

3. N. salina Moyen Préparation

1. Préparation de la solution A: Remplir partiellement un 1 L fiole jaugée avec DW. Insérez une barre d'agitation magnétique et ajouter les produits chimiques figurant au tableau 1 un après l'autre. Assurez-vous que chaque ingrédient dissout avant l'addition du constituant suivant. Retirer l'aimant et remplir ee ballon pour le volume 1 de marque L.

Composant	Montant à ajouter (g)	La concentration finale (g / L)
H 3 BO 3	0,900	0,900
Na 2 MoO 4 · 2H 2 O	0,012	0,012
MnCl 2 · 4H 2 O	0,300	0,300
ZnSO 4 · 7H 2 O	0,060	0,060
CuSO 4 · 5H 2 O	0,020	0,020

Tableau 1:. Solution A recette quantités sont des quantités nécessaires pour la préparation de 1 litre de solution concentrée.

2. Préparation de la solution de vitamines: Dans trois vol séparéeflacons umetric ajouter les vitamines comme l'indique le tableau 2. Filtre de chaque solution de vitamines à travers un filtre à seringue de 0,2 um stérile dans un récipient stérile. Préserver les vitamines à -4 ° C dans l'obscurité.

Vitamines	Montant (mg)	Le volume final (ml)	Concentration de vitamine final (mg / L)
Biotine	12.22	500	24.43
La vitamine B12	13.50	100	135.00
Chlorhydrate de thiamine	977,63	500	1,955.27

Tableau 2:. Vitamine solution recette quantités sont des quantités nécessaires pour la préparation des solu concentrétion.

3. Remplissez partiellement un récipient autoclavable 20 L avec DW et insérer une barre d'agitation magnétique. Placer le récipient sur le dessus d'une plaque d'agitation magnétique et ajouter les produits chimiques indiquées dans le tableau 3 (à l'exception des vitamines), de les ajouter l'un après l'autre, et après chaque dissout complètement. Remplissez le récipient pour atteindre 20 L.

Composant	Montant à ajouter à moyen	Unité
NaCl	350.00	g
CaCl 2 · 2H 2 O	3.00	g
KCl	9.60	g
Na 2 SiO 3 · 9H 2 O	1.14	g
MgSO 4 · 7H 2 O	29.60	g
KNO 3	20.40	g
KH 2 PO 4	1,36	g
Le citrate ferrique d'ammonium	0,10	g
Solution A	20.00	ml
solution de biotine *	818,00	pl
solution de vitamine B12 *	296,20	pl
Solution de chlorhydrate de thiamine *	521,60	pl
* Ajouter aux médias autoclave refroidi

Tableau 3: N. salina recette moyenne. Les quantités sont des quantités nécessaires à la préparation de 20 L de milieu riche en nutriments.

4. Stériliser à l'autoclave le milieu pendant 30 min à 120 ° C et pression atmosphérique. Laissez le coo moyennel jusqu'à la température ambiante.
5. Placer le récipient sur une plaque d'agitateur magnétique. Ajouter les vitamines préparés à l'étape 3.2 et laisser le mélange moyen à fond.

4. contaminants inorganiques de préparation de la pâte

1. Remplir partiellement les fioles jaugées indiquées dans le tableau 4 avec DW et ajouter le sel personne inscrite. Remplir avec DW au volume final requis et mélanger soigneusement. Ne pas conserver ces stocks que certains éléments adsorber au ballon murs
   ATTENTION: Plusieurs contaminants inorganiques utilisés dans ce protocole sont cancérigènes, tératogènes et mutagènes, porter un masque, des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des sels.

Analyte	Source de sel	Volume de stock pour préparer (L)	Le sel à ajouter à la fiole60; (Mg de sel)	concentration de l'analyte ajouté à la culture (analyte mg / L)
Comme	NaAsO 2	0,1	14,8	7.74E-02
CD	CdCl2	0,5	13,5	1,50E-02
Co	CoCl 2, 6H 2 O	0,5	34,7	1.56E-02
Cr	Na 2 Cr 2 O 7 · 2H 2 O	0,1	40,6	1.29E-01
Cu	CuCl 2, 2H 2 O	0,1	38,3	1.30E-01
Hg	HgCl2	10	14,6	9.80E-03
Mn	MnCl 2, 4 H 2 O	0,1	58,8	1.49E-01
Ni	NiCl 2, 6H 2 O	0,1	112,0	2.51E-01
Pb	PbCl2	0,5	39,9	5.41E-02
Sb	Sb 2 O 3	0,5	26,7	4.06E-02
Se	Na 2 SeO 3	0,5	11,8	9.80E-03
Sn	SnCl 2, 2H 2 O	0,5	3.9	3.76E-03
V	V 2 O 5	0,1	22,2	1.13E-01
Zn	ZnCl 2	0,1	99,9	4.36E-01

Tableau 4:. Concentré minéral préparation contaminants boursier addition de 1 ml de ce stock concentré au milieu de PBR de 1,1 L produit la concentration finale indiqué dans la dernière colonne.

2. Stériliser les stocks de contaminants inorganiques en faisant passer la solution à travers un filtre à seringue de 0,2 um stérile et recueillir le filtrat dans un tube stérile.

5. N. salina l'inoculum

1. Dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml ajouter 200 ml de milieu préparé à l'étape 3, puis ajouter 3 g d'agar. Couvrir le flacon dans une feuille d'aluminium et autoclave pendant 20 min à 120 ° C. Versez la solution dans des boîtes de Pétri stériles et laisser refroidir jusqu'à ce qu'il se solidifie. Cela devrait être complété soit une hotte stérile ou au moins à proximité d'une flamme dans un environnement propre pour réduire le risque de contamination.
2. Streak N. cellules salina dans Pétri-dis stérileshes préparé à l'étape 5.1 en utilisant une boucle d'ensemencement stérile. Placez les cultures de boîte de Petri sur une table illuminée avec des lumières T12 maintenus à température ambiante. Laissez microalgues poussent jusqu'à colonies sont visibles.
3. colonies de transfert à stériles déconcertés flacons Erlenmeyer contenant 200 ml de milieu riche en nutriments préparés à l'étape 3 et de les garder sur une table vibrante illuminé (1000 RPM). Que la culture grandir jusqu'à ce milieu devient vert.
4. Transférer le microalgues à un PBR stérile de 1,1 L. Placez le PBR dans un bain d'eau de l'inoculum illuminé à 200 pmol m ^-2 s ^-1 avec des lumières fluorescentes T8 et maintenue à 23 ° C par un refroidisseur à circulation et une régulation du bain de chauffage de l'eau de recirculation automatique. Réglez l'air et de CO ₂ rotamètres à 2,5 L min ^-1 et 25 cc min ^-1, respectivement.
5. Après une semaine de la scission de la croissance de la biomasse en nouveaux 1 .1 L PBRs contenant nouveau média et le laisser grandir jusqu'à ce qu'un total d'au moins 28 g de poids sec de la biomasse sontobtenu entre les deux réacteurs qui peuvent être déterminées par la densité optique.
6. Récolter la biomasse d'inoculum par centrifugation à 2054 xg pendant 15 min à 10 ° C en utilisant des flacons de centrifugation stériles et des techniques stériles pour éviter la contamination. Éliminer le surnageant et continuer concentration de cellules que nécessaire.
7. Une fois que toute la biomasse est centrifugé, remettre en suspension les cellules dans 300 ml de milieu frais stérile.
8. Diluer 0,1 ml de la culture de microalgues dans 3 ml de DW et puis diluer 0,1 ml de cette nouvelle solution dans 3 ml de DW. Assurer que l'échantillon est bien mélangé. Mesurer la densité optique (DO) du concentré de micro-algues à 750 nm () immédiatement en utilisant un spectrophotomètre.
9. Utiliser l'équation (1) pour déterminer la quantité de biomasse dans le concentré.
   Remarque: L'équation (1) a été obtenue à partir de la régression linéaire entre par rapport au total des solides en suspension (en g / L ^-1) pour N. Salina (R ² = 0,9995). L'équation 1 a été développé pour l'spectrophotometer modèle dans le tableau des matériaux, générer un nouveau calibrage si vous utilisez un autre modèle de spectrophotomètre.
   1. En utilisant l'équation (2) calculer le volume de concentré de micro-algues (en L) nécessaire pour obtenir une densité de 4 g / L ^-1 culture dans un PBR de 1,1 L de volume (en L).

10. En utilisant des techniques stériles, ajouter le volume de microalgues concentré trouvé dans l'étape 5.9 à un PBR autoclave pour atteindre une densité de culture initiale de 4 g / L ^-1. Remplissez PBR avec le milieu à 1.1 L. Répétez cette étape jusqu'à 6 PBRs sont inoculés. Placez les droits des phytogénéticiens dans le bain d'eau de l'inoculum.
11. Laissez les microalgues dans les PBRs croître pendant 8 jours et ensuite récolter la biomasse (par répéter les étapes 5.6 à 5.7). Répétez l'étape 5.8 pour calculer la premièrevolume d'inoculum pour une culture de densité initiale de 1 g / L ^-1.

6. réacteurs expérimentaux

1. Techniques stériles en utilisant ajouter environ 1 L de milieu préparé à l'étape 3 à chacun des 12 PBRs stériles acides rincés. Placez les COV dans le bain du système de croissance expérimental de l'eau. Tournez injecter d'air sur au 1,5 L min ^-1.
2. Stériliser un pH-mètre étalonné en le nettoyant avec 70% d'éthanol. Mesurer le pH du milieu dans le PBR et assurer pH est d'environ 7,0; sinon, répétez l'étape 2 pour éliminer l'acide lessivée de l'étape de rinçage acide.
3. Calibrer chaque contrôleur de pH en utilisant un tampon pH 7, désinfecter les sondes utilisant de l'éthanol (70%) et les insérer ensuite dans les couvercles PBR.
4. Pour chaque PBR (sauf les droits des phytogénéticiens de contrôle), ajouter 1 ml de chacun des stocks des contaminants inorganiques stériles préparées à l'étape 4. Laissez les contaminants bien mélanger dans le PBR. La concentration finale des contaminants inorganiques dans les COV sont shown dans la dernière colonne du tableau 4, et sont les concentrations maximales estimées attendre d'une intégration de la centrale au charbon.
5. Ajouter 14 ml de DW stérile pour les droits des phytogénéticiens de contrôle.
6. Ajouter l'inoculum de micro-algues concentré obtenu à l'étape 5.11 pour les COV expérimentales, afin d'obtenir une densité de culture initiale de 1 g / L ^-1. Laissez soigneusement biomasse mix.
7. Tournez hautes lumières lumineuses d'intensité (de 984 pmol m ^-2 s ^-1) et les contrôleurs de pH et ajuster sur le CO ₂ à 30 min ¹ cc. Augmenter le flux de CO ₂ à 50 cc min ^-1 du jour 3 après. Faible taux initial de CO ₂ d'écoulement est critique afin d'éviter les grands changements de pH en raison de retards dans le transfert de gaz / liquide et de mesure du pH.
8. Mesurer et prélever des échantillons au besoin. Assurez-vous de marquer le niveau de l'eau après le prélèvement. (ATTENTION: certains contaminants inorganiques dans le PBR sont cancérigènes, tératogènes et mutagènes; gants et capp utilisationrécipients és lors de la manipulation des échantillons).
9. Ajouter DW stérile quotidien pour les droits des phytogénéticiens dans le but de compenser les pertes dues à l'évaporation.
10. Après 7 jours de culture, la récolte de la biomasse par centrifugation à 9936 x g et préserver à la fois, de la biomasse et de milieu surnageant, à -80 ° C.
11. Lyophiliser la biomasse à 0,1 mbar et -50 ° CO / N. Poudre la biomasse (utiliser une spatule en poudre biomasse à l'intérieur du tube de centrifugation). Préserver gel biomasse séchée à -80 ° C.

7. Micro-ondes assistée par digestion d'échantillons

La digestion des échantillons de biomasse est nécessaire comme étape de pré-traitement pour l'analyse ICP-MS.
Remarque: Ces étapes utilisent un système de digestion récipient micro-ondes fermé avec soulagement de la pression contrôlée. (ATTENTION: Les hautes pressions se développent pendant la digestion acide, inspectent l'intégrité physique des récipients de digestion et de boucliers, et de remodeler les couvercles de cuve de digestion micro-ondes avant chaque utilisation).

1. Laver téflon micro-ondes digestion navires avec de l'eau et du savon, rincer à DW et laissez sécher à l'air navires. Pour éliminer la contamination de métaux traces dans les vaisseaux digérer l'acide comme décrit dans les étapes suivantes.
2. Remodeler les couvercles de cuve de digestion à micro-ondes et fermer les flacons correctement.
3. Ajouter 10 ml d'acide nitrique à chacun.
4. Présentez le navire dans le bouclier de sécurité. Faire en sorte qu'aucun biomasse, l'eau ou des réactifs sont laissés sur les parois de la protection de sécurité ou dans les parois externes des récipients de digestion, afin d'éviter des dommages à la protection de sécurité. Boucher le bouclier de sécurité avec la soupape de sécurité en veillant au printemps dans le flacon affleure. Localisez le bouclier sur le rotor avec les évents de capitalisation pointant vers l'extérieur dans la ligne extérieure et vers l'intérieur dans la ligne intérieure.
5. Le numéro de la cuve une, à insérer le doigt de gant en céramique et le capteur de température. Ce thermomètre surveille la température interne réelle dans le flacon et sert en tant que paramètre de commande pour exécuter le progr de digestionam. Assurez-vous que le numéro un flacon contient les mêmes quantités échantillon et de réactif que les autres flacons.
6. Entrez les paramètres de digestion présentés dans le tableau 5 et de commencer la digestion. Lorsque le programme est terminé, l'air refroidir les flacons jusqu'à ce qu'ils atteignent la température ambiante.

Étape	Flacons de rinçage			Digestion échantillon
	Température (° C)	Temps (min)	Max. puissance (W)	Température (° C)	Temps (min)	Max. puissance (W)
1	RT à 190	25	1000	RT à 180	15	1000
2	190	10	1000	180	15	1000
Échappement	-	20	-	-	20	-

Tableau 5: Paramètres utilisés dans le four à micro-programme de digestion.

7. L'intérieur d'une hotte, insérer l'outil de l'allégement de la pression sur le capuchon de protection avec les évents de capitalisation pointer loin de vous. Une fois que la pression est relâchée ouvert le bouchon (ATTENTION: flacons digérés toujours ouvertes à l'intérieur hotte depuis biomasse digestion en utilisant de l'acide produit des fumées toxiques).
8. Jeter de l'acide. Rincez les récipients en téflon avec DW 3 fois. Laissez flacons air sec.
9. Pour digérer la biomasse, ajouter 50 mg de lyophilisé biomasse aux navires de digestion à micro-ondes. Pour le contrôle de la qualité (CQ) préparer les flacons suivants: dans deux flacons différents ajouter soit 5 ml de Niveau 7 ICPMS ou 5 ml de niveau standard 7 Hg CVAAS préparé dans les étapes 9.1 et 10.1 (la solution digéré de ce flacon est appelé le laboratoire fortifiée vierge (LFB)), laisser un autre flacon vide (la solution digéréede ce flacon est appelé le réactif témoin de laboratoire (LRB)).
10. Pour digérer moyen, ajoutez 10 ml de milieu surnageant à sécher acide rincé navires micro-ondes de la digestion. Pour le contrôle de la qualité (CQ) préparer les flacons suivants: Dans deux flacons différents ajouter 5 ml de Niveau 7 ICPMS ou CVAAS norme de métal préparés à l'étape 9.1 et 10.1 (la solution digéré de ce flacon est appelé le LFB), à un autre flacon ajouter 10 ml de DW (la solution digérée de ce flacon est appelé le LRB).
11. Remodeler les couvercles de cuve de digestion à micro-ondes et fermer les flacons correctement.
12. Ajouter 7 ml de concentré de grade trace métallique de l'acide nitrique et 3 ml de peroxyde d'hydrogène à chaque flacon. Homogénéiser le contenu en remuant doucement la solution. Digérer le contenu des flacons en répétant les étapes 7.4 à 7.7 (en utilisant les paramètres micro-ondes pour l'échantillon de digestion digestion dans le tableau 5).
13. Ajouter échantillon digéré à une fiole jaugée de 25 ml, rincer les récipients avec DW pour une récupération accrue. Remplissez la fiole jaugée avec DWà la marque.
14. Transfert digéré échantillons à un récipient bouché. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à l'analyse peut être complétée. Pour cette analyse de l'étude se fait le même jour pour Hg et dans les trois jours pour les autres éléments.

8. Contrôle Qualité (QC) échantillons

Remarque: Analyser QC échantillons afin d'assurer la fiabilité des résultats des échantillons expérimentaux.

1. Remplissez partiellement un acide rincé 1 L fiole jaugée avec DW. Ajouter 280 ml de concentré de grade trace métallique de l'acide nitrique et mélanger soigneusement (cette solution est aussi appelé la solution à blanc) (ATTENTION: toujours ajouter l'acide à l'eau, ne jamais ajouter de l'eau à l'acide que la réaction exothermique peut être violent). Laissez solution refroidir à température ambiante.
2. En plus de QC échantillons préparés dans les étapes 7.9 et 7.10, préparer les échantillons QC suivants.
   1. Pour la vérification de l'étalonnage continue (CCV): Remplir un tube de polystyrène à la norme de calibrage (pour la préparation, voirétape 9.2 et 10.1). Mettez la solution standard Hg sur la grille CVAAS et les ICPMS solution standard dans le ICPMS échantillonneur automatique.
   2. Pour l'étalonnage continue vierge (CCB): Remplir deux tubes de polystyrène (16 ml) avec l'ébauche (solution préparée dans l'étape 8.1). Mettre un échantillon dans le rack de CVAAS et l'autre échantillon dans le ICPMS échantillonneur automatique.
   3. Pour la matrice de laboratoire fortifiée (LFM): Choisissez au hasard une échantillon de tous les 12 échantillons pour chaque type d'échantillon (c.-à biomasse ou moyenne) et l'utiliser pour préparer un LFM. Pour ICPMS, ajouter 0,5 ml de ICPMS de niveau standard 7 et 3 ml d'échantillon expérimental digéré (à partir de la biomasse ou du milieu) pour un tube de polystyrène.
   4. Mélanger le contenu et placer les flacons sur l'échantillonneur automatique de ICPMS. Pour CVAAS, ajouter 2 ml Hg niveau standard 7 et 6 ml d'échantillon expérimental digéré (à partir de la biomasse ou du milieu) dans un tube de polystyrène. Mélanger le contenu et placer des flacons sur la grille de CVAAS.
   5. Pour les échantillons en double: choisir aléatoirement 1 échantillon de jamaisy 12 échantillons pour chaque type de matrice (par exemple, la biomasse, moyen, LFM ou toute matrice diluée) et dupliquer le flacon. Placez les flacons répétées dans l'échantillonneur automatique de ICPMS ou le rack CVAAS.
   6. Pour les échantillons en double: choisir aléatoirement 1 échantillon de tous les 12 échantillons pour chaque type de matrice (par exemple, la biomasse, moyen, LFM ou toute matrice diluée) et dupliquer le flacon. Placez les flacons répétées dans l'échantillonneur automatique de ICPMS ou le rack CVAAS.
3. Définir les critères de qualité de données pour l'étude. Pour la présente étude dupliquer les critères de qualité établis par Eaton, Clesceri, Rice et Greenberg ^25. Les paramètres établis pour le QC sont: différence de pour cent (% D) pour CCV à ± 10% ²⁵ (à l'exception de Pb et Sb, voir la discussion), LFB pour cent de récupération (% R) à ± 70-130% ²⁵ pour cent de LFM récupération (% R) à l'intérieur de 75 à 125% ^25, et pour cent par rapport différence (SPR) à l'intérieur de ± 20% ²⁵ et une ca continuelibration vierge (CCB) dessous de la limite méthode de déclaration (LMR) ^25. Voir équations de calcul à l'étape 9.7.

9. Quantification par plasma à couplage inductif spectrométrie de masse (ICP-MS)

1. Le jour de l'analyse, transférer environ 5 ml d'échantillon digéré des tubes de polystyrène et de les placer dans le ICPMS échantillonneur automatique. Ajouter environ 15 ml d'échantillons minéralisés des tubes de polystyrène et de les placer dans le rack de CVAAS.
2. Le même jour, de l'analyse de préparer les étalons de calibration. Ajouter ICPMS achetés solution standard et remplir avec le blanc (solution préparée dans l'étape 8.1) comme décrit dans le tableau 6 (voir la description de la solution étalon dans le tableau Matériau) pour fioles jaugées acide rincé.

Paramètre	Niveau 1	Niveau 2	Niveau 3	Niveau 4	Niveau 5	Niveau 6	Niveau 7
Norme acheté à ajouter (ml)	-	-	-	-	-	-	10,0
Niveau 7 à ajouter (ml)	0.0	10	2.5	5.0	20,0	25,0	-
* Le volume final (ml)	-	50,0	50,0	50,0	100,0	50,0	100,0
La concentration finale (ug / L)
75 Comme	0.0	2.0	5.0	10,0	20,0	50,0	1000,0
111 Cd	0.0	10	2.5	5.0	10,0	25,0	50,0
59 Co	0.0	10,0	25,0	50,0	100,0	250,0	500,0
52 Cr	0.0	2.0	5.0	10,0	20,0	50,0	100,0
63 Cu	0.0	5.0	12,5	25,0	50,0	125,0	250,0
55 Mn	0.0	3.0	7.5	15,0	30,0	75,0	150,0
60 Ni	0.0	8.0	20,0	40,0	80,0	200,0	400,0
208 Pb	0.0	10	2.5	5.0	10,0	25,0	50,0
121 Sb	0.0	12,0	30,0	60,0	120,0	300,0	600,0
51 V	0.0	10,0	25,0	50,0	100,0	250,0	500,0
66 Zn	0.0	4.0	10,0	20,0	40,0	100,0	200,0
* Atteindre ce volume en ajoutant la solution préparée dans l'étape 8.1

Tableau 6: Concentration des normes d'étalonnage niveaux 1 à 7..

3. Retirez les cônes des ICPMS et soniquer eux pendant 1 min dans DW. Sécher les cônes et les remettre dans l'instrument.
4. Allumez le refroidisseur d'eau, de gaz (Ar, H _2, He), l'ICPMS, les plug lignes à la norme interne, et remplir des récipients échantillonneur automatique rinçage (DW, l'acide nitrique à 10%, 1% d'acide nitrique + l'acide chlorhydrique 0,5%) .
5. Ouvrez le logiciel Workstation MassHunter et tourner sur le plasma, syntonisez le ICPMS et charger la méthode exposée à des paramètres dans le tableau 7.

Paramètres	Valeurs
Normes internes	72 Ge, 115 A
Puissance RF	1500 W
débit de gaz plasmagène	14.98
Débit de gaz nébuliseur	1,1 L / min (support et la dilution du gaz combiné - 0,6 + 0,5 L / min)
Cône d'échantillonnage	Nickel pour x objectif
Cône Skimmer	Nickel
Taux d'absorption échantillon	0,3 RPS
Pompe nébuliseur	0,1 RPS
S / C Température	2 ° C
état de numérisation	Le temps de séjour de 1 sec, le numéro de réplication 3
H 2 flux de gaz	N / A
Il débit de gaz	4,3 ml / min

Tableau 7: conditions de fonctionnement ICPMS.

6. Placez étalon, QC échantillons et des échantillons expérimentaux dans l'échantillonneur automatique. Dans le logiciel de ICPMS ajouter la séquence d'analyse et analyser des échantillons. Aspirer l'échantillon dans l'instrument au plasma où les éléments sont ionisés. Ensuite, un vide retire les ions à un compteur. Les ions se séparent en fonction de leur poids atomique du plus léger au plus lourd.
   ATTENTION: la collecte des ordures dans ICPMS confinement dangereux et de gérer de manière appropriée pour l'élimination.
7. Assurez-vous que la valeur de coefficient de corrélation (R) de la courbe d'étalonnage pour chaque métal ou de métalloïde est supérieure à ²⁴ 0,995.
8. Lors de l'analyse de l'échantillon, calculer le% R,% D et SPR comme décrit dans les équations 3 à 6 ²⁶ et de comparer les résultats aux projets des critères de qualité de données en 8.3.
   1. Calculer la récupération de pour cent (% R) pour déterminer les pertes / gagnant du laboratoire fortifiée blank (LFB) et les interférences de matrice de la matrice de laboratoire fortifiée (LFM).

2. Calculez la différence de pour cent (% D) afin de déterminer l'évolution des performances de l'instrument avec le temps lors de l'exécution des échantillons de CCV.

3. Calculez la différence de pour cent relative (SPR) pour déterminer les changements dans la méthode de précision avec le temps lors de l'exécution des échantillons expérimentaux.

9. Pour réduire les interférences de la matrice (% R hors des limites acceptables), diluer les échantillons pour mauvaise% R à un rapport de 1: 3 (échantillon: DW).

10. Hg quantification par absorption atomique par vapeur froide spectrophotomètre (CVAAS)

1. Élaborer des normes d'étalonnage le même jour de l'analyse. Diluer norme Hg acheté en ajoutant 1 ml de solution standard Hg acheté à un 100 ml fiole jaugée et remplir avec la solution préparée à l'étape 8.1.
   1. Ajouter 2,5 ml de cette solution dans une fiole jaugée de 100 ml et remplir avec la solution préparée à l'étape 8.1 (cette nouvelle solution est de niveau 7 standard Hg). Ajouter dilué Niveau 7 norme Hg pour fioles jaugées et remplissez avec des espaces (solution préparée dans l'étape 8.1.), Comme décrit dans le tableau 8 (voir acheté Hg Description de solution standard dans le tableau Matériau).

Paramètre	Niveau 1	Niveau 2	Niveau 3	Niveau 4	Niveau 5	Niveau 6
Norme L7 Hg à ajouter (ml)	0	1	2.5	5	20	25
* Le volume final (ml)	-	50	50	50	100	50
La concentration finale (ug / L)	0	0,5	1,25	2.5	5	12,5
* Atteindre ce volume en ajoutant la solution préparée dans l'étape 8.1

Tableau 8: Concentration d'étalon Hg niveaux 1 à 6..

2. Ouvrez le gaz Ar et de la vanne d'air, tourner sur la Absorp atomiquetion spectrophotomètre et l'injection de flux spectroscopie atomique (FIAS). Ouvrez le logiciel CVAAS WinLab, allumer la lampe Hg et laissez-le chauffer jusqu'à ce que le paramètre d'énergie du logiciel atteint 79. Charge le programme pour l'analyse Hg avec les paramètres dans le tableau 9. Réglez le trajet de la lumière dans l'instrument pour donner le facteur de transmission maximale.

Paramètres	Valeurs
Gaz vecteur	L'argon, 100 ml / min
Lampe	Hg lampe à décharge sans électrode, la configuration à 185 mA
Longueur d'ondes	253,7 nm
Fente	0,7 nm
Température de la cellule	100 ° C
Le volume d'échantillon	500 ul
Transporteur	3% de HCl, 9,23 ml / min
Réducteur	10% SnCl 2, 5,31 ml / min
Mesures	Hauteur du pic
Lire répétitions	3

Tableau 9: conditions de fonctionnement de CVAAS.

3. Branchez la ligne à la solution de support en acide 3% de teneur en métaux traces chlorhydrique.
4. Brancher la ligne de la solution d'agent de réduction en 10% de chlorure stanneux (adapté à l'analyse de Hg) dans de l'acide chlorhydrique à 3% de teneur en métaux traces. Préparer cette solution le jour même de l'analyse car elle est sujette à l'oxydation atmosphérique (ATTENTION: le chlorure d'étain est très dangereux, utiliser les vêtements de protection lorsque l'on travaille avec elle Collecter les déchets dans CVAAS confinement dangereux et éliminer correctement.).
5. Placez les normes Hg, QC échantillons et des échantillons expérimentaux dans le rack et CVAAS entrée la séquence dans le logiciel CVAAS WinLab. Exécutez des normes et de fournir l'équation d'étalonnage.
6. Run QC samples et échantillons expérimentaux. Le CVAAS attire environ 5 ml d'échantillon dans l'instrument, réduit le Hg présent dans l'échantillon de Hg élémentaire (Hg ⁰⁾ de gaz et le gaz de purge la solution avec un gaz porteur (Ar) dans un système fermé. La vapeur de mercure traverse une cellule dans le trajet de lumière de la lampe Hg. Un détecteur détermine la lumière absorbée à 253,7 nm et corrélée à la concentration. (ATTENTION: la vapeur de mercure est toxique, assurer instrument hotte est en place).
7. Calculer% R,% D et SPR dans l'étape 9.7 lors de l'analyse et de comparer les résultats aux projets des critères de qualité de données.

Résultats

Les rendements de la biomasse

La production de N. salina PBR dans le système utilisé dans cette étude est passé de 1 g / L ^-1 à 8,5 ± 0,19 g / L ^-1 (n = 12) pour les réacteurs de commande et de 4,0 ± 0,3 g / L ^-1 (n = 12) pour le multi-métal contaminé en 7 jours. Les expériences ont produit des données reproductibles dans des réacteurs en triple et plusieurs lots. Figure 2A montre la densité de culture moyenne à très ...

Discussion

Saline microalgues N. salina peuvent être cultivées avec succès dans le système de croissance conçu avec des résultats reproductibles et des rendements élevés de biomasse. Airlift mélange permis pour une culture en suspension bien mélangée avec un tassement minimal ou encrassement biologique au cours des périodes de croissance de 7 jours. La variabilité de la lumière minimale dans la banque de lumière fluorescente est également indiqué pour ne pas produire des différences notables dans la croi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-500
Sodium meta silicate nonahydrate	Fisher Scientific	S408-500
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
Potassium nitrate	EMD Chemical	PX1520-5
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Ammonium ferric citrate	Fisher Scientific	I72-500
Boric acid	Fisher Scientific	A73-500
Sodium molybdate, dihydrate	EMD Chemical	SX0650-2
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	Z68-500
Cupric sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	C489-500
Biotin	Acros Organics	230090010
Thiamine	Acros Organics	148990100
Vitamin B12	Acros Organics	405920010
Copper (II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	221783-100G	Irritant, Dangerous to the Environment
Lead (II) chloride	Sigma-Aldrich	268690-250G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium dichromate dihydrate	Sigma-Aldrich	398063-100G	Oxidizing, Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Nickel (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	223387-500G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium (meta) arsenite	Sigma-Aldrich	71287	Toxic, Dangerous to the Environment
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908-10G	Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Mercury (II) chloride	Sigma-Aldrich	215465-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Tin (II) chloride dihydrate	Fisher Scientific	T142-500	Corrosive. Suitable for Hg analysis. Very hazardous.
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Vanadium (V) oxide	Acros Organics	206422500	Dangerous to the Environment
Carbon dioxide	Air Liquide	I2301S-1	Compressed
Hydrogen peroxide	H325-500	Fisher Scientific	30% in water
ICP-MS standard	ICP-MS-6020	High Purity Standards
Mercury standard	CGHG1-1	Inorganic Ventures	1000±6 µg/mL in 5% nitric acid
Argon	Air Liquide		Compressed
Helium	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Hydrogen	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Nitric acid	Fisher Scientific	A509-P212	67-70% nitric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A508-P212	35% hydrochloric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Equipment
Scientific prevacuum sterilizer	Steris	31626A	SV-120
Centrifuge	Thermo Fisher	46910	RC-6 Plus
Spectrophotometer	Shimadzu	1867	UV-1800
pH controller	Hanna	BL981411	X4
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-151-SSV	T31Y
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-26-SSV	T35Y
Water bath circulator	Fisher Scientific	13-873-45A
Compact chiller	VWR	13270-120
Freeze dryer	Labconco	7752020
Stir plate	Fisher Scientific	11-100-49S
pH lab electrode	Phidgets Inc	3550
Inductively coupled plasma mass spectrometer	Agilent Technologies	7700 Series ICP-MS	Attached to autosampler CETAC ASX-520
FIAS 100	Perkin Elmer Instruments	B0506520
Atomic absorption spectrometer	Perkin Elmer Instruments	AAnalyst 800
Cell heater (quartz)	Perkin Elmer Instruments	B3120397
Microwave	Milestone		Programmable, maximum power 1,200 W
Microwave rotor	Milestone		Rotor with 24-75 ml Teflon vessels for closed-vessel microwave assisted digestion.
Materials
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-0425
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-1650
0.45 μm syringe filter	Thermo Fisher	F2500-3
Polystyrene tubes	Evergreen	222-2094-050	17 x 100 mm w/cap, 16 ml, polysteryne
Octogonal magnetic stir bars	Fisher scientific	14-513-60	Magnets encased in PTFE fluoropolymer