Quantificação de Metais Pesados ​​e outros contaminantes inorgânicos sobre a produtividade de Microalgas

Resumo

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Resumo

O aumento da demanda por combustíveis renováveis ​​tem pesquisadores que investigam a viabilidade de matérias-primas alternativas, como microalgas. Vantagens inerentes incluem alto potencial de rendimento, a utilização de terras não aráveis ​​e integração com fluxos de resíduos. Os requisitos nutricionais de um sistema de produção em grande escala de microalgas requer o acoplamento de sistemas de cultura com os recursos de resíduos industriais, tais como o dióxido de carbono do gás de combustão e nutrientes de águas residuais. Contaminantes inorgânicos presentes nesses resíduos podem potencialmente levar a bioacumulação na biomassa de microalgas impactar negativamente a produtividade e limitar o uso final. Este estudo centra-se na avaliação experimental do impacto eo destino de 14 contaminantes inorgânicos (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn) em Nannochloropsis crescimento salina . As microalgas foram cultivadas em fotobiorreactores iluminados à 984 umol ^{m-2 s-1} e mantido a pH 7 num crescimento mEDIA poluídos com contaminantes inorgânicos em níveis esperados com base na composição encontrada em sistemas de gases de combustão de carvão comerciais. Os contaminantes presentes na biomassa e o meio no final de um período de crescimento de 7 dias foram quantificados analiticamente através de vapor frio a espectrometria de absorção atómica de Hg e através de espectrometria de massa com plasma de As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn. Os resultados mostram N. salina é uma estirpe sensível ao ambiente multi-metal com uma diminuição estatisticamente na biomassa yieldwith a introdução destes contaminantes. As técnicas aqui apresentados são adequados para quantificar o crescimento de algas e a determinação do percurso dos contaminantes inorgânicos.

Introdução

Em comparação com as culturas tradicionais terrestres microalgas têm sido mostrados para alcançar maior rendimento de biomassa e lipídios, devido à eficiência de conversão de energia solar inerentes mais elevados ^1,2. O cultivo de microalgas em altas taxas de produtividade requer o fornecimento de vários nutrientes, incluindo uma fonte externa de carbono. Espera-se que as instalações de crescimento em grande escala será integrada com correntes de resíduos industriais, tais como gás de combustão industrial, a fim de minimizar os custos de produção e, ao mesmo tempo, proporcionar a recuperação ambiental. De carbono de resíduos industriais é tipicamente na forma de dióxido de carbono gasoso e pode conter contaminantes que têm o potencial para impactar negativamente a produção de microalgas. Especificamente, o gás de combustão proveniente do carvão vai ter uma variedade de contaminantes, incluindo mas não se limitando a produtos de combustão de dióxido de carbono e água, bem como óxidos de enxofre e azoto, pó fino, contaminantes orgânicos, tais como dioxinas e furanos, e con inorgânicotaminants tais como metais pesados. O impacto da maioria destes contaminantes, incluindo compostos inorgânicos com alguns deles conhecidos como metais pesados ​​sobre a produtividade microalgas não tem sido explorado. Alguns destes elementos pode ser nutrientes para as concentrações adequadas, no entanto, em concentrações mais elevadas podem produzir disfunção celular e até mesmo a morte ^3.

A integração de microalgas com gás de combustão industrial tem o potencial para introduzir directamente os contaminantes inorgânicos em meio de crescimento. Gás de combustão com base de carvão tem uma variedade de elementos inorgânicos (por exemplo, As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn) em várias concentrações alguns dos quais, em baixo concentração, representam nutrientes para o crescimento de microalgas. Contaminantes inorgânicos têm uma elevada afinidade para se ligar a microalgas e ainda ser sorvido internamente através de transportadores de nutrientes. Alguns contaminantes inorgânicos (ie, Co, Cu, Zn e Mn) são nutrientes que fazem parte de enzimas envolvemd na fotossíntese, respiração e outras funções de ^3,4. No entanto, em excesso de metais e metalóides podem ser tóxicos. Outros elementos, como Pb, Cd, Sn, Sb, Se, como e Hg, não são conhecidos por suportar a função celular em qualquer concentração e representam metais não-nutrientes que podem afetar negativamente o crescimento ^3,5,6 cultura. A presença de qualquer destes contaminantes tem o potencial de produzir efeitos negativos sobre a função das células de microalgas. Além disso, a interacção de vários metais com microalgas complica dinâmica de crescimento e tem o potencial de influenciar o crescimento.

Economia em larga escala têm sido directamente ligada à produtividade do sistema de cultivo ^7-19. Além disso, reciclar médio no sistema de crescimento de microalgas tanto para tanques abertos de rolamento (ORP) ou fotobiorreatores (PBR) é fundamental uma vez que representa 99,9 e 99,4% da massa, respectivamente ^20. A presença de contaminantes inorgânicos na mídia poderia finalmente limitar microalgae produtividade ea reciclagem de mídia devido à acumulação de contaminantes. Este estudo determinou experimentalmente o impacto de contaminantes inorgânicos 14 (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn), em concentrações esperadas a partir da integração de sistemas de cultivo de microalgas com carvão proveniente do gás de combustão, sobre a produtividade de N. salina crescido em PBRs de transporte aéreo. Os contaminantes usados ​​neste estudo foram mostradas para não só estar presente no gás de combustão à base de carvão, mas à base de resíduos de gases de combustão municipais, do resíduo baseada em gás de combustão, de águas residuais municipais, a água produzida, a água do mar e água subterrânea prejudicada ^21-23. As concentrações usadas neste estudo são baseadas no que seria esperado se a sistemas de crescimento de microalgas foram integrados com uma base de CO ₂ fonte de carvão com uma eficiência de absorção demonstrada em sistemas comerciais de PBR ^20. Cálculos detalhados de apoio as concentrações dos metais pesados ​​e contaminantes inorgânicos estão apresentados na Napanet ai. foram utilizados ²⁴ técnicas analíticas para compreender a distribuição da maioria dos metais nos meios de biomassa, e ambiente. Os métodos apresentados permitiu a avaliação do potencial de produtividade das microalgas sob estresse contaminante inorgânico e quantificação do seu destino final.

Protocolo

Sistema 1. Crescimento

Figura 1. As microalgas sistema de crescimento. (A) rotometer ar, (B) CO ₂ rotometer, (C) controlador de pH com solenóide, (D) registrador de dados, (E) em linha de filtros de ar, (F) cabeçalho de distribuição de ar, (G) banco luz fluorescente, (H) medidores de pH, system (I) arrefecimento, (J) banho de água, (K) fio de termopar, (L) photobioreactor elevador de ar, (M) aquecedor, (N) walk-in de fumos capô, (O) desabafar, (P) de fornecimento de ar tubo capilar, (Q) filtros de ar, (R) tubo de amostragem, (S) tampa PBR silicone, e (T)bem pH na tampa de silicone. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Construa o seguinte sistema de crescimento experimental de microalgas (Figura 1).
   1. Adquirir doze PBRs de transporte aéreo que consistem em reatores tubo de vidro 4,5 centímetros de diâmetro e 80 cm de altura, com uma capacidade de cultivo de 1,1 L com tampa de silicone. Adquirir pré-cortados tubos capilares de vidro (diâmetro externas de 5 mm e 1 mm de diâmetro interno) de 10 cm (3 por PBR) e 85 cm (um por PBR) de comprimento.
   2. Congelar tampas de silicone em um freezer -80 ° C. Lubrificar a broca com glicerol e enquanto tampas são congelados broca três buracos para sediar os de ventilação, de amostragem e de entrega de gás tubos capilares, e um furo de 17 mm de diâmetro para sediar uma sonda de pH.
   3. Inserir os três tubos capilares em lugar com o tubo mais longo que se estende a 2 cm da parte inferior do PBR. No outro tubo capilar adicionar um wi tubo de siliconeth um tubo capilar ligado à outra extremidade que se estende para um ponto de amostragem desejada. Cobrir o buraco para o medidor de pH com um tamanho rolha silicone 21D.
   4. Humidificar o ar ambiente fazendo borbulhar através de água e fornecer o ar humidificado para o cabeçalho de distribuição de ar. Passar o gás através de um filtro de 0,2 um e entregá-lo para a suspensão de algas por meio do tubo capilar mais longa de fornecimento de vidro.
   5. Deliver comprimido CO ₂ para a corrente de ar humidif içado, a fim de manter um pH neutro de 7,0 ± 0,1 na suspensão de cultura. Controlar a taxa de CO ₂ de entrega com um sistema automatizado de dispensário CO ₂ (controlador de pH) que abre um solenóide magnético quando a cultura de algas atinge pH 7.1 e fecha a pH 6,9.
   6. Fornecer luz usando 24 T5 lâmpadas fluorescentes que resultam em uma iluminação média de 984 mol m ^{-2 s-1} semelhante ao pico de condições exteriores.
   7. Mergulhar os PBRs em um banho de água, a fim de manter uma temperatura constante de aproximadamente 25 ° C. Controlar a temperatura do sistema usando um chiller de recirculação e um aquecimento de recirculação de controle automatizado unidade de banho-maria.
   8. Monitorar a temperatura e pH em tempo real e gravar com um registrador de dados.
   9. Certifique-se de que todos os componentes do sistema de crescimento de microalgas estão a funcionar correctamente, especialmente antes da colheita de microalgas inoculo ou preparando contaminantes inorgânicos, pois não podem ser preservadas.

2. Preparação Lab Ware

1. Lave balões volumétricos, PBRs, garrafões e quaisquer recipientes, com sabão e água da torneira. Enxágüe com água deionizada (DW).
2. Ácido lavar a louça laboratório a fim de eliminar quaisquer vestígios de contaminantes inorgânicos. Isto pode ser feito por uma de duas maneiras:
   1. Mergulhe laboratório Ware O / N em 10% de ácido nítrico grau de vestígios metálicos (CUIDADO: Não fumos respiração, ácido nítrico concentrado pode produzir queimaduras severas e fumos tóxicos, o trabalho em um hoo fumed usando luvas de borracha nitrílica, óculos e jaleco).
   2. Mergulhe laboratório mercadorias durante 15 minutos em 50% de vestígios metálicos ácido nítrico grau.
   3. Lavar a louça laboratório com DW completamente pelo menos 3 vezes certificando-se todo o ácido é removido. É crítico que PBRs são cuidadosamente lavados, especialmente os tubos de amostra e os tubos capilares. Não fazer isso irá produzir acidificação da inibição médio e possível de crescimento. Testar o pH da água de lavagem para verificar a todo o ácido tiver sido removido.
   4. Esterilizar PBRS, recipientes e garrafas por autoclavagem-los a 120 ° C e à pressão atmosférica normal, durante pelo menos 30 min.

3. N. salina Médio Preparação

1. Preparação de solução A: Parcialmente encher um balão volumétrico de 1 L com DW. Inserir uma barra de agitação magnética e adicionar os produtos químicos apresentados no Quadro 1, um após o outro. Certifique-se de que cada um dos ingredientes se dissolvam antes da adição do componente seguinte. Remova o ímã e preencher the balão ao 1 L marca de volume.

Componente	Montante a adicionar (g)	A concentração final (g / L)
H 3 BO 3	0,900	0,900
Na 2 MoO 4 · 2H 2 O	0,012	0,012
MnCl2 · 4H 2 O	0,300	0,300
ZnSO 4 7H 2 O ·	0,060	0,060
CuSO 4 5H 2 O ·	0,020	0,020

Tabela 1:. Solução A receita quantidades são quantidades necessárias para a preparação de 1 L de solução concentrada.

2. Preparação da solução de vitamina: Em três vol separadofrascos umetric adicionar as vitaminas como mostrado na Tabela 2. Filtro de cada solução de vitaminas estéril através de um filtro de seringa de 0,2 um para um recipiente estéril. Preservar vitaminas a -4 ° C no escuro.

Vitaminas	Montante (mg)	O volume final (ml)	Vitamina concentração final (mg / L)
Biotina	12.22	500	24.43
A vitamina B12	13.50	100	135,00
Cloridrato de tiamina	977,63	500	1,955.27

Tabela 2:. Vitamina solução receita quantidades são quantidades necessárias para a preparação de solu concentradação.

3. Parcialmente encher um recipiente de 20 L autoclavable com DW e inserir uma barra de agitação magnética. Colocar o recipiente em cima de uma placa de agitação magnética e adicionar os produtos químicos apresentados no Quadro 3 (excepto as vitaminas), adicionando-lhes um após o outro e depois de cada dissolve completamente. Encha o depósito para chegar a 20 L.

Componente	Montante a adicionar ao meio	Unidade
NaCl	350,00	g
CaCl 2 2H 2 O	3.00	g
KCl	9.60	g
Na 2 SiO 3 9H 2 O ·	1.14	g
MgSO 4 7H 2 O ·	29,60	g
KNO 3	20,40	g
KH 2 PO 4	1.36	g
Citrato férrico de amónio	0,10	g
Solução A	20.00	ml
Solução biotina *	818,00	ul
Solução de vitamina B12 *	296,20	ul
Solução de cloridrato de tiamina *	521,60	ul
* Adicione a mídia autoclavado arrefecida

Tabela 3: N. salina receita média. As quantidades são montantes necessários na preparação de 20 L de meio rico em nutrientes.

4. Esteriliza-se o meio em autoclave durante 30 min a 120 ° C e à pressão atmosférica. Deixe o meio cool até à TA.
5. Colocar o recipiente num prato de agitação magnética. Adicione as vitaminas preparados no passo 3.2 e deixar a mistura meio completamente.

4. contaminantes inorgânicos preparação de massa

1. Encher parcialmente os frascos volumétricos indicadas na Tabela 4 com DW e adicionar o sal individuais listados. Encha com DW para o volume final exigida e misture bem. Não preservar estes estoques como alguns elementos adsorver ao balão paredes
   CUIDADO: Vários contaminantes inorgânicos utilizados neste protocolo são cancerígenos, teratogênicos e mutagênico, usar uma máscara, luvas e bata de laboratório ao manusear sais.

Analyte	Fonte de sal	Volume de estoque para preparar (L)	Sal a adicionar ao frasco60; (Sal mg)	Concentração do analito adicionado à cultura (analito mg / L)
Como	NAASO 2	0,1	14,8	7.74E-02
CD	CdCl2	0,5	13,5	1,50E-02
Co	CoCl 2 .6H 2 O	0,5	34,7	1.56E-02
Cr	Na 2 Cr 2 O 7 · 2H 2 O	0,1	40,6	1.29E-01
Cu	CuCl 2 .2H 2 O	0,1	38,3	1,30E-01
Hg	HgCl2	1.0	14,6	9.80E-03
Mn	MnCl 2 .4H 2 O	0,1	58,8	1.49E-01
Ni	NiCl 2 .6H 2 O	0,1	112,0	2.51E-01
Pb	PbCl 2	0,5	39,9	5.41E-02
Sb	Sb 2 O 3	0,5	26,7	4.06E-02
Se	Na 2 SeO 3	0,5	11,8	9.80E-03
Sn	SnCl 2 .2H 2 O	0,5	3.9	3.76E-03
V	V 2 O 5	0,1	22,2	1.13E-01
Zn	ZnCl2	0,1	99,9	4.36E-01

Tabela 4:. Concentrada da preparação contaminantes inorgânicos de adição de 1 ml desta Estoque concentrado ao meio de PBR 1,1 L produz a concentração final mostrada na última coluna.

2. Esterilizar os estoques de contaminantes inorgânicos fazendo passar a solução através de um filtro de seringa estéril de 0,2 ^ m e recolher o filtrado num tubo estéril.

5. N. salina inóculo Produção

1. Em um balão de Erlenmeyer de 500 ml adicionar 200 mL de meio preparado no passo 3 e, em seguida, adicionar 3 g de ágar. Cobrir o balão com folha de alumínio e au toe lave durante 20 min a 120 ° C. Despeje a solução placas de petri estéreis e deixe esfriar até que ela se solidifica. Isso deve ser concluído ser um capuz estéril ou pelo menos perto de uma chama em um ambiente limpo para reduzir o risco de contaminação.
2. Streak N. células em salina estéril petri-dishes preparada no passo 5.1 usando um loop semeadura estéril. Coloque as culturas de petri-prato sobre uma mesa iluminada com luzes T12 mantidos à temperatura ambiente. Deixe crescer até microalgas colônias são visíveis.
3. Colónias de transferência para estéril perplexo frascos Erlenmeyer contendo 200 ml de meio rico em nutrientes preparados no passo 3 e mantê-los em uma mesa agitadora iluminado (1000 RPM). Deixe a cultura crescer até meio se torna verde.
4. Transferir a microalgas a um 1,1 L de PBR estéril. Inserir o PBR num banho de água de inoculo iluminado a 200 umol m ^-2 s ^-1 com luzes fluorescentes T8 e mantida a 23 ° C por um arrefecedor de recirculação e um aquecimento de banho de água recirculante de controlo automatizado. Ajustar o ar e CO ₂ rotometers a 2,5 L min ^-1 e 25 min ^-1 cc, respectivamente.
5. Após uma semana de divisão do crescimento da biomassa em novos PBRs um 0,1 L contendo novo meio e deixá-lo crescer até um total de pelo menos 28 g de peso seco da biomassa sãoobtida entre os dois reactores, que podem ser determinadas através da densidade óptica.
6. Colheita da biomassa de inoculo por centrifugação a 2054 × g durante 15 min a 10 ° C, utilizando frascos de centrífuga estéreis e técnicas estéreis para evitar contaminação. Elimine o sobrenadante e continuar concentração de células, conforme necessário.
7. Uma vez que toda a biomassa é centrifugado, re-suspender as células em 300 ml de meio estéril fresco.
8. Diluir 0,1 mL de cultura de microalgas em 3 ml de DW e depois dilui-se 0,1 ml desta nova solução em 3 ml de DW. Assegurar que a amostra é misturada completamente. Medir a densidade óptica (DO) do concentrado de microalgas a 750 nm () imediatamente utilizando um espectrofotómetro.
9. Use equação (1) para determinar a quantidade de biomassa no concentrado.
   Nota: A equação (1) foi obtida a partir da regressão linear entre a relação sólidos suspensos totais (em g / ^L-1) para N. Salina (R ² = 0,9995). Equação 1 foi desenvolvido para a Spectrophotometer modelo na Tabela de Materiais, gerar uma nova calibração se estiver usando outro modelo espectrofotômetro.
   1. Utilizando a equação (2) calcular o volume de concentrado de microalgas (em L) necessária para se obter uma densidade de 4 g / L ^-1 a cultura num PBR de 1,1 L de volume (em L).

10. Usando técnicas estéreis, adicionar o volume de concentrado de microalgas encontradas no passo 5.9 para um PBR autoclavada para alcançar uma densidade da cultura inicial de 4 g / ^L-1. Preencha PBR com meio a 1,1 L. Repita este passo até 6 PBRs são inoculadas. Coloque os PBRs no banho de água de inóculo.
11. Deixe o microalgas nos PBRs crescer para 8 dias e, em seguida, colher a biomassa (por repetir os passos 5,6-5,7). Repetir o passo 5.8 para calcular o inicialvolume de inoculo para uma cultura de densidade inicial de 1 g / ^L-1.

6. Reatores experimentais

1. Usando técnicas de estéril, adicionar cerca de 1 L de meio preparado no passo 3 para cada um dos 12 PBRs estéreis lavado com ácido. Coloque as PBRs no banho de água do sistema de crescimento experimental. Ligue o ar de aspersão sobre a 1,5 L min ^-1.
2. Esterilizar um medidor de pH calibrado por limpeza com etanol a 70%. Medir o pH do meio no PBR e garantir o pH é de aproximadamente 7,0; se não, repita o passo 2 para eliminar o ácido lixiviado da etapa de lavagem ácida.
3. Calibrar cada controlador de pH utilizando tampão pH 7, desinfectar as sondas usando etanol (70%) e, em seguida, inseri-los nas tampas PBRS.
4. Para cada PBR (exceto os PBRs controle) adicionar 1 ml de cada uma das estéreis contaminantes inorgânicos estoques preparados no passo 4. Deixe os contaminantes misture bem na PBR. A concentração final dos contaminantes inorgânicos na PBRs são mostradosn na última coluna na Tabela 4, e são as concentrações máximas estimadas de esperar de uma integração termelétrica a carvão.
5. Adicionar 14 ml de DW estéril para os PBRs controlo.
6. Adicionar o inoculo microalgas concentrado obtido no passo 5.11 a PBRs os experimentais, de modo a obter uma densidade da cultura inicial de 1 g / ^L-1. Deixe mistura biomassa completamente.
7. Vire alta luzes de intensidade de luz (de 984 mol m ^-2 s ^-1) e controladores de pH e ajustar CO ₂ a 30 cc ¹ min. Aumenta o fluxo de CO ₂ a 50 ^min-1 cc de 3 dias depois. Baixa taxa de fluxo inicial de CO ₂ é crítico a fim de evitar grandes mudanças no pH devido a atrasos na / transferência de líquido e de gás de medição de pH.
8. Medir e recolher amostras conforme necessário. Certifique-se de marcar o nível da água após a amostragem. (ATENÇÃO: alguns contaminantes inorgânicos na PBR são cancerígenos, teratogênicos e mutagênico, luvas de uso e capprecipientes ed ao manusear amostras).
9. Adicionar estéril DW diariamente para os PBRs, a fim de compensar as perdas devido à evaporação.
10. Após 7 dias de crescimento, a colheita da biomassa por centrifugação a 9936 x g e preservar tanto, biomassa e sobrenadante do meio, à temperatura de -80 ° C.
11. Congelar secar a biomassa a 0,1 mbar e -50 ° CO / N. Pó a biomassa (use uma espátula para biomassa em pó no interior do tubo de centrifugação). Preservar biomassa liofilizada a -80 ° C.

7. Digestão de Microondas Assisted Amostras

A digestão das amostras de biomassa é necessária como um passo de pré-processamento para a análise de ICP-MS.
Nota: Essas etapas usam um sistema de digestão por microondas recipiente fechado com alívio de pressão controlada. (CUIDADO: Altas pressões desenvolver durante a digestão ácida, inspecionar a integridade física dos vasos de digestão e escudos, e remodelar as tampas dos vasos de digestão por microondas antes de cada utilização).

1. Lavagem de teflon vasos de digestão microondas com água e sabão, enxaguar com DW e deixe navios de ar seco. Para remover a contaminação de metal traço nos vasos digerir ácido, tal como descrito nas etapas seguintes.
2. Reformular as tampas dos vasos de digestão microondas e fechar os frascos bem.
3. Adicionar 10 ml de ácido nítrico para cada.
4. Introduzir o recipiente na blindagem de segurança. Assegure-se que não biomassa, água ou quaisquer reagentes são deixadas nas paredes da blindagem de segurança ou nas paredes exteriores dos recipientes de digestão, a fim de evitar danos para a protecção de segurança. Tampe o escudo de segurança com a válvula de segurança para garantir que a mola no frasco é flush. Localize o escudo no rotor com as aberturas de ventilação da tampa apontando para fora na fila exterior e para o interior na linha interior.
5. Em número um navio, inserir a bainha cerâmica e do sensor de temperatura. Este termómetro monitora a temperatura interna real dentro do recipiente e serve como o parâmetro de controlo para executar o progr digestãosou. Assegure-se que um número frasco contém as mesmas quantidades de reagente e de amostra como os outros frascos.
6. De entrada dos parâmetros de digestão mostrado na Tabela 5 e iniciar a digestão. Quando o programa terminar, ar arrefecer os frascos até atingirem RT.

Passo	Frascos de lavagem			Amostra digestão
	Temperatura (° C)	Tempo (min)	Max. de energia (W)	Temperatura (° C)	Tempo (min)	Max. de energia (W)
1	RT para 190	25	1000	RT para 180	15	1000
2	190	10	1000	180	15	1000
Escape	-	20	-	-	20	-

Tabela 5: Parâmetros utilizados no programa de digestão por microondas.

7. Dentro de um exaustor, inserir a ferramenta de alívio de pressão na tampa do protetor com as aberturas de capitalização apontam longe de você. Uma vez que a pressão é liberada aberta a tampa (ATENÇÃO: frascos digeridos sempre abertos dentro exaustor desde a digestão de biomassa usando ácido produz vapores tóxicos).
8. Eliminar o ácido. Lave os recipientes em Teflon com DW 3 vezes. Vamos frascos de ar seco.
9. Para digerir a biomassa, adicionar 50 mg de liofilizado de biomassa para recipientes de digestão de microondas. Para o controlo de qualidade (CQ) preparar as seguintes: ampolas em dois frascos diferentes ou adicionar 5 ml de Nível 7 ICPMS ou 5 ml de nível padrão 7 Hg CVAAS preparado nos passos 9.1 e 10.1 (a solução digerido deste frasco é chamado o laboratório fortificada branco (LFB)), deixe outro vazio (a solução digerida frascoa partir deste frasco é chamado o reagente de laboratório em branco (LRB)).
10. Para digerir meio, adicionar 10 ml de meio sobrenadante para secar ácido enxaguado recipientes de digestão microondas. Para controle de qualidade (QC) preparar os seguintes: Em frascos dois frascos diferentes adicionar 5 ml de Nível 7 ICPMS ou CVAAS padrão metálico processadas no passo 9.1 e 10.1 (a solução digerida a partir deste frasco é chamado o LFB), para outro frasco, adicionar 10 ml de DW (a solução digerida a partir deste frasco é chamado o LRB).
11. Reformular as tampas dos vasos de digestão microondas e fechar os frascos bem.
12. Adicionar 7 ml de ácido nítrico concentrado traço grau de metal e 3 ml de peróxido de hidrogênio a cada frasco. Homogeneizar os conteúdos rodando suavemente a solução. Digerir o conteúdo dos frascos, repetindo os passos 7,4-7,7 (utilizar os parâmetros de digestão de microondas para a digestão das amostras na Tabela 5).
13. Adicionar amostra digerida para um balão volumétrico de 25 mL, enxaguar os vasos com DW para aumentar a recuperação. Encher o balão volumétrico com DWpara a marca.
14. Transferência digerido amostras para um recipiente tapado. Preservar as amostras a 4 ° C até que a análise pode ser concluído. Para esta análise estudo é feito no mesmo dia para Hg e no prazo de três dias para os outros elementos.

8. Controle de Qualidade (CQ) Amostras

Nota: a análise de amostras de QC, a fim de garantir a fiabilidade dos resultados das amostras experimentais.

1. Encha parcialmente um ácido lavado balão volumétrico de 1 L com DW. Adicione 280 ml de ácido nítrico concentrado traço grau de metal e misture bem (esta solução é também chamada de solução em branco) (ATENÇÃO: adicionar sempre o ácido à água, nunca adicionar água ao ácido como a reação exotérmica pode ser violento). Vamos solução legal para RT.
2. Em adição às amostras de QC preparados nos passos 7.9 e 7.10, preparar as seguintes amostras de QC.
   1. Para a verificação da calibração contínua (CCV): Encha um tubo de poliestireno com padrão de calibração (para a preparação verpasso 9.2 e 10.1). Coloque a solução padrão de Hg na prateleira CVAAS e os ICPMS solução padrão no amostrador automático ICPMS.
   2. Para a calibragem contínua em branco (CCB): encher dois tubos de poliestireno (16 ml) com o (solução preparada no passo 8.1) em branco. Coloque uma amostra no rack CVAAS e outra amostra no amostrador automático ICPMS.
   3. Para a matriz fortificada com laboratório (LFM): aleatoriamente escolher uma amostra de cada 12 amostras para cada tipo de amostra (ou seja, biomassa ou médio) e usá-lo para preparar um LFM. Para ICPMS, adicionar 0,5 ml de ICPMS nível padrão 7 e 3 ml de amostra experimental digerido (a partir de qualquer biomassa ou forma) para um tubo de poliestireno.
   4. Misturar o conteúdo e colocar os frascos no amostrador automático ICPMS. Para CVAAS, adicionar 2 ml Hg Nível padrão 7 e 6 ml de amostra experimental digerido (a partir de qualquer biomassa ou médio) para um tubo de poliestireno. Misturar o conteúdo e colocar frascos na prateleira CVAAS.
   5. Para as amostras duplicadas: aleatoriamente escolher uma amostra de cada vezy 12 amostras para cada tipo de matriz (por exemplo, biomassa, médio, LFM ou qualquer matriz diluída) e duplicar o frasco. Colocar os tubos utilizadas na autosampler ICPMS ou o rack CVAAS.
   6. Para as amostras duplicadas: aleatoriamente escolher uma amostra de cada 12 amostras para cada tipo de matriz (por exemplo, biomassa, médio, LFM ou qualquer matriz diluída) e duplicar o frasco. Colocar os tubos utilizadas na autosampler ICPMS ou o rack CVAAS.
3. Definir os critérios de qualidade de dados para o estudo. Para o presente estudo duplicar os critérios de qualidade estabelecidos pela Eaton, Clesceri, Arroz e Greenberg ^25. Os parâmetros estabelecidos para o QC são: diferença percentual (% D) para CCV dentro de ± 10% ²⁵ (com exceção de Pb e Sb, ver discussão), LFB por cento de recuperação (R%) dentro de ± ^25% 70-130, cento LFM recuperação (% R) dentro de 75-125% ^25, e relativo diferença percentual (RPD) dentro de ± 20% ^25, e uma ca contínualibração em branco (CCB) abaixo do limite de método de comunicação (LMR) ^25. Veja as equações de cálculo no passo 9.7.

9. Quantificação por plasma indutivamente acoplado Espectrometria de Massa (ICPMS)

1. No dia da análise, transferir aproximadamente 5 ml de amostra digerida para tubos de poliestireno e colocá-los no amostrador automático ICPMS. Adicionar cerca de 15 ml de amostras digeridas para tubos de poliestireno e colocá-los no bastidor CVAAS.
2. No mesmo dia da análise, preparar os padrões de calibração. Adicionar ICPMS compraram solução padrão e reabastecer com espaço em branco (solução preparada no passo 8.1) conforme descrito na Tabela 6 (ver descrição da solução padrão na Tabela Material) para frascos volumétricos lavado com ácido.

Parâmetro	Nível 1	Nível 2	Nível 3	Nível 4	Nível 5	Nível 6	Nível 7
Comprado padrão a ser adicionado (ml)	-	-	-	-	-	-	10,0
Nível 7 a ser adicionado (ml)	0.0	1.0	2.5	5	20,0	25,0	-
O volume final * (ml)	-	50,0	50,0	50,0	100.0	50,0	100.0
A concentração final (g / L)
75 Como	0.0	2.0	5	10,0	20,0	50,0	1000,0
111 Cd	0.0	1.0	2.5	5	10,0	25,0	50,0
59 Co	0.0	10,0	25,0	50,0	100.0	250,0	500.0
52 Cr	0.0	2.0	5	10,0	20,0	50,0	100.0
63 Cu	0.0	5	12,5	25,0	50,0	125,0	250,0
55 Mn	0.0	3.0	7,5	15,0	30,0	75,0	150,0
60 Ni	0.0	8	20,0	40,0	80,0	200,0	400,0
208 Pb	0.0	1.0	2.5	5	10,0	25,0	50,0
121 Sb	0.0	12,0	30,0	60,0	120.0	300,0	600.0
51 V	0.0	10,0	25,0	50,0	100.0	250,0	500.0
66 Zn	0.0	4	10,0	20,0	40,0	100.0	200,0
* Atingir este volume por adição da solução preparada no passo 8.1

Tabela 6: Concentração de padrões de calibração Níveis 1-7..

3. Remover os cones dos ICPMS e sonicar-los durante 1 min em DW. Secar os cones e colocá-los de volta no instrumento.
4. Ligue o refrigerador de água, gases (ar, H _2, He), o ICPMS, linhas de plug para padrão interno, e encher os recipientes amostrador automático de enxágüe (DW, ácido nítrico 10%, + ácido clorídrico ácido nítrico 1% a 0,5%) .
5. Abra o software Workstation MassHunter e ligue o plasma, sintonizar o ICPMS e carregar o método definido como parâmetros na Tabela 7.

Parâmetros	Valores
Padrões internos	72 Ge, 115 In
Potência de RF	1.500 W
Taxa de fluxo de gás de plasma	14.98
Taxa de fluxo de gás nebulizador	/ Min 1.1 L (transportador e diluição de gás combinado - 0,6 + 0,5 L / min)
Amostragem cone	Níquel para x lente
Cone Skimmer	Níquel
Taxa de captação de amostra	0,3 rps
Bomba de nebulizador	0,1 rps
S temperatura / C	2 ° C
Condição de digitalização	O tempo de permanência de 1 segundo, o número de repetição 3
H 2 fluxo de gás	N / D
Ele fluxo de gás	4,3 ml / min

Quadro 7: condições de operação ICPMS.

6. Coloque padrão de calibração, amostras de CQ e amostras experimentais no amostrador automático. No software ICPMS adicionar a análise de sequência e analisar as amostras. Aspirar a amostra no interior do instrumento para o plasma, onde os elementos são ionizados. Depois, um vácuo retira os iões para um contador. Os íons vai separar em função do seu peso atômico do mais leve ao mais pesado.
   CUIDADO: Recolha de resíduos ICPMS em contenção perigosos e lidar de forma adequada para a eliminação.
7. Assegure-se que o valor do coeficiente de correlação (r) para a curva de calibração para cada metal ou metalóide é maior do que 0.995 ^24.
8. Durante a análise da amostra, calcule% R, D% e RPD como descrito nas equações 3-6 ²⁶ e comparar os resultados com os critérios de qualidade de dados do projeto em 8.3.
   1. Calcule recuperação por cento (% R) para determinar as perdas / ganhando do laboratório fortificada blank (LFB) e matriz interferência de matriz fortificados com laboratório (LFM).

2. Calcular diferença percentual (% D) para determinar alterações de desempenho instrumento com o tempo ao executar amostras CCV.

3. Calcular diferença percentual relativa (RPD) para determinar alterações no método de precisão com o tempo ao executar amostras experimentais.

9. Para reduzir a interferência de matriz (R% fora do intervalo aceitável), diluir as amostras para pobre% R a uma proporção de 1: 3 (exemplo: DW).

10. Hg quantificação por Vapor Frio espectrofotômetro de absorção atômica (CVAAS)

1. Prepare padrões de calibração o mesmo dia de análise. Diluir padrão Hg comprado pela adição de 1 ml de solução padrão de Hg comprada a um balão volumétrico de 100 ml e encher com a solução preparada no passo 8.1.
   1. Adicionar 2,5 ml desta solução para um balão volumétrico de 100 ml e encher com a solução preparada no passo 8.1 (esta nova solução é Nível 7 padrão Hg). Adicionar diluído Nível 7 padrão Hg para frascos volumétricos e encher com branco (solução preparada no passo 8.1.) Como descrito na Tabela 8 (ver comprado Hg descrição da solução padrão na Tabela de Materiais).

Parâmetro	Nível 1	Nível 2	Nível 3	Nível 4	Nível 5	Nível 6
L7 Hg padrão a ser adicionado (ml)	0	1	2.5	5	20	25
O volume final * (ml)	-	50	50	50	100	50
A concentração final (g / L)	0	0,5	1.25	2.5	5	12,5
* Atingir este volume por adição da solução preparada no passo 8.1

Tabela 8: Concentração de padrão de calibração Hg Níveis 1-6..

2. Abra o gás Ar e válvula de ar, ligue o Absorp Atómicação espectrofotômetro eo Flow Injection Espectroscopia Atômica (FIAS). Abra o software CVAAS Winlab, ligue a lâmpada Hg e deixe aquecer até que o parâmetro de energia do software chega a 79. Coloque o programa para análise de Hg com os parâmetros no Quadro 9. Ajuste o caminho da luz no instrumento para dar a transmitância máxima.

Parâmetros	Valores
Gás de arrastamento	Árgon, 100 ml / min
Lâmpada	Hg lâmpada de descarga sem eletrodo, a instalação a 185 mA
Comprimento De Onda	253,7 nm
Fenda	0,7 nm
Temperatura da célula	100 ° C
Volume da amostra	500 ul
Suporte	HCl a 3%, 9,23 ml / min
Redutor	10% de SnCl 2, 5,31 mL / min
Medição	Altura do pico
Leia repetições	3

Tabela 9: condições operacionais CVAAS.

3. Ligue a linha para a solução transportadora feita de 3% de ácido clorídrico de grau traço metal.
4. Ligar a linha para a solução de agente redutor feito de 10% de cloreto estanoso (adequado para análise de Hg) em ácido clorídrico a 3% de grau de vestígios metálicos. Preparar esta solução no mesmo dia da análise, pois é propenso a oxidação atmosférica (ATENÇÃO: cloreto de estanho é muito perigoso, usar vestuário de proteção ao trabalhar com ele Recolha de resíduos perigosos CVAAS no confinamento e descartar adequadamente.).
5. Coloque os padrões de Hg, amostras de CQ e amostras experimentais no rack CVAAS e de entrada a seqüência no software CVAAS Winlab. Executar padrões e gerar a equação de calibração.
6. Run QC samples e amostras experimentais. O CVAAS chama aproximadamente 5 ml de amostra dentro do instrumento, reduz o Hg presente na amostra para elementar Hg (Hg ⁰⁾ gás e purga do gás a partir da solução com um gás portador (Ar) em um sistema fechado. O vapor de Hg passa por uma célula no caminho da luz da lâmpada Hg. Um detector determina a luz absorvida a 253,7 nm e correlaciona-se que a concentração. (ATENÇÃO: Hg vapor é tóxico, garantir exaustor instrumento está no lugar).
7. Calcular% R, D e RPD% no passo 9.7 durante a análise e comparar os resultados com os critérios de qualidade de dados do projeto.

Resultados

Produção de biomassa

Produção de N. Salina no sistema PBR utilizado neste estudo cresceram a partir de 1 g / ^L-1 a 8,5 ± 0,19 g / ^L-1 (N = 12) aos reactores de controlo e de 4,0 ± 0,3 g / ^L-1 (N = 12) para o multi-metálica contaminada em 7 dias. Os experimentos produziram dados reproduzíveis através de reatores em triplicado e vários lotes. A Figura 2A mostra a densidade média cultura, com muito pequeno erro padrão com ba...

Discussão

Saline microalgas N. salina pode ser cultivada com sucesso no sistema de crescimento projetado com resultados reprodutíveis e rendimentos elevados de biomassa. Airlift mistura permitiu uma cultura bem misturado suspenso com assentamento mínima ou incrustação biológica ao longo dos períodos de crescimento de 7 dias. A variabilidade luz mínima em todo o banco de luz fluorescente também é mostrado para não produzir diferenças notáveis ​​no crescimento.

O estudo mostra h...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-500
Sodium meta silicate nonahydrate	Fisher Scientific	S408-500
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
Potassium nitrate	EMD Chemical	PX1520-5
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Ammonium ferric citrate	Fisher Scientific	I72-500
Boric acid	Fisher Scientific	A73-500
Sodium molybdate, dihydrate	EMD Chemical	SX0650-2
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	Z68-500
Cupric sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	C489-500
Biotin	Acros Organics	230090010
Thiamine	Acros Organics	148990100
Vitamin B12	Acros Organics	405920010
Copper (II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	221783-100G	Irritant, Dangerous to the Environment
Lead (II) chloride	Sigma-Aldrich	268690-250G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium dichromate dihydrate	Sigma-Aldrich	398063-100G	Oxidizing, Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Nickel (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	223387-500G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium (meta) arsenite	Sigma-Aldrich	71287	Toxic, Dangerous to the Environment
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908-10G	Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Mercury (II) chloride	Sigma-Aldrich	215465-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Tin (II) chloride dihydrate	Fisher Scientific	T142-500	Corrosive. Suitable for Hg analysis. Very hazardous.
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Vanadium (V) oxide	Acros Organics	206422500	Dangerous to the Environment
Carbon dioxide	Air Liquide	I2301S-1	Compressed
Hydrogen peroxide	H325-500	Fisher Scientific	30% in water
ICP-MS standard	ICP-MS-6020	High Purity Standards
Mercury standard	CGHG1-1	Inorganic Ventures	1000±6 µg/mL in 5% nitric acid
Argon	Air Liquide		Compressed
Helium	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Hydrogen	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Nitric acid	Fisher Scientific	A509-P212	67-70% nitric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A508-P212	35% hydrochloric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Equipment
Scientific prevacuum sterilizer	Steris	31626A	SV-120
Centrifuge	Thermo Fisher	46910	RC-6 Plus
Spectrophotometer	Shimadzu	1867	UV-1800
pH controller	Hanna	BL981411	X4
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-151-SSV	T31Y
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-26-SSV	T35Y
Water bath circulator	Fisher Scientific	13-873-45A
Compact chiller	VWR	13270-120
Freeze dryer	Labconco	7752020
Stir plate	Fisher Scientific	11-100-49S
pH lab electrode	Phidgets Inc	3550
Inductively coupled plasma mass spectrometer	Agilent Technologies	7700 Series ICP-MS	Attached to autosampler CETAC ASX-520
FIAS 100	Perkin Elmer Instruments	B0506520
Atomic absorption spectrometer	Perkin Elmer Instruments	AAnalyst 800
Cell heater (quartz)	Perkin Elmer Instruments	B3120397
Microwave	Milestone		Programmable, maximum power 1,200 W
Microwave rotor	Milestone		Rotor with 24-75 ml Teflon vessels for closed-vessel microwave assisted digestion.
Materials
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-0425
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-1650
0.45 μm syringe filter	Thermo Fisher	F2500-3
Polystyrene tubes	Evergreen	222-2094-050	17 x 100 mm w/cap, 16 ml, polysteryne
Octogonal magnetic stir bars	Fisher scientific	14-513-60	Magnets encased in PTFE fluoropolymer