Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Resumen

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Resumen

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of G_i2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.

Introducción

Experimentos proteómicos que utilizan espectrometría de masas (MS) se pueden diseñar para utilizar ya sea no específica (shotgun) o métodos específicos. Proteómica Descubrimiento generalmente se basa en la escopeta de abajo hacia arriba MS, ya sea mediante el uso de un modo de adquisición de datos dependiente tradicional, o utilizando una de las técnicas de datos independiente de reciente desarrollo (por ejemplo, MS ^E, SWATH) ^1,2. Proteómica de escopeta es una poderosa herramienta para la identificación de péptidos de alto rendimiento y la cuantificación relativa, pero es generalmente inadecuado para la cuantificación absoluta o para dirigir pequeños conjuntos, definidos (~ decenas) de las proteínas. El método MS más utilizado para la proteómica dirigidos se selecciona reacción monitoreo (SRM) debido a su alta sensibilidad, velocidad y rango dinámico ^3-5. Alternativas a SRM incluyen el monitoreo de reacción en paralelo, que se aprovecha de alta resolución, escaneo de MS total ^{de 6.}

SRM se realiza generalmente mediante un rever nano-flujocromatografía SED-fase líquida de alto rendimiento (nano-RP-LC) acoplada a un instrumento de ionización por electrospray nano-(nano-ESI) fuente de iones unido a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QqQ-MS). En un experimento típico, las proteínas de la muestra se digiere proteolíticamente, y los péptidos resultantes se separaron cromatográficamente, desorbidos, y ionizados. Los iones precursores resultantes son m / z filtrada por el primer cuadrupolo (Q1) y fragmentado en el segundo cuadrupolo (q2) al chocar con un gas de colisión. Los iones de fragmentos resultantes son m / z-filtrada en la tercera cuadrupolo (Q3) y se cuantifica por un dynode. Cada par precursor y el ion fragmento se conoce como una transición, y cada transición se controla por un período determinado de tiempo (el tiempo de permanencia; típicamente 2-50 ms). Durante LC-SRM, los ciclos QqQ-MS a través de una lista predefinida de transiciones (el ciclo de trabajo es típicamente ≤3 seg), y se produce un cromatograma de cada transición.

Strateg Alternativas para la cuantificación de proteínas suelen utilizar inmunoensayos tales como transferencias de puntos, transferencias de Western, ELISA, microarrays de anticuerpos, microarrays de proteínas de fase inversa, inmunoensayos de microfluidos, ELISA digitales, e inmunoensayos basados ​​en microesferas ^7. Los mejores inmunoensayos pueden ser significativamente más sensible que la LC-SRM, y rendimiento de la muestra de inmunoensayos pueden ser significativamente mayor que la de LC-SRM ^5. Sin embargo, los inmunoensayos en desarrollo pueden ser costosos y / o requiere mucho tiempo, y los ensayos resultantes pueden ser vulnerables a la reactividad cruzada y / o interferencia, incompatible con la célula / tejido de lisis / métodos de homogeneización, y / o no susceptible de multiplexación ^5,8. Algunos de estos problemas pueden abordarse mediante el acoplamiento de técnicas en anticuerpos y basados ​​en MS. Por ejemplo, las proteínas diana pueden enriquecerse utilizando inmunoprecipitación antes de la proteólisis y LC-SRM ^9-12. Alternativamente, la técnica emplea SISCAPA inmunoprecipitación posterior a la proteólisis en el péptido level ^13,14. Además de immunoenrichment estrategias, immunodepletion de las proteínas de alta abundancia puede ser empleado para aumentar la sensibilidad LC-SRM mediante la reducción de la interferencia por coeluyentes analitos ^15,16.

La cuantificación de proteínas basado en MS se puede dividir en la cuantificación relativa y absoluta, y también en el etiquetado de isótopos de etiqueta libre y estable (por ejemplo, etiquetado metabólico, etiquetado química, y de la proteína marcada con pesado y de péptidos estándares internos). Técnicas de la etiqueta libre pueden ser útiles para la cuantificación de proteínas relativo, pero no son adecuados para la cuantificación absoluta precisión. En comparación, las técnicas de etiquetado han reducido de error asociado con la preparación de muestras y MS varianza, y se utilizan a menudo para la cuantificación relativa de proteínas ^17. Por ejemplo, isótopo estable marcado proteoma normas (SILAP) preparado utilizando una línea celular humana se cultivaron permitido la cuantificación relativa de biomarcadores potenciales a través de LC-SRM de suero humano ¹⁸. Precisa cuantificación de proteínas absoluta por la EM requiere que las normas internas, cuantificado, proteína o péptido marcado isotópicamente purificada y se enriquecerán-en muestras biológicas antes de la EM. La incorporación de isótopo pesado estándares internos marcados en un flujo de trabajo LC-SRM permite la cuantificación absoluta que se ha demostrado ser altamente reproducible y transferible entre los laboratorios ^16,19.

Isótopos estables etiquetados normas internas para la cuantificación absoluta de proteínas por MS incluyen normas de péptidos preparados mediante síntesis en fase sólida ^20, proteínas compuestas de normas péptido proteasa escindible concatenados ^21, y las normas de la proteína de longitud completa ^22. Target modificación covalente de proteínas y preparación de la muestra incompleta (es decir, la lisis incompleta de la muestra y de la homogeneización, y la solubilización incompleta de proteínas, la desnaturalización, la alquilación, y la proteolisis) puede socavar la cuantificación exacta. P Internanormas rotein son los menos propensos a ser afectados por la mayor parte de estos problemas potenciales, pero por lo general son los más difíciles de preparar. Una alternativa es analizar cada proteína diana utilizando múltiples estándares de péptidos internos que están diseñados para incluir residuos flanqueantes nativas amino- y carboxi-terminal. Independientemente de que se emplea el tipo de patrón interno, se debe claveteado-en las muestras biológicas en un punto temprano como durante la preparación de la muestra como sea posible. Además, las técnicas de preparación de muestras múltiples (por ejemplo, diferentes condiciones de desnaturalización) deben ser probados. El uso de múltiples técnicas experimentales ortogonales (experimental de validación cruzada) es una estrategia viable para superar la mayor cuantificación potencial desafía ^23-25.

LC-SRM cuantificación de proteínas es una técnica altamente flexible que se ha utilizado en una amplia variedad de aplicaciones. En particular, se ha utilizado para estudiar péptidos y proteínas dentro de biomarcadoresmuestras clínicas tales como suero, biopsias de núcleo, y aspirados con aguja fina ^5. LC-SRM también se ha utilizado para medir la estequiometría de los complejos de proteínas ^5,26, para detectar neurotoxinas botulínicas ^27, para cuantificar la dinámica de fosforilación de proteínas dentro de las vías de señalización ^5, y para cuantificar los cambios en la conformación de la proteína ^28.

Nuestro laboratorio está utilizando LC-SRM para cuantificar las proteínas de señalización que median la quimiotaxis de macrófagos para apoyar el desarrollo de simulaciones vía quimiotaxis. El esquema general del protocolo (Figura 1) comienza con la clasificación de los péptidos diana tentativas. Posteriormente, los estándares de péptidos externos crudo se sintetizan y se utilizan para desarrollar ensayos LC-SRM para los análisis cualitativos de muestras biológicas. Si se detecta el péptido diana derivado de muestra biológica, los estándares de péptido interno marcado con pesados ​​purificados se preparan para cuantitativo LC-SRM. Este protocolo se puede utilizar para accurately cuantificar proteínas a partir de una amplia variedad de muestras biológicas, y para apoyar las investigaciones de una amplia variedad de dianas proteicas.

Protocolo

NOTA: Este método ha sido descrito previamente ^56.

1. Péptido selección de objetivos

1. Compilar una lista de las proteínas diana, e incluyen un pequeño número de proteínas de limpieza para la normalización a través de muestras biológicas, y también incluyen un nivel de proteína interna (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga). Digerir las proteínas diana en péptidos trípticos in silico usando una herramienta de software, tales como la proteína de digestión Simulador ^29,30.
2. Exigir que los péptidos son plenamente tríptico y no contienen los sitios de escisión de tripsina que faltan. Evitar péptidos con sitios de escisión de tripsina vecinos para evitar potencialmente incompleta digestión con tripsina ^31.
3. Requerir que la longitud de cada péptido es de 5-20 residuos. Considere péptidos más largos, pero en cuenta que generalmente son más caros de sintetizar.
4. Evitar un péptido si corresponde a una variante genética natural (por ejemplo, un solo nucleótido-e polimorfismo). También confirman que los sitios de tripsina no se ven afectados (Paso 1.2).
5. Evitar un péptido si corresponde a un sitio de la modificación postraduccional (PTM). Del mismo modo, evitar un péptido si sería propenso a la modificación química durante la preparación de la muestra LC-MS. Específicamente, evitar péptidos propensas a la cisteína y la oxidación de metionina, asparagina y la desamidación de glutamina, y la formación de glutamina amino-terminal de piroglutamato. Confirme que los sitios de tripsina se ven afectados (Paso 1.2).
   1. Además, evitar péptidos que se originan de proteína amino- y carboxi-terminales porque termini de proteínas son propensas a la modificación postraduccional (pérdida de metionina amino-terminal y la acetilación y la amidación carboxi-terminal).
6. Requieren que cada péptido diana es única para cada proteína diana. Si esto no es posible, requerir que el péptido es único para un conjunto de isoformas / homólogos. Tratar péptidos difieren sólo por leucina / isoleucina sustitucióncomo si fueran idénticos al determinar singularidad péptido debido a que estos realizan casi idéntica durante LC-SRM.
   1. Si un análisis transcriptómica completa de todas las muestras biológicas se ha realizado (por ejemplo, RNA-Seq), determinar péptido singularidad usando en traducciones in silico de la transcripción de secuencias de ³² en vez de usar todo el proteoma de la especie.
7. Exigir que los péptidos diana son proteotípicos. Identificar péptidos proteotípicos utilizando espectrometría de masas escopeta ^1,2 de las muestras biológicas se está estudiando. Alternativamente, recuperar péptido identificaciones de péptidos proteotípicos de proteómica en línea de bases de datos tales como la espectrometría de masas NIST bibliotecas ³³ (http://peptide.nist.gov/), El Proteoma Máquina Global ³⁴ (X HUNTER bibliotecas espectrales de http: // www .thegpm.org / HUNTER / index.html y GPMDB péptido identificaciones de http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas ³⁵ (http://www.peptideatlas.org/), y la base de datos PRIDE ³⁶ (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
8. Si cuantitativa-nivel de transcripción análisis de las muestras biológicas se han realizado (por ejemplo, ARN-ss, qPCR), entonces evitar la orientación péptidos que corresponden a las transcripciones relativamente baja abundancia.
9. Si es necesario, seleccione péptidos diana que podrían ser utilizados para los ensayos de LC-SRM de ortólogos proteínas diana (por ejemplo, para analizar tanto las formas del ratón de una proteína diana humana y).
10. Seleccione al menos dos péptidos diana por proteína diana (si es posible).

2. Preparación del péptido Normas

NOTA: Esta sección del protocolo describe la preparación de un conjunto de veinte estándares de péptidos liofilizados (siendo cada 1 nmol en cantidad) para análisis posteriores. Para un número diferente de péptidos, o para diferentes cantidades de péptidos, tendrá que ajustarse en consecuencia.

1. Preparar estándares liofilizados péptidos (≥1 nmol) utilizando una tecnología de síntesis de péptidos tales como la síntesis SPOT ^20,37.
   1. Asegúrese de que los residuos de cisteína de las normas de péptidos externos están carbamidometilado (la estructura química formada por alquilación yodoacetamida). Por el contrario, garantizar que los residuos de cisteína de las normas de péptidos internos son sin modificar (estos serán alquilados durante la preparación de la muestra, que se describe a continuación).
   2. Estándares de Diseño de péptidos internos de manera que contienen nativo amino- y carboxi-terminal de residuos flanqueantes (para controlar la eficiencia de la digestión con tripsina; cada uno es típicamente cinco y cincuenta y siete residuos de largo).
   3. Estándares de Diseño de péptidos internos de manera que sean isótopo estable marcado. Considere el perfil isotópica natural del péptido diana y la precisión de la medición de masa de la MS cuando se selecciona una estrategia de etiquetado péptido. No utilice estándares de péptidos deuterados porque causas deuteración péptido de fase inversa tiempo de retención LCs para cambiar ^38.
      Nota: Por lo general, las normas internas de péptidos trípticos se sintetizan utilizando ~ 98% ^[13 C _6, ¹⁵ N _4] Arg y ^[13 C _6, ¹⁵ N _2] Lys incorporado en el extremo carboxi-terminal.
   4. Purificar estándares de péptidos internos utilizando HPLC ^39, y cuantificar con precisión los ^40.
2. Añadir 100 l de 0,1% v / v de ácido fórmico, 20% v / v de acetonitrilo (ACN) para cada estándar péptido liofilizado 1 nmol para producir una concentración de péptido de 10 micras (uso de la atención como el péptido liofilizado puede tener una muy baja densidad y se puede perder fácilmente). Vortex las muestras durante 2 min y baño de sonicar durante 5 min para asegurar que la disolución es completa péptido.
3. Agrupar los péptidos disueltos, y se concentra la mezcla resultante en un concentrador de vacío a un volumen final de 80 l. Añadir 20 l de ACN para disolver cualquier péptido precipitado.
   Nota: La muestra ahora contains 10 M de cada péptido y 20% v / v ACN.
4. Para los estándares de péptidos internos, preparar una serie de diluciones para cuantitativa LC-SRM:
   1. Preparar 100 l de una dilución 1 M: combinar 90 l de 20% v / v ACN y 10 l de la mezcla de péptido 10 mM.
   2. Preparar 100 l de una dilución de 100 nM: combinar 90 l de 20% v / v ACN y 10 l de la mezcla de péptido 1 mM.
5. Para los estándares de péptidos externos, preparar 100 l de una dilución 1 M para LC-MS mediante la combinación de 90 l de 0,1% v / v de ácido fórmico y 10 l de la mezcla de péptido 10 mM.
   Nota: La muestra ahora contiene 1 mM de cada péptido, 0,1% v / v de ácido fórmico, y 2% v / v ACN, y está listo para ser utilizado para el desarrollo del ensayo LC-SRM.

3. LC-SRM Ensayo Desarrollo

1. Analizar las mezclas de los estándares de péptidos externos (aproximadamente 1-10 pmol de cada péptido por inyección) por escopeta MS utilizando un HPL nano-flowSistema C acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (LC-MS-QqQ (/ MS)).
   1. Utilice un sistema LC-MS equipado con una columna capilar lleno de C-18 medios de comunicación (≤5 diámetro micras, ~ 200 Å poros, longitud ≥10 cm, id = 50-100 micras) y una punta nano-ESI (producido típicamente usando un láser-extractor). Asegúrese de que cada corrida LC-MS incluye un gradiente de ~ 60 min lineal (típicamente, 0-40% de Disolvente B), una etapa de regeneración de columna (~ 80% de Disolvente B), y una etapa de la columna re-equilibración (~ 0% de Disolvente B ) (disolvente A = 0,1% v / v de ácido fórmico en H ₂ O, disolvente B = 0,1% v / v tasa de ácido fórmico en ACN, caudal = 200-800 nl / min, tensión de ESI = 1800 V, anchura aislamiento Q3 = 0,7 m / z, presión de argón q2 = 1,5 mTorr).
   2. Para cada exploración ión precursor, seleccionar dinámicamente la parte superior ~ 10 iones precursores más intensos de la espectrometría de masas en tándem (MS / MS). Ejecutar cada muestra por duplicado de modo que se utilizan dos rampas energía de colisión diferentes: uno diseñado para fragmentar de manera óptima 2 iones precursores, y el otropara 3 precursor iones ^41.
   3. Realice la LC-QqQ-MS (/ MS) análisis utilizando el escaneo de iones precursores Q3 (Q1 escaneo ión precursor puede causar colas de los picos de iones precursores resultantes de las colisiones de argón de baja energía en Q2).
   4. Asegúrese de que el sistema LC-MS está funcionando adecuadamente mediante el análisis de muestras de control de calidad y técnicos repeticiones. Prevenir la muestra remanente utilizando columnas LC recién hechos y mediante la ejecución de múltiples espacios en blanco entre las muestras.
2. Analizar los datos resultantes escopeta LC-QqQ-MS (MS / MS) utilizando la base de datos buscando en contra de las secuencias de los péptidos estándares externos ^42. En su caso, desechar péptido identificaciones ambiguas utilizando las puntuaciones de identificación de péptidos de confianza (por ejemplo, valores de expectativas) o mediante el uso de modelos estadísticos ^42. Independientemente, revisar manualmente todas las identificaciones peptídicas ⁴³ para asegurar que todos ellos son sin ambigüedades.
3. Utilice las escopeta MS péptido identificaciones para construct una biblioteca espectro utilizando un programa de software como Skyline.
   1. Prepare una lista de transición LC-SRM usando las 03.10 transiciones más intensos por ión precursor (2 y 3 iones precursores; 1 y 2 fragmentos de iones; y-, b- y a-iones que son ≥2 residuos de largo).
   2. Descartar una transición si los valores de m / z precursor y el fragmento de iones se superponen dentro de la precisión de la medición de la masa QqQ-MS (fragmentación ion precursor es a veces incompleta; recuerde considerar la monoisotopic y las formas naturales de isótopos pesados, así como el no marcado y formas marcado pesado).
   3. Del mismo modo, descarta una transición si el ion fragmento de m / z que se solapa de un ion fragmento diferente de la misma ion precursor.
4. Utilice las listas resultantes de transición para realizar LC-SRM análisis de las mezclas de los estándares de péptidos externos (realizar la espectrometría de masas como se describe en el paso 3.1; Q1 y Q3 ancho de aislamiento = 0,7 m / z; tiempo de permanencia = 2-50 ms).
5. Mamánually revisar los datos LC-SRM resultantes y elimine los ensayos de bajo rendimiento (el análisis de datos LC-SRM se describe en la Sección 5).

4. LC-SRM ensayos de muestras biológicas

1. Preparar los platos de células cultivadas ^44. Si varias condiciones experimentales se están comparando, bloquear y aleatoriamente las muestras para reducir los posibles sesgos sistemáticos ^45.
2. Para cada placa de células, aspirar el medio de cultivo celular que perder y suspender las células en un tampón libre de suero ^44. Si es necesario, se lavan las células en un tampón libre de suero para eliminar cualquier proteína extracelular restante.
3. Para cada muestra, contar el número de células viables y totales mediante el uso de una tinción de viabilidad (por ejemplo, azul de tripano) y un hemocitómetro o un contador de células automatizado ^44.
4. Sedimentar las células por centrifugación, y aspirar los sobrenadantes a los residuos ⁴⁴ (un volumen típico sedimento celular es de ~ 30 l).
5. añadir 400 l de tampón de lisis de urea o tensioactivo tampón de lisis a cada sedimento celular (100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, 10 mM de hidrocloruro de bestatina, 10 mu M pepstatina A, y, o bien 8 M urea o 0,1% w / v de tensioactivo (respectivamente ); recién preparada, el uso de un tensioactivo compatible con MS ácido-lábil como RapiGest SF o PPS Silent surfactante). Si el uso de otros inhibidores de la proteasa, asegúrese de que no inhiben la tripsina.
6. Mezclar cada muestra utilizando pipeteo suave, y transferir a un tubo de cada 2 ml (con un tapón de rosca con una junta tórica) que contiene ~ 100 l de 0,1 mm de zirconia / perlas de sílice (tenga en cuenta que las perlas pueden causar tubos de tapa a presión a gotear ). Lyse las células por vórtex las muestras durante 5 minutos a velocidad máxima (este lisa las células mediante golpes de talón).
   1. Alternativamente, lisar las células utilizando un método mecánico diferente (por ejemplo, usando una prensa o de homogeneización francés consejos).
      Nota: Evite centrifugación lisados ​​de células ya que esto podría precipitar la proteína precipitada que podría otherwise ser tryptically digerido y detectado por LC-MS.
7. Para las muestras desnaturalizadas tensioactivos, incubarlos a 90 ° C durante 10 min para ayudar a la homogeneización de la muestra y la desnaturalización de proteínas.
8. Bath sonicar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente para ayudar a la homogeneización y la desnaturalización de las proteínas.
   Nota: El buffer de lisis lisados ​​y se puede almacenar a -80 ° C (se necesitará el tampón de lisis para los pasos 4.9 y 4.13).
9. Realizar un ensayo de concentración de proteína ⁴⁶ (por ejemplo, un ensayo de ácido bicinconínico) de los lisados ​​(y del tampón de lisis como un experimento de control).
10. Para los análisis cualitativos (es decir, no hay normas de péptidos internos serán de pinchos-en las muestras), pipetas 200 mg (masa de proteínas) de lisado de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco. Para los análisis cuantitativos, preparar cuatro de estas muestras para una serie de dilución de isótopos estables.
11. Para cada muestra, añadir un estándar de proteína interna (por ejemplo </ Em>, agregue ~ 5 pmol de ~ 98% de la luciferasa de luciérnaga puro).
12. Para los análisis cuantitativos, añadir la serie de dilución de isótopos estables de la mezcla equimolar de los estándares de péptido interno (por ejemplo, 0, 0,2, 2, 20 pmol de cada péptido) para las muestras.
    1. En paralelo, se preparan muestras de control utilizando los estándares del péptido interno solo (es decir, sin lisado celular) (por ejemplo, 0, 0,2, 2, 20 pmol de cada péptido).
    2. También hay que preparar muestras de control utilizando los estándares de péptidos internos y externos (por ejemplo: 2 pmol de cada péptido estándar externo, y 0, 0,2, 2, y 20 pmol de cada péptido estándar interno).
       Nota: Asegúrese de que las normas de péptidos son libres de ácido fórmico, ya que puede interferir con la digestión con tripsina.
13. Añadir tampón de lisis de modo que todas las muestras son volúmenes idénticos. Nota: Un volumen de muestra típico es de 70 l, por lo que este volumen será utilizado para este protocolo.
14. Reducir los residuos de cisteína de proteínas mediante la adición de 0.7 l de 1 M DTT (recién preparado) a cada muestra (la concentración final de DTT es 10 mM) e incubando las muestras a 60 ° C durante 30 min.
15. Cistinas alquilato de proteínas mediante la adición de 7 l de yodoacetamida tamponada (500 mM yodoacetamida, 1 M HEPES ∙ NaOH pH 8; recién preparados) a cada muestra (la concentración final es yodoacetamida 50 mM) e incubando las muestras a temperatura ambiente durante 20 min en la oscuridad (yodoacetamida es sensible a la luz). Si es necesario, enfriar rápidamente la yodoacetamida restante mediante la adición de DTT a una concentración final de 50 mM.
16. Para cada una de las muestras desnaturalizaron usando urea, añadir 482 l de HEPES 100 mM pH 8 ∙ NaOH manera que la concentración final es urea 1 M (tripsina se inhibió significativamente a> 1 M urea ^47).
17. Tryptically digerir las proteínas en péptidos.
    1. Para cada muestra que contiene lisado celular, añadir 8 l de grado secuenciación / l modificado tripsina 0,5 g de modo que el concentrat tripsina definitivaion es 01:50 (proteína w: w) tripsina: muestra, e incubar la muestra a 37 ° C durante 18 horas.
    2. Para cada muestra que no contiene lisado de células, añadir 0,5 l de 0,5 g / grado modificado tripsina secuenciación l, y se incuba la muestra a 37 ° C durante 2 h (cada una de estas muestras son para los experimentos de control, y típicamente contienen sólo el 10 ng -10 g de péptido + masa proteica).
18. Para cada una de las muestras desnaturalizadas de urea, añadir 440 l de 2% v / v de ácido fórmico (la concentración final de ácido fórmico es del 1% v / v). Confirme que estas muestras son pH ~ 3.
    1. Para cada una de las muestras desnaturalizadas de tensioactivo, añadir 914 l de 0,5% v / v TFA (la concentración final es TFA 0,5% v / v). Confirme que estas muestras son pH ~ 1,5. Incubar las muestras a 37 ° C durante 60 min para hidrolizar el agente tensioactivo.
19. Microcentrífuga todas las muestras a 21.000 xg durante 20 min a temperatura ambiente para sedimentar el grupo de cola tensioactivo y cualquier otra precipitates que obstruir un cartucho SPE C-18.
20. En fase sólida extraer cada uno de los sobrenadantes usando un cartucho SPE C-18 desechable (Tampón A = 0,1% v / v de ácido fórmico; Tampón B = v / v de ácido fórmico, 80% v / v ACN 0,1%; ~ 100 mg C- 18 de resina por cartucho). Vigor las fases móviles a través del cartucho SPE C-18 usando un bulbo de goma de superficie plana, utilizando un colector de extracción, o por centrifugación del cartucho en un tubo de centrífuga de 15 ml a 10 × g durante 5 min.
    1. Mojar la columna mediante la aplicación de 1 ml de Tampón B, se equilibre mediante la aplicación de 1 ml de Tampón A dos veces, aplicar la muestra y lavar el cartucho mediante la aplicación de 1 ml de Tampón A dos veces. La elución de los péptidos mediante la aplicación de 1 ml de Tampón B lentamente (~ 2 min).
21. Concéntrese cada eluato en un concentrador de vacío a un volumen final de 100 l a evaporarse ACN. Añadir 200 l de H ₂ O a cada muestra, y concentrar cada uno en un concentrador de vacío a un volumen final de 98 l para evaporar la basura cualquier posible rerestante ACN.
22. Añadir 2 l de 5% v / v de ácido fórmico en ACN a cada muestra (las concentraciones de las muestras finales son 0,1% v / v de ácido fórmico, 2% v / v ACN).
    Nota: Las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C.
23. Analizar las muestras usando LC-SRM (como en el paso 3.4). Para los análisis cualitativos LC-SRM, ejecute las muestras biológicas y los estándares de péptidos externos, y analizar todos los datos resultantes juntos. Para los análisis cuantitativo LC-SRM, ejecute la serie de dilución de isótopos de cada muestra biológica, y también ejecutar los ejemplos que consisten en las normas péptido solo, y analizar todos los datos resultantes juntos.

5. Análisis LC-SRM Datos

NOTA: la identificación y cuantificación de péptidos pueden ser altamente simplificadas y parcialmente automatizados usando software como horizonte, pero aún así se recomienda encarecidamente que todos los datos de anotación revisada manualmente. Además, lo mejor es excluir información del nivel de proteínas durante Annot Manualación de los datos de LC-SRM para evitar sesgo.

1. Para cada identificación de péptidos, confirme que la forma de cada perfil de elución de transición es más o menos de Gauss. Para cada transición, confirme que el perfil de elución es el producto de múltiples señales medidas por el detector de MS (es decir, no es el producto de uno o dos picos aleatorios de ruido MS).
2. Para cada identificación de péptidos, asegúrese de que se selecciona todo el perfil de elución de péptidos. Evite manualmente el ajuste de los límites del perfil de elución de subcomponentes de la identificación de péptidos (la forma péptido marcado pesada, la forma no marcada, iones precursores individuales, y las transiciones individuales).
3. Confirme que cada perfil de elución de transición tiene una relación señal-ruido (s / n) ≥3. Nota: "ruido" se refiere al ruido MS azar, no reproducibles señal de analitos coeluyentes. Cromatograma funciones de suavizado pueden ayudar en gran medida el análisis de los datos ruidosos.
4. Para cada identificación de péptidos,confirmar que todas las transiciones tienen perfiles de elución casi idénticos (no sólo tiempos iguales vértice del pico; los perfiles de elución pueden tener diferentes amplitudes).
5. Para el LC-SRM análisis de una gran cantidad de los estándares de péptidos (típicamente ≥100 fmol de cada péptido), confirmar que los perfiles de elución de péptidos correspondientes son muy intensos (típicamente s / n ≥100), y que las identificaciones de péptidos son inequívocos. Nota: Estas identificaciones altamente seguros serán críticos para la identificación de los correspondientes péptidos derivado de muestra biológicos.
6. Para cada identificación de péptidos, confirman que las intensidades de transición relativos coinciden con los de la norma péptido identificado con confianza. Si es necesario, descarte, relativamente perfiles de elución de transición de baja intensidad ruidosos, pero confirman que ninguno de los relativamente intensas transiciones se echa en falta. Haga caso omiso de perfiles de elución transición relativamente intensas que están significativamente y sin ambigüedad afectados por un compañeroeluyendo contaminante.
7. Para cada identificación de péptidos, estimar la probabilidad de que se haya producido al azar por la señal de fondo (ruido MS aleatorio más señal reproducible de analitos coeluyentes).
   1. Estimar esta probabilidad manualmente mediante el examen de todo el cromatograma LC-SRM y la estimación de la singularidad de cada identificación de péptidos. Producir un conjunto de péptido identificaciones confianza que tiene una tasa estimada falso descubrimiento (FDR) de 5%. Usar criterios más estrictos (por ejemplo, FDR ≤1%) si se requiere una confianza mayor conjunto de identificaciones (No se recomienda el uso de criterios más flexibles).
   2. También puede utilizar el algoritmo mProphet ⁴⁸ o el algoritmo de auditoría ^49, pero revisar manualmente los resultados.
8. Para cada identificación de péptidos, confirme que el tiempo de elución observado es coherente con la hidrofobicidad del péptido (Skyline está diseñado para realizar este cálculo).
9. Para cada péptido, confirmar quesu tiempo de elución es consistente a través de las carreras de LC.
   NOTA: LC-SRM análisis a veces producir perfiles de elución que están sesgadas sistemática entre las corridas. Cambios sistemáticos son de esperar después de las alteraciones de instrumentos tales como la sustitución de una columna. Además, los péptidos que eluyen temprano pueden ser propensos a los cambios (especialmente si la columna se carga cerca de su capacidad), y finales de los péptidos que eluyen también pueden ser propensos al desplazamiento. Identificación de péptidos se ha completado.
10. Para mejorar la cuantificación de péptidos, vuelva a inspeccionar cada identificación de péptidos y desechar un perfil de elución de transición si es especialmente ruidoso en comparación con los otros perfiles de elución de transición de la identificación de péptidos. Descartar un perfil de elución de transición si su intensidad relativa de transición está mal (en comparación con el estándar de péptido).
11. Inspeccione los límites de cada perfil ión precursor y la elución de transición. Si es necesario, ajuste cuidadosamente los límites del perfil de elución para recortar distancia señal de fondo (o para ifondo ejorar la estimación de la señal).
12. Para cada estándar péptido interno, compruebe si está contaminado con una cantidad detectable de péptido luz (determinado por la LC-SRM análisis de las normas de péptidos internos solo, descrito anteriormente). Posteriormente, descartar los perfiles de elución de péptidos de luz que fueron comprometidos significativamente por la contaminación-péptido luz dentro de los estándares de péptidos internos.
13. Cuantificar cada perfil de elución de transición mediante el cálculo de su área de pico LC. En su caso, deducir la señal de fondo estimado. Cuantificar cada perfil de elución del péptido sumando los valores de cuantificación de transición correspondientes (en lo sucesivo, esto se conoce como el valor "Sum_Peak_Area"). Para cada valor Sum_Peak_Area péptido muestra biológica, calcular la abundancia molar péptido muestra biológica utilizando datos de LC-SRM de normas de péptidos internos o externos (uso sólo las transiciones que fueron cuantificados con éxito tanto por el péptido muestra biológicaLC-SRM y la del patrón de péptido).
    1. La cuantificación utilizando estándares de péptidos externos (no recomendado):
       1. Trazar los valores Sum_Peak_Area estándar de péptidos externa frente a los valores de abundancia molares estándar de péptidos externo. Producir una curva estándar mediante el ajuste de una regresión lineal a los datos (típicamente, sólo el componente lineal de la gama dinámica debe ser utilizado; cualquier componente no lineal debe ser utilizado con extrema precaución). Para cada valor Sum_Peak_Area péptido muestra biológica, utilizar la curva estándar para calcular la abundancia molar péptido.
          Nota: Este método de cuantificación no se recomienda debido a que requiere que la preparación de la muestra y LC-SRM ser demostrabilidad robusta porque las muestras biológicas y los estándares de péptidos externos se prepararon y analizaron por LC-SRM por separado. Además, no tiene en cuenta los efectos de matriz (efectos debido a los componentes de una muestra que no sea el analito).
    2. Cuantificación usando internanormas de péptidos (recomendado):
       1. Para cada valor Sum_Peak_Area péptido muestra biológica y el correspondiente péptido interno valor Sum_Peak_Area estándar marcado pesado, calcular la relación luz / pesado. Utilice esta relación como una medida de la / péptido pesado razón de abundancia molar luz correspondiente para calcular la abundancia molar del péptido muestra biológica. En concreto, la abundancia molar péptido muestra biológica es igual a la del péptido interno abundancia molar estándar multiplicada por la relación Sum_Peak_Area ligera / pesada.
       2. Para cada réplica y péptido diana biológica, identificar el intervalo lineal de la cuantificación LC-SRM mediante la creación de una curva estándar utilizando una regresión lineal. Específicamente, trazar los valores de abundancia molar estándar de péptidos internos frente a los valores pesados ​​/ ligeros Sum_Peak_Area relación (tenga en cuenta que la masa de la muestra biológica es constante a través del conjunto de datos). Requerir que cada muestra el valor Sum_Peak_Area péptido biológica está dentro del rango lineal (typicaliado, sólo el componente lineal de la gama dinámica se debe utilizar; cualquier componente no lineal debe utilizarse con extrema precaución). Del mismo modo, realice este paso para cada transición péptido diana.
          Nota: Analito cuantificación por LC-QqQ-SRM debe ser lineal en un amplio rango dinámico (~ 10.000). En el extremo inferior, la señal de fondo (ruido MS aleatorio más señal reproducible de analitos coeluyentes) reducirán la precisión de cuantificación y precisión. En el extremo superior, la saturación del detector provocará la no linealidad (en última instancia, esto puede causar perfiles de elución sean partida plana a una intensidad de señal específica).
14. Si es apropiado, lleve a cabo una normalización global a través de las muestras, tales como una normalización tendencia central ^50, para corregir las pequeñas diferencias en la cantidad de la muestra antes de la spiking-in de los estándares de péptidos internos. Si es necesario, utilice sólo las proteínas de limpieza desde el paso 1.1.
15. Si es necesario, imputar falta quantificatión valora ^51,52.
    Nota: Es impropio simplemente reemplazar los valores perdidos con la mitad del límite inferior de cuantificación (LLOQ) o la mitad del límite de detección (LOD), ya que hacerlo sería reducir artificialmente varianza cuantificación, y podría resultar en una prueba estadística (por ejemplo, un ANOVA ) la producción de un resultado falso positivo (un error de tipo I). Sin embargo, haciendo caso omiso de los valores que faltan también puede ser problemático. Por ejemplo, si la mitad de los valores de abundancia verdaderas están por debajo del límite de detección, y la otra mitad están por encima del LLOQ, entonces la media observada abundancia sería sobreestimar la verdadera abundancia significa.
16. Asegúrese de que los ensayos cumplen las directrices ampliamente aceptadas para LC-SRM ^23-25. En particular, requiere que el coeficiente de variación de los valores de cuantificación es típicamente ≤25% para los ensayos clínicos, y ≤35% para los ensayos no clínicos ^25. Para los ensayos de LC-SRM relacionadas con la atención sanitaria o veterinaria productos o servicios que se van a tener en cuenta para la aplicación de reglamentaciónRoval, requiere que los ensayos cumplen los requisitos de precisión más estrictas para tales ensayos: "La precisión determinada en cada nivel de concentración no debe superar el 15% del coeficiente de variación (CV) a excepción de la LLOQ, donde no debe superar el 20% de la CV ^"23,24.

Resultados

El desarrollo de modelos computacionales de predicción de las vías de transducción de señales es uno de los objetivos fundamentales de la biología de sistemas ^53. Desafortunadamente, incluso para las vías de señalización que han sido estudiados extensamente y tienen una alta significación clínica, todavía no es generalmente posible predecir cuantitativamente el comportamiento de vía en respuesta a las perturbaciones (por ejemplo, esto es cierto para la MAPK / ERK vía ^54). Reci...

Discusión

Cuantificación de proteínas absoluta es esencial para una gama muy diversa de aplicaciones biomédicas como la validación de biomarcadores y el modelado vía de transducción de señales. Recientemente, la proteómica dirigidos utilizando LC-SRM se ha beneficiado de las mejoras a las numerosas tecnologías, incluyendo la preparación de péptidos estándar, HPLC, QqQ-MS, y el análisis de datos LC-SRM. En consecuencia, se ha convertido en una alternativa poderosa para inmunoensayos. Los inmunoensayos pueden ser extre...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit	Fisher	23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm	BioSpec Products	11079101z
Bestatin hydrochloride	Sigma	B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)	Lonza	12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8	Gibco	15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11550
Cell culture L-glutamine	Sigma	G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco	10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v	Lonza	17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules	Fisher	A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep	Marienfeld-Superior	0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2	Mediatech	25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id	Polymicro Technologies	1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene	SUN SRI	200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone	SUN SRI	500-061
Luciferase, from Photinus pyralis	Sigma	L9506-1MG
Pepstatin A	EMD Millipore	516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)	EMD Chemicals	9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail	Roche	04906837001
RapiGest SF	Waters	186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge	Waters	WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position	Waters	WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb	Fisher	03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
SpeedVac vacuum concentrator	Fisher	SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Tube decapper for Micronic tubes	USA Scientific	1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile	Sarstedt	72.694.006
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS grade	Fisher	W6-1