Quantificazione dei metalli pesanti e altri contaminanti inorganici sulla produttività delle microalghe

Riepilogo

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Abstract

La crescente domanda di carburanti rinnovabili ha ricercatori che studiano la fattibilità di materie prime alternative, come microalghe. Vantaggi intrinseci includono ad alto rendimento potenziale, l'uso di terreni non coltivabili e l'integrazione con i flussi di rifiuti. Le esigenze nutrizionali di un sistema di produzione di microalghe su larga scala richiederà l'accoppiamento dei sistemi di coltivazione con le risorse dei rifiuti industriali, come l'anidride carbonica dai gas di scarico e le sostanze nutrienti dalle acque reflue. Contaminanti inorganici presenti in tali rifiuti possono potenzialmente portare a bioaccumulo in biomassa microalgale impatto negativo dell'uso finale produttività e limitante. Questo studio si concentra sulla valutazione sperimentale dell'impatto e il destino di 14 contaminanti inorganici (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn) sulla crescita salina Nannochloropsis . Le microalghe sono state coltivate in fotobioreattori illuminato di 984 mmol ^m-2 sec ^-1 e mantenuta a pH 7 in una crescita del media inquinata con contaminanti inorganici a livelli previsti basato sulla composizione si trovano in sistemi di gas di scarico del carbone commerciali. Contaminanti presenti nella biomassa e mezzo alla fine di un periodo di crescita del 7 giorno erano analiticamente quantificate mediante vapore freddo spettrometria ad assorbimento atomico per Hg e mediante spettrometria di massa ad accoppiamento induttivo plasma per As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn. I risultati mostrano N. salina è un ceppo sensibile all'ambiente multi-metallo con una diminuzione statistica della biomassa yieldwith l'introduzione di questi contaminanti. Le tecniche qui presentate sono adeguate per quantificare la crescita delle alghe e determinare il destino di contaminanti inorganici.

Introduzione

Rispetto alle colture tradizionali terrestri microalghe hanno dimostrato di ottenere biomassa e lipidi rendimenti più elevati a causa intrinseche elevate efficienze di conversione solare ^1,2. La coltivazione di microalghe ad alti tassi di produttività richiede la fornitura di vari nutrienti, tra cui una fonte di carbonio esterna. Si prevede che le strutture di crescita grandi saranno integrati con flussi di rifiuti industriali quali fumi industriali per minimizzare i costi di produzione e allo stesso tempo fornire bonifica ambientale. Carbonio Rifiuti industriali è in genere sotto forma di anidride carbonica gassosa e può contenere contaminanti che hanno il potenziale per avere un impatto negativo la produzione di microalghe. Specificamente, fumi derivati ​​dal carbon avrà una varietà di contaminanti inclusi ma non limitati a prodotti di combustione di acqua e biossido di carbonio, nonché ossidi di zolfo e azoto, polveri sottili, contaminanti organici come diossine e furani, e con inorganicocontaminanti quali i metalli pesanti. L'impatto della maggior parte di questi contaminanti inorganici compresi con alcuni di essi noto come metalli pesanti sulla produttività microalghe non sono stati esplorati. Alcuni di questi elementi possono essere nutrienti a concentrazioni appropriate, ma a concentrazioni più elevate si possono produrre disfunzione delle cellule e persino la morte ^3.

L'integrazione di microalghe con fumi industriali ha il potenziale per introdurre direttamente contaminanti inorganici in terreni di coltura. Fumi base di carbone ha una varietà di elementi inorganici (ad esempio, As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn) a varie concentrazioni alcune delle quali, in basso concentrazione, rappresentano elementi nutritivi per la crescita di microalghe. Contaminanti inorganici hanno una alta affinità per legare di microalghe e in seguito essere sorbita internamente attraverso trasportatori di nutrienti. Alcuni contaminanti inorganici (cioè, Co, Cu, Zn e Mn) sono nutrienti che fanno parte di enzimi coinvolgonod nella fotosintesi, la respirazione e altre funzioni ^3,4. Tuttavia, in eccesso metalli e metalloidi possono essere tossici. Altri elementi, come il Pb, Cd, Sn, Sb, Se, As e Hg, non sono noti per sostenere la funzione delle cellule in qualsiasi concentrazione e rappresentano metalli non-nutrienti che possono influire negativamente sulla crescita della cultura ^3,5,6. La presenza di uno qualsiasi di questi contaminanti ha il potenziale per produrre effetti negativi sulla funzione cellulare microalghe. Inoltre, l'interazione di metalli multipli con microalghe complica dinamiche di crescita e ha il potenziale di impatto di crescita.

Economia su larga scala sono stati direttamente collegati alla produttività del sistema di coltivazione ^7-19. Inoltre, ricicla medie del sistema di crescita di microalghe sia per vasche all'aperto raceway (ORP) o fotobioreattori (PBR) è fondamentale in quanto rappresenta il 99,9 e il 99,4% della massa, rispettivamente, ^20. La presenza di contaminanti inorganici in media potrebbe infine limitare mproduttività icroalgae e il riciclo dei media a causa di accumulo di contaminanti. Questo studio ha determinato sperimentalmente l'impatto di 14 contaminanti inorganici (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V e Zn), a concentrazioni attese dall'integrazione dei sistemi di coltivazione di microalghe con carbone derivato fumi, sulla produttività di N. salina coltivate in PBRs trasporto aereo. I contaminanti utilizzati in questo studio hanno dimostrato di non essere presente solo in fumi a carbone ma basato rifiuti urbani fumi, biosolids basata fumi, acque reflue urbane, acqua prodotta, sotterranee compromessa e l'acqua di mare ^21-23. Le concentrazioni utilizzate in questo studio si basano su ciò che ci si aspetterebbe se sistemi di crescita delle microalghe sono stati integrati con una base di CO ₂ di origine carbone con un'efficienza assorbimento dimostrata in sistemi PBR commerciali ^20. Calcoli dettagliati che supportano le concentrazioni dei metalli pesanti e contaminanti inorganici sono presentati in napanet al. sono stati usati ²⁴ tecniche analitiche per comprendere la distribuzione della maggior parte dei metalli nelle biomasse, media e ambiente. I metodi presentati hanno consentito la valutazione del potenziale di produttività delle microalghe sotto inorganico sforzo contaminanti e la quantificazione del loro destino finale.

Protocollo

Sistema 1. Crescita

Figura 1. Microalghe sistema di crescita. (A) rotometer aria, (B) di CO ₂ rotometer, (C) Regolatore pH con solenoide, (D) data logger, (E) filtri in linea d'aria, (F) un colpo di testa di distribuzione dell'aria, (G) banca luce fluorescente, (H) misuratori di pH, sistema di (I) di raffreddamento, (J) bagno d'acqua, (K) filo termocoppia, (L) ponte aereo fotobioreattore, (M) di riscaldamento, (N) cabina fumi cappa, (O) sfiato, (P) di mandata aria capillare, (Q) filtri aria, (R) tubo di campionamento, (S) coperchio di silicone PBR, e (T)pH bene nel coperchio di silicone. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Creare il seguente microalghe sistema di crescita sperimentale (Figura 1).
   1. Acquisire dodici PBRs trasporto aereo, comprensivi di reattori di tubo di vetro 4,5 centimetri di diametro e 80 cm di altezza, con una capacità di coltivazione di 1,1 L con coperchio di silicone. Acquisire tubi pretagliati capillari di vetro (da 5 mm di diametro esterno e di 1 mm di diametro interno) di 10 cm (3 per PBR) e 85 centimetri (1 per PBR) di lunghezza.
   2. Congelare coperchi di silicone in una -80 ° C freezer. Lubrificare una punta con glicerolo e mentre coperchi sono congelati fare 3 buchi per ospitare i tubi capillari di sfiato, di campionamento e di erogazione del gas e 1 foro di diametro 17 mm a ospitare una sonda pH.
   3. Inserire i tubi capillari 3 in luogo con il tubo più lungo che si estende a 2 cm dalla parte inferiore del PBR. Nell'altra capillare aggiungere un tubo di silicone with un tubo capillare attaccato all'altra estremità che si estende ad un punto di campionamento desiderata. Coprire il foro per il pHmetro con un tappo in silicone 21D.
   4. Umidificare aria ambiente facendolo gorgogliare attraverso l'acqua e fornire l'aria umidificata al collettore di distribuzione dell'aria. Far passare il gas attraverso un filtro da 0,2 micron e consegnarlo alla sospensione algale attraverso il capillare di vetro consegna più lunga.
   5. Invia CO ₂ compressa nel flusso d'aria umidificata per mantenere un pH neutro di 7,0 ± 0,1 nella sospensione cultura. Controllare il tasso di CO ₂ di consegna con un (pH controller) automatizzato di CO ₂ Sistema dispensario che apre un solenoide magnetico quando la coltura di alghe raggiunge pH 7.1 e chiude a pH 6.9.
   6. Fornire luce utilizzando 24 T5 lampade fluorescenti che si traducono in una illuminazione media di 984 mmol ^m-2 sec ^-1 simile a picco condizioni esterne.
   7. Immergere le PBRs in un bagno d'acqua, al fine di mAINTAIN una temperatura costante di circa 25 ° C. Controllare la temperatura del sistema utilizzando un refrigeratore ricircolo e di un riscaldamento ricircolo bagnomaria controllo automatizzato unità.
   8. Monitorare la temperatura e pH in tempo reale e registrare con un registratore di dati.
   9. Assicurarsi che tutti i componenti del sistema di crescita microalghe siano correttamente lavorando, in particolare prima della raccolta microalghe inoculo o preparazione contaminanti inorganici in quanto non possono essere conservati.

2. Lab Ware Preparazione

1. Lavare palloni volumetrici, PBR, damigiane e contenitori, con acqua di rubinetto e sapone. Risciacquare con acqua deionizzata (DW).
2. Acid sciacquare la ware laboratorio per eliminare eventuali tracce di contaminanti inorganici. Questo può essere fatto da uno dei due modi:
   1. Mettere a bagno / N a 10% di acido nitrico grado metalli in tracce laboratorio ware O (ATTENZIONE: non respirare i fumi, acido nitrico concentrato in grado di produrre gravi ustioni e fumi tossici, il lavoro in una hoo fumid utilizzando guanti di nitrile, occhiali e camice da laboratorio).
   2. Mettere a bagno laboratorio ware per 15 minuti nel 50% dei metalli in tracce di acido nitrico grado.
   3. Sciacquare la merce laboratorio con DW accuratamente almeno 3 volte facendo attenzione tutto l'acido viene rimosso. E 'fondamentale che PBRs siano risciacquati a fondo, in particolare i tubi di campionamento e tubi capillari. In caso contrario questo produrrà acidificazione dell'inibizione media e possibile di crescita. Verificare il pH dell'acqua di risciacquo per verificare tutte acido è stato rimosso.
   4. Sterilizzare PBRs, contenitori e flaconi da loro autoclave a 120 ° C e pressione atmosferica standard per almeno 30 min.

3. N. salina Media Preparazione

1. Preparazione della soluzione A: Riempire parzialmente un pallone tarato da 1 l con DW. Inserire una ancoretta magnetica e aggiungere i prodotti chimici riportati nella Tabella 1, uno dopo l'altro. Assicurarsi che ogni ingrediente dissolve prima dell'aggiunta del componente successivo. Rimuovere il magnete e riempire °e a segno volume di 1 l.

Componente	Importo da aggiungere (g)	Concentrazione finale (g / L)
H 3 BO 3	0.900	0.900
Na 2 MoO 4 · 2H 2 O	0.012	0.012
MnCl 2 · 4H 2 O	0.300	0.300
ZnSO4 · 7H 2 O	0.060	0.060
CuSO 4 · 5H 2 O	0,020	0,020

Tabella 1:. Soluzione A ricetta quantità sono importi necessari per la preparazione di 1 L di soluzione concentrata.

2. Preparazione della soluzione di vitamina: In tre vol separataboccette umetric aggiungono le vitamine come mostrato nella Tabella 2. Filtro ciascuna soluzione vitamina attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron sterile in un contenitore sterile. Conserva vitamine a -4 ° C al buio.

Vitamine	Importo (mg)	Volume finale (mL)	Concentrazione di vitamina finale (mg / L)
Biotina	12.22	500	24.43
La vitamina B12	13.50	100	135.00
Cloridrato di tiamina	977,63	500	1,955.27

Tabella 2:. Vitamina soluzione ricetta quantità sono importi necessari per la preparazione di solu concentratozione.

3. Parzialmente riempire un contenitore autoclavabile 20 L con DW e inserire un bastoncino magnetico. Posizionare il contenitore sulla sommità di una piastra di agitatore magnetico e aggiungere sostanze chimiche mostrati nella Tabella 3 (ad eccezione delle vitamine), aggiungendo una dopo l'altra e dopo ogni dissolve completamente. Riempire il contenitore per raggiungere 20 L.

Componente	Importo da aggiungere al mezzo	Unità
NaCl	350.00	g
CaCl 2 · 2H 2 O	3.00	g
KCl	9.60	g
Na 2 SiO 3 · 9H 2 O	1.14	g
MgSO4 · 7H 2 O	29.60	g
KNO 3	20.40	g
KH 2 PO 4	1.36	g
Ammonio citrato ferrico	0.10	g
Soluzione A	20.00	ml
Soluzione biotina *	818.00	pl
Soluzione di vitamina B12 *	296,20	pl
Soluzione di cloridrato di tiamina *	521,60	pl
* Aggiungere ai media autoclavato raffreddato

Tabella 3: N. salina medio ricetta. Le quantità sono gli importi necessari per la preparazione di 20 L di media ricchi di nutrienti.

4. Sterilizzare il mezzo in autoclave per 30 minuti a 120 ° C e pressione atmosferica. Lasciate che il mezzo di cool fino a RT.
5. Posizionare il contenitore su una piastra agitatore magnetico. Aggiungere le vitamine previste al punto 3.2 e lasciare a fondo il medio impasto.

4. contaminanti inorganici magazzino di preparazione

1. Riempire parzialmente le matracci indicati nella tabella 4 con DW e aggiungere il sale individuo elencato. Riempire con DW al volume finale richiesto e mescolare accuratamente. Non conservare queste popolazioni a partire alcuni elementi aderire a pallone pareti
   ATTENZIONE: Molti contaminanti inorganici utilizzati nel presente protocollo sono cancerogeni, teratogeni e mutageni, indossare una maschera di protezione, guanti e camice da laboratorio quando si maneggiano i sali.

Analita	Fonte Salt	Volume di azione per preparare (L)	Sale da aggiungere al pallone60; (Sale mg)	Concentrazione dell'analita aggiunto alla coltura (analita mg / L)
Come	NAASO 2	0.1	14.8	7.74E-02
CD	CdCl 2	0.5	13.5	1.50E-02
Co	CoCl 2 .6H 2 O	0.5	34.7	1.56E-02
Cr	Na 2 Cr 2 O 7 · 2H 2 O	0.1	40.6	1.29E-01
Cu	CuCl 2 .2H 2 O	0.1	38.3	1.30E-01
Hg	HgCl2	1.0	14.6	9.80E-03
Mn	MnCl 2 .4H 2 O	0.1	58,8	1.49E-01
Ni	NiCl 2 .6H 2 O	0.1	112.0	2.51E-01
Pb	PbCl 2	0.5	39.9	5.41E-02
Sb	Sb 2 O 3	0.5	26.7	4.06E-02
Se	Na 2 SEO 3	0.5	11.8	9.80E-03
Sn	SnCl 2 .2H 2 O	0.5	3.9	3.76E-03
V	V 2 O 5	0.1	22.2	1.13E-01
Zn	ZnCl 2	0.1	99,9	4.36E-01

Tabella 4:. Concentrato inorganico contaminanti preparazione dell'impasto L'aggiunta di 1 ml di questo stock concentrazione al mezzo PBR 1.1 L produce la concentrazione finale indicato nell'ultima colonna.

2. Sterilizzare le scorte di contaminanti inorganici facendo passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron sterile e raccogliere il filtrato in una provetta sterile.

5. N. salina Inoculum Produzione

1. In una beuta da 500 ml aggiungere 200 ml di terreno previste al punto 3 e quindi aggiungere 3 g di agar. Coprire il pallone in foglio di alluminio e in autoclave per 20 minuti a 120 ° C. Versare la soluzione in sterili-piatti e lasciate raffreddare fino a quando si solidifica. Questo dovrebbe essere completata be una cappa sterile o comunque in prossimità di una fiamma in un ambiente pulito per ridurre il rischio di contaminazione.
2. Streak N. cellule Salina sterili-dishes preparato in fase 5.1 utilizzando un ciclo semina sterile. Posizionare le culture petri-piatto su un tavolo illuminato con luci T12 mantenuti a temperatura ambiente. Lasciate microalghe crescono fino colonie sono visibili.
3. Colonie di trasferimento di sterile sconcertati beute contenenti 200 ml di terreno ricco di sostanze nutritive previste al punto 3 e tenerli su un tavolo shaker illuminata (1000 RPM). Lasciate che la cultura cresca fino a mezzo diventa verde.
4. Trasferire il microalghe ad un 1.1 L PBR sterile. Posizionare il PBR in un bagno d'acqua inoculo illuminato di 200 mmol m ^-2 s ^-1 con luci fluorescenti T8 e mantenuta a 23 ° C da un refrigeratore di ricircolo e di un riscaldamento ricircolo controllo automatizzato bagnomaria. Regolare l'aria e CO ₂ rotometers a 2.5 L min ^-1 e 25 cc min ^-1, rispettivamente.
5. Dopo una settimana di crescita diviso biomassa in nuovi 1 .1 L PBRs contenenti nuovo mezzo e lasciarlo crescere fino a un totale di almeno 28 g di secco biomassa peso sonoottenuto tra i due reattori che possono essere determinate con densità ottica.
6. Raccogliere la biomassa inoculo per centrifugazione a 2.054 xg per 15 min a 10 ° C utilizzando bottiglie da centrifuga sterili e tecniche sterili per evitare la contaminazione. Smaltire il surnatante e continua concentrazione cellulare, se necessario.
7. Una volta che tutti biomassa viene centrifugata, risospendere le cellule in 300 ml di mezzo fresco sterile.
8. Diluire 0,1 ml di coltura delle microalghe in 3 ml di DW e diluire 0,1 ml di questa nuova soluzione in 3 ml di DW. Assicurarsi che il campione è accuratamente miscelati. Misurare la densità ottica (OD) del concentrato microalghe a 750 nm () immediatamente utilizzando uno spettrofotometro.
9. Utilizzare l'equazione (1) per determinare la quantità di biomassa nel concentrato.
   Nota: L'equazione (1) è stato ottenuto dalla regressione lineare tra rispetto totale dei solidi sospesi (in g / L ^-1) per N. Salina (R ² = 0.9995). Equazione 1 è stato sviluppato per la spectrophotometer modello nella tabella dei materiali, generare una nuova calibrazione se si utilizza un altro modello spettrofotometro.
   1. Usando l'equazione (2) calcolare il volume di microalghe concentrato (in L) necessaria per ottenere una densità di 4 g / L ^-1 cultura in un PBR di 1,1 L di volume (a L).

10. Usando tecniche sterili, aggiungere il volume di microalghe concentrato trovato nel passo 5.9 a un PBR autoclavato per raggiungere una densità coltura iniziale di 4 g / L ^-1. Riempire PBR con medio 1.1 L. Ripetere questa operazione fino a 6 PBRs vengono inoculate. Posizionare le PBRs nel bagnomaria inoculo.
11. Lasciate che il microalghe nelle PBRs crescere per 8 giorni e poi raccogliere la biomassa (da ripetere le fasi 5,6-5,7). Ripetere il punto 5.8 per il calcolo inizialevolume di inoculo per una densità coltura iniziale di 1 g / L ^-1.

6. Reattori sperimentali

1. Utilizzando tecniche sterili aggiungere circa 1 L di terreno preparato nel passaggio 3 per ciascuna delle 12 PBR sterili acido-risciacquato. Posizionare le PBRs nel bagnomaria del sistema di crescita sperimentale. Accendere l'aria sparge su a 1.5 L min ^-1.
2. Sterilizzare un pH metro calibrato pulendo con etanolo al 70%. Misurare il pH del mezzo in PBR e garantire pH è circa 7,0; in caso contrario, ripetere il punto 2 per rimuovere l'acido lisciviati dalla fase di risciacquo acido.
3. Calibrare ogni controller pH con tampone pH 7, disinfettare le sonde utilizzando etanolo (70%) e poi inserirli nei coperchi PBR.
4. Per ogni PBR (tranne i PBRs controllo) aggiungere 1 ml di ciascuna delle sterili contaminanti inorganici scorte preparate al punto 4. Lasciate che i contaminanti mescolare accuratamente nel PBR. La concentrazione finale dei contaminanti inorganici nei PBR sono spettacolon nell'ultima colonna della tabella 4, e sono le concentrazioni massime stimate ci si aspetta da una integrazione centrale elettrica a carbone.
5. Aggiungere 14 ml di DW sterile per i PBRs controllo.
6. Aggiungere l'inoculo microalghe concentrato ottenuto nel passaggio 5.11 alle PBRs sperimentali, per ottenere una densità di coltura iniziale di 1 g / L ^-1. Lasciate accuratamente mix di biomassa.
7. Girare alte luci di intensità della luce (di 984 mmol m ^-2 s ^-1) e controllori di pH e regolare di CO ₂ a 30 cc min ^1. Aumentare il flusso di CO ₂ a 50 cc min ^-1 dal giorno 3 dopo. Tasso iniziale basso flusso di CO ₂ è fondamentale al fine di evitare grandi variazioni di pH a causa di ritardi nel gas / trasferimento di liquidi e la misurazione del pH.
8. Misurare e prendere campioni, se necessario. Assicurati di segnare il livello dell'acqua dopo il campionamento. (ATTENZIONE: alcuni contaminanti inorganici del PBR sono cancerogene, teratogene e mutagene, utilizzare guanti e cappcontenitori ndr durante la manipolazione dei campioni).
9. Aggiungere sterile DW giornaliera alle PBRs per compensare le perdite per evaporazione.
10. Dopo 7 giorni di crescita, raccogliere la biomassa mediante centrifugazione a 9.936 xg e preservare sia, biomassa e supernatante media, a -80 ° C.
11. Congelare asciugare la biomassa al 0,1 mbar e -50 ° CO / N. Powder la biomassa (utilizzare una spatola di biomassa polvere all'interno del tubo da centrifuga). Preservare congelare biomassa secca a -80 ° C.

7. Microwave Assisted digestione dei campioni

La digestione dei campioni di biomassa è richiesto come una fase di pre-elaborazione per analisi ICP-MS.
Nota: Queste procedure utilizzano un sistema chiuso di digestione nave microonde con sollievo pressione controllata. (ATTENZIONE: Alte pressioni si sviluppano durante la digestione l'acido, controllare l'integrità fisica dei vasi di digestione e scudi, e rimodellare i coperchi dei vasi digestione a microonde prima di ogni utilizzo).

1. Lavare Teflon vasi microonde digestione con acqua e sapone, risciacquare con DW e lasciare i vasi aria secca. Per rimuovere la contaminazione da metalli traccia nei vasi digerire acido come descritto nella procedura seguente.
2. Rimodellare i coperchi dei vasi microonde digestione e chiudere i flaconi ben.
3. Aggiungere 10 ml di acido nitrico per ciascuno.
4. Introdurre la nave nello scudo di sicurezza. Evitare la biomassa, acqua o reagenti vengono lasciati sulle pareti dello scudo sicurezza o nelle pareti esterne dei vasi di digestione per evitare di danneggiare il schermo di sicurezza. Tappare la schermo di protezione con la valvola di sicurezza accertandosi che la primavera nel flacone è a filo. Trova lo scudo sul rotore con le prese d'aria della protezione punta verso l'esterno nel lato esterno e verso l'interno nella fila interna.
5. Sul bordo di un numero, inserire il pozzetto ceramica e il sensore di temperatura. Questo termometro controlla la temperatura interna effettiva nel flaconcino e serve come parametro di controllo per eseguire il progr digestioneam. Assicurarsi che il numero uno fiala contiene le stesse campione e di reattivo importi degli altri flaconi.
6. Ingresso i parametri digestione mostrati in Tabella 5 e iniziare la digestione. Quando il programma è terminato, l'aria fresca le fiale fino a raggiungere RT.

Passo	Fiale di risciacquo			Digestione del campione
	Temperatura (° C)	Tempo (min)	Max. Potenza (W)	Temperatura (° C)	Tempo (min)	Max. Potenza (W)
1	RT a 190	25	1.000	RT a 180	15	1.000
2	190	10	1.000	180	15	1.000
Scarico	-	20	-	-	20	-

Tabella 5: Parametri utilizzati nel programma di digestione a microonde.

7. All'interno di una cappa aspirante, inserire lo strumento di massima pressione sul tappo scudo con le prese d'aria della protezione punto lontano da voi. Una volta che la pressione viene rilasciata aperto il tappo (ATTENZIONE: Sempre aperto fiale digerito all'interno cappa da biomassa digestione con acido produce fumi tossici).
8. Smaltire l'acido. Sciacquare i contenitori in Teflon con DW 3 volte. Lasciare fiale aria secca.
9. Per digerire biomasse, aggiungere 50 mg di liofilizzato biomassa alle navi di digestione a microonde. Per il controllo di qualità (QC) preparare le seguenti flaconcini: in due fiale diverse aggiungere o 5 ml di Livello 7 ICPMS o 5 ml di livello standard di 7 Hg CVAAS preparato in passi 9.1 e 10.1 (la soluzione digerita da questa fiala è chiamato il laboratorio fortificato vuoto (LFB)), lascia un altro (la soluzione fiala vuota digeritada questa fiala è chiamato il reagente di laboratorio vuoto (LRB)).
10. Per digerire media, aggiungere 10 ml di mezzo surnatante asciugare acido sciacquati vasi microonde digestione. Per il controllo di qualità (QC) preparare le seguenti flaconcini: In due fiale diverse aggiungere 5 ml di Livello 7 ICPMS o standard di metallo CVAAS previste al punto 9.1 e 10.1 (la soluzione digerita da questa fiala si chiama LFB), in un altro flacone aggiungere 10 ml di DW (la soluzione digerita da questa fiala è chiamato il LRB).
11. Rimodellare i coperchi dei vasi microonde digestione e chiudere i flaconi ben.
12. Aggiungere 7 ml di acido nitrico concentrato traccia grado di metallo e 3 ml di perossido di idrogeno per ogni flacone. Omogeneizzare il contenuto agitando delicatamente la soluzione. Digerire il contenuto dei flaconi ripetendo i passaggi 7,4-7,7 (utilizzare i parametri microonde digestione per il campione digestione nella Tabella 5).
13. Aggiungi campione digerito in un pallone tarato da 25 ml, risciacquando i vasi con DW per aumentare il recupero. Riempire il matraccio con DWal marchio.
14. Trasferimento digerito campioni ad un contenitore dotato di tappo. Conserva campioni a 4 ° C fino al momento dell'analisi può essere completata. Per questa analisi studio è fatto lo stesso giorno per Hg ed entro tre giorni per gli altri elementi.

8. Controllo qualità (QC) Campioni

Nota: Analizzare campioni QC per garantire affidabilità dei risultati dei campioni sperimentali.

1. Riempire parzialmente un acido sciacquati 1 L matraccio con DW. Aggiungere 280 ml di tracce di acido nitrico grado metallo concentrato e mescolare bene (questa soluzione si chiama anche la soluzione del bianco) (ATTENZIONE: aggiungere sempre l'acido all'acqua, mai aggiungere acqua all'acido come la reazione esotermica può essere violenta). Lasciate soluzione raffreddare a temperatura ambiente.
2. Oltre ai campioni QC preparati in passi 7.9 e 7.10, preparare i seguenti campioni QC.
   1. Per la verifica della calibrazione continua (CCV): Riempite un tubo di polistirene con standard di calibrazione (per la preparazione cfrpasso 9.2 e 10.1). Mettere la soluzione standard Hg sulla cremagliera CVAAS ei ICPMS soluzione standard nel ICPMS campionatore automatico.
   2. Per la taratura continua vuoto (CCB): Riempire due tubi di polistirolo (16 ml) con il vuoto (soluzione preparata al punto 8.1). Mettere un campione nel rack CVAAS e l'altro campione nella ICPMS campionatore automatico.
   3. Per la matrice di laboratorio fortificato (LFM): Casualmente scegliere 1 campione di ogni 12 campioni per ogni tipo di campione (ad esempio, la biomassa o medio) e usarlo per preparare un LFM. Per ICPMS, aggiungere 0,5 ml di ICPMS livello standard 7 e 3 ml di campione sperimentale digerito (sia da biomasse o medio) di un tubo di polistirene.
   4. Mescolare contenuti e posizionare le fiale sull'autocampionatore ICPMS. Per CVAAS, aggiungere 2 mL Hg Level 7 e 6 ml di campione sperimentale digerito (da biomassa o media) in una provetta di polistirene. Mescolare contenuti e posto fiale sul rack CVAAS.
   5. Per i campioni in doppio: Casualmente scegliere 1 campione di semprey 12 campioni per ciascun tipo di matrice (ad esempio, biomasse, media, LFM o qualsiasi matrice diluita) e duplicare la fiala. Posizionare le fiale ripetuti nel campionatore automatico ICPMS o il rack CVAAS.
   6. Per i campioni in doppio: Casualmente scegliere 1 campione di ogni 12 campioni per ogni tipo di matrice (ad esempio, la biomassa, medio, LFM o qualsiasi matrice diluita) e duplicare la fiala. Posizionare le fiale ripetuti nel campionatore automatico ICPMS o il rack CVAAS.
3. Definire i criteri di qualità dei dati per lo studio. Per il presente studio duplicare i criteri di qualità stabiliti da Eaton, Clesceri, Riso e Greenberg ^25. I parametri stabiliti per il controllo di qualità sono: differenza percentuale (% D) per CCV entro ± 10% ²⁵ (con l'eccezione di Pb e Sb, vedi la discussione), percentuale di recupero LFB (% R) entro ± 70-130% ^25, LFM per cento recupero (% R) entro 75-125% ^25, e la differenza relativa per cento (RPD) ± 20% ^25, e un ca continualibrazione vuoto (CCB) sotto il limite metodo di rendiconto (LMR) ^25. Vedere equazioni di calcolo in fase 9.7.

9. Quantificazione da plasma accoppiato induttivamente spettrometria di massa (ICPMS)

1. Il giorno di analisi, trasferire circa 5 ml di campione digerito per provette di polistirene e metterli nella ICPMS autocampionatore. Aggiungere circa 15 ml di campioni digeriti per tubi in polistirolo e metterli nel rack CVAAS.
2. Lo stesso giorno dell'analisi preparare gli standard di calibrazione. Aggiungere ICPMS acquistati soluzione standard e riempire con vuoto (soluzione preparata al punto 8.1), come descritto nella tabella 6 (vedi descrizione soluzione standard in Materiale tabella) per palloni tarati acido-risciacquato.

Parametro	Livello 1	Livello 2	Livello 3	Livello 4	Livello 5	Livello 6	Livello 7
Norma Acquistato da aggiungere (ml)	-	-	-	-	-	-	10.0
Livello 7 da aggiungere (ml)	0.0	1.0	2.5	5.0	20.0	25,0	-
Volume * finale (ml)	-	50.0	50.0	50.0	100.0	50.0	100.0
Concentrazione finale (mg / L)
75 Come	0.0	2.0	5.0	10.0	20.0	50.0	100.0
111 Cd	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25,0	50.0
59 Co	0.0	10.0	25,0	50.0	100.0	250.0	500.0
52 Cr	0.0	2.0	5.0	10.0	20.0	50.0	100.0
63 Cu	0.0	5.0	12.5	25,0	50.0	125.0	250.0
55 Mn	0.0	3.0	7.5	15.0	30.0	75.0	150.0
60 Ni	0.0	8.0	20.0	40.0	80.0	200.0	400.0
208 Pb	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25,0	50.0
121 Sb	0.0	12.0	30.0	60.0	120.0	300.0	600.0
51 V	0.0	10.0	25,0	50.0	100.0	250.0	500.0
66 Zn	0,0	4.0	10.0	20.0	40.0	100.0	200.0
* Raggiungere questo volume aggiungendo la soluzione preparata al punto 8.1

Tabella 6: Concentrazione di standard di calibrazione Livelli 1-7..

3. Rimuovere i coni dalle ICPMS e sonicare per 1 min a DW. Asciugare i coni e rimetterli nello strumento.
4. Accendere il refrigeratore d'acqua, gas (Ar, H _2, He), il ICPMS, linee spina a standard interno, e il riempimento di contenitori auto-campionatore risciacquo (DW, il 10% di acido nitrico, 1% di acido nitrico + acido cloridrico al 0,5%) .
5. Aprire il software Workstation MassHunter e accendere il plasma, sintonizzare la ICPMS e caricare il metodo impostato su parametri nella tabella 7.

Parametri	Valori
Norme interne	72 Ge, 115
Potenza Rf	1.500 W
Portata del gas plasma	14.98
Portata del gas nebulizzatore	1.1 L / min (carrier e la diluizione dei gas combinato - 0,6 + 0,5 l / min)
Cono di campionamento	Nickel per x lente
Cono Skimmer	Nichel
Velocità di assorbimento del campione	0,3 rps
Pompa nebulizzatore	0,1 rps
S / C di temperatura	2 ° C
Condizioni di scansione	Tempo di sosta 1 sec, il numero di replicare 3
H flusso di 2 gas	N / A
Egli flusso di gas	4,3 ml / min

Tabella 7: condizioni di funzionamento ICPMS.

6. Mettere standard di calibrazione, campioni QC e campioni sperimentali nel campionatore automatico. Nel software ICPMS aggiungere la sequenza di analisi e analizzare campioni. Aspirare il campione all'interno dello strumento al plasma dove vengono ionizzati elementi. Poi un vuoto ritira gli ioni di un contatore. Gli ioni si separano a seconda del loro peso atomico dai più leggeri ai più pesanti.
   ATTENZIONE: Raccogliere i rifiuti in ICPMS contenimento pericolosi e gestire in modo appropriato per lo smaltimento.
7. Assicurarsi che il valore del coefficiente di correlazione (R) per la curva di calibrazione per ogni metallo o metalloide è superiore a 0.995 ^24.
8. Durante l'analisi del campione, calcolare% R,% D e RPD come descritto nelle equazioni 3-6 ²⁶ e confrontare i risultati con i criteri di qualità dei dati di progetto in 8.3.
   1. Calcola recupero percentuale (% R) per determinare le perdite / guadagnando dal laboratorio fortificata blank (LFB) e la matrice interferenze da matrice laboratorio fortificato (LFM).

2. Calcola differenza percentuale (% D) per determinare le variazioni delle prestazioni dello strumento con il tempo durante l'esecuzione dei campioni CCV.

3. Calcolare la differenza percentuale relativa (RPD) per determinare le variazioni di metodo di precisione con il tempo durante l'esecuzione di campioni sperimentali.

9. Per ridurre l'interferenza di matrice (% R fuori l'intervallo accettabile), diluire i campioni per poveri% R a un rapporto di 1: 3 (campione: DW).

10. Hg quantificazione da Cold Vapor assorbimento atomico spettrofotometro (CVAAS)

1. Preparare gli standard di calibrazione lo stesso giorno di analisi. Diluire norma Hg acquistati con l'aggiunta di 1 ml di soluzione standard acquistati Hg per un matraccio da 100 ml e riempire con la soluzione preparata al punto 8.1.
   1. Aggiungere 2,5 ml di questa soluzione in un pallone tarato da 100 ml e riempire con la soluzione preparata al punto 8.1 (questa nuova soluzione è il Livello 7 Standard Hg). Aggiungere diluito Livello 7 Standard Hg di palloni tarati e riempire con vuoto (soluzione preparata al punto 8.1.), Come descritto nella Tabella 8 (vedi acquistato descrizione soluzione standard Hg in Materiale tabella).

Parametro	Livello 1	Livello 2	Livello 3	Livello 4	Livello 5	Livello 6
Serie L7 Hg da aggiungere (ml)	0	1	2.5	5	20	25
Volume * finale (ml)	-	50	50	50	100	50
Concentrazione finale (mg / L)	0	0.5	1.25	2.5	5	12.5
* Raggiungere questo volume aggiungendo la soluzione preparata al punto 8.1

Tabella 8: Concentrazione di standard di calibrazione Hg Livelli 1-6..

2. Aprire il gas Ar e valvola di sfiato, accendere il 'assorbimento atomicozione spettrofotometro e il Flow Injection Spettroscopia atomica (FIAS). Aprire il software CVAAS WINLAB, accendere la lampada Hg e lasciarlo scaldare fino a quando il parametro di energia del software raggiunge 79. Caricare il programma per l'analisi Hg con i parametri nella tabella 9. Regolare il percorso della luce nello strumento per dare il massimo di trasmittanza.

Parametri	Valori
Gas di trasporto	Argon, 100 ml / min
Lampada	Hg lampada a scarica senza elettrodi, la configurazione a 185 mA
Lunghezza d'onda	253,7 nm
Fessura	0,7 nm
Temperatura della cella	100 ° C
Volume del campione	500 microlitri
Vettore	3% HCl, 9.23 ml / min
Riducente	10% SnCl 2, 5.31 ml / min
Misurazione	Altezza Peak
Leggi repliche	3

Tabella 9: condizioni operative CVAAS.

3. Inserire la linea per la soluzione carrier fatta di acido cloridrico grado metalli in tracce 3%.
4. Inserire la linea alla soluzione riducente costituito da 10% di cloruro stannoso (adatto per l'analisi Hg) in acido cloridrico al 3% di grado metalli in tracce. Preparare questa soluzione lo stesso giorno di analisi in quanto è soggetto all'ossidazione atmosferica (ATTENZIONE: il cloruro stannoso è molto pericolosa, utilizzare abbigliamento protettivo quando si lavora con esso Raccogliere i rifiuti in CVAAS contenimento pericolosi e smaltire correttamente.).
5. Posizionare le norme Hg, campioni QC e campioni sperimentali nel rack CVAAS e inserire la sequenza nel software CVAAS WINLAB. Eseguire gli standard e generare l'equazione di taratura.
6. Run QC samples e campioni sperimentali. Il CVAAS trae circa 5 ml di campione nello strumento, riduce la presente Hg nel campione per elementale Hg (Hg ⁰⁾ gas e ripulisce il gas dalla soluzione con un gas carrier (Ar) in un sistema chiuso. Il vapore Hg passa attraverso una cella nel percorso ottico della lampada Hg. Un rilevatore determina la luce assorbita a 253,7 nm e correla alla concentrazione. (ATTENZIONE: il vapore di mercurio è tossico, garantire cappa aspirante strumento è a posto).
7. Calcola% R,% D e RPD nella fase 9.7 durante l'analisi e confrontare i risultati con i criteri di qualità dei dati di progetto.

Risultati

I rendimenti biomassa

Produzione di N. salina nel sistema PBR usato in questo studio è passato da 1 g / L ^-1 a 8,5 ± 0,19 g / L ^-1 (N = 12) per i reattori di controllo e 4,0 ± 0,3 g / L ^-1 (N = 12) per la multi-metal contaminato in 7 giorni. Gli esperimenti hanno prodotto dati ripetibili attraverso reattori in triplo e più batch. Figura 2A mostra la densità media cultura con molto piccolo errore standard sulla base di campioname...

Discussione

Saline microalghe N. salina può essere coltivata con successo nel sistema di crescita progettato con risultati ripetibili e alti rendimenti biomassa. Airlift miscelazione permesso per una cultura sospesa ben miscelato con assestamento minimo o incrostazioni nei periodi di crescita di 7 giorni. La variabilità minima luce attraverso la banca luce fluorescente è anche mostrato di non produrre differenze notevoli in termini di crescita.

Lo studio mostra metalli pesanti mezzi contamin...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-500
Sodium meta silicate nonahydrate	Fisher Scientific	S408-500
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
Potassium nitrate	EMD Chemical	PX1520-5
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Ammonium ferric citrate	Fisher Scientific	I72-500
Boric acid	Fisher Scientific	A73-500
Sodium molybdate, dihydrate	EMD Chemical	SX0650-2
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	Z68-500
Cupric sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	C489-500
Biotin	Acros Organics	230090010
Thiamine	Acros Organics	148990100
Vitamin B12	Acros Organics	405920010
Copper (II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	221783-100G	Irritant, Dangerous to the Environment
Lead (II) chloride	Sigma-Aldrich	268690-250G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium dichromate dihydrate	Sigma-Aldrich	398063-100G	Oxidizing, Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Nickel (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	223387-500G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium (meta) arsenite	Sigma-Aldrich	71287	Toxic, Dangerous to the Environment
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908-10G	Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Mercury (II) chloride	Sigma-Aldrich	215465-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Tin (II) chloride dihydrate	Fisher Scientific	T142-500	Corrosive. Suitable for Hg analysis. Very hazardous.
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Vanadium (V) oxide	Acros Organics	206422500	Dangerous to the Environment
Carbon dioxide	Air Liquide	I2301S-1	Compressed
Hydrogen peroxide	H325-500	Fisher Scientific	30% in water
ICP-MS standard	ICP-MS-6020	High Purity Standards
Mercury standard	CGHG1-1	Inorganic Ventures	1000±6 µg/mL in 5% nitric acid
Argon	Air Liquide		Compressed
Helium	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Hydrogen	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Nitric acid	Fisher Scientific	A509-P212	67-70% nitric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A508-P212	35% hydrochloric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Equipment
Scientific prevacuum sterilizer	Steris	31626A	SV-120
Centrifuge	Thermo Fisher	46910	RC-6 Plus
Spectrophotometer	Shimadzu	1867	UV-1800
pH controller	Hanna	BL981411	X4
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-151-SSV	T31Y
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-26-SSV	T35Y
Water bath circulator	Fisher Scientific	13-873-45A
Compact chiller	VWR	13270-120
Freeze dryer	Labconco	7752020
Stir plate	Fisher Scientific	11-100-49S
pH lab electrode	Phidgets Inc	3550
Inductively coupled plasma mass spectrometer	Agilent Technologies	7700 Series ICP-MS	Attached to autosampler CETAC ASX-520
FIAS 100	Perkin Elmer Instruments	B0506520
Atomic absorption spectrometer	Perkin Elmer Instruments	AAnalyst 800
Cell heater (quartz)	Perkin Elmer Instruments	B3120397
Microwave	Milestone		Programmable, maximum power 1,200 W
Microwave rotor	Milestone		Rotor with 24-75 ml Teflon vessels for closed-vessel microwave assisted digestion.
Materials
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-0425
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-1650
0.45 μm syringe filter	Thermo Fisher	F2500-3
Polystyrene tubes	Evergreen	222-2094-050	17 x 100 mm w/cap, 16 ml, polysteryne
Octogonal magnetic stir bars	Fisher scientific	14-513-60	Magnets encased in PTFE fluoropolymer