Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Resumo

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Resumo

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of G_i2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.

Introdução

Experimentos de proteômica que usam a espectrometria de massa (MS) pode ser projetado para usar um não-alvo (espingarda) ou métodos direcionados. Proteómica descoberta baseia-se na espingarda geralmente de baixo para cima MS, usando um modo de aquisição dependente dos dados tradicional, ou utilizando uma das técnicas independentes de dados desenvolvidas recentemente (por exemplo, MS ^E, SWATH) ^1,2. Proteómica espingarda é uma ferramenta poderosa para a identificação de alto rendimento péptido e quantificação relativa, mas é geralmente inadequada para a quantificação absoluta ou para o direccionamento pequenos conjuntos, definidos ~ (RTE) de proteínas. O método MS mais frequentemente usado para proteômica alvejados é selecionado monitoramento de reação (SRM) por causa de sua alta sensibilidade, velocidade e alcance dinâmico ^3-5. Alternativas a SRM incluem monitoramento de reação paralela, que tira proveito de alta resolução, completa varredura MS ^6.

SRM é geralmente realizada utilizando um fluxo de rever nano-sed cromatografia em fase líquida de alta eficiência (nano-RP-LC) acoplado a um instrumento de ionização por electropulverização de nano-(nano-ESI) ligado a fonte de iões de um espectrómetro de massa triplo quadrupolo (QQQ-MS). Numa experiência típica, as proteínas da amostra são proteoliticamente digeridos, e os peptídeos resultantes foram separados cromatograficamente, dessorvido, e ionizado. Os iões resultantes são precursoras m / z filtrada por o primeiro quadrupolo (Q1) e fragmentada no segundo quadrupolo (Q2) por colidir com um gás de colisão. Os iões resultantes são fragmento m / no terceiro quadrupolo (Q3) e quantificada por um dínodo filtrou-z. Cada par de iões fragmento precursor e é referido como uma transição, e cada transição é monitorizado por um período determinado de tempo (tempo de espera, tipicamente 2-50 ms). Durante LC-SRM, os ciclos QQQ-MS por meio de uma lista pré-definida de transição (o ciclo de serviço é tipicamente ≤3 seg), e um cromatograma de cada transição é produzido.

Strateg alternativas para a quantificação de proteínas normalmente utilizam imunoensaios tais como borrões ponto, manchas de Western, ELISAs, microarrays de anticorpos, microarrays de proteínas de fase reversa, imunoensaios microfluídicos, ELISAs digitais e imunoensaios à base de microesferas ^7. Os melhores imunoensaios podem ser significativamente mais sensíveis do que os LC-SRM, e o manuseamento das amostras de imunoensaios podem ser significativamente mais elevada do que a da ^LC-5 SRM. No entanto, imunoensaios em desenvolvimento pode ser caro e / ou demorado, e os ensaios resultantes podem estar vulneráveis ​​a reactividade cruzada e / ou interferências, incompatível com células / tecido de lise / métodos de homogeneização, e / ou não passíveis de multiplexagem ^5,8. Algumas dessas questões podem ser abordadas por acoplamento técnicas anticorpo-e baseado no MS. Por exemplo, as proteínas alvo podem ser enriquecidas utilizando imunoprecipitação prévia à proteólise e LC-SRM ^9-12. Alternativamente, a técnica emprega SISCAPA imunoprecipitação subsequente à proteólise no leve peptídeol ^13,14. Além immunoenrichment estratégias, imunodepleção de proteínas de alta abundância pode ser empregue para aumentar a sensibilidade de LC-SRM, reduzindo a interferência por coeluting analitos ^15,16.

Quantificação de proteína baseada em MS pode ser dividido em quantificação relativa e absoluta, e também para rotulagem isótopo estável e livre de marcador (por exemplo, a etiquetagem metabólica, marcação química, e pesada da proteína marcada com padrões internos e peptídicos). Técnicas livre de marcador pode ser útil para a quantificação relativa de proteína, mas não são adequados para a quantificação exacta absoluta. Por comparação, técnicas de marcação já reduzida de erro associado com a preparação da amostra e da variância MS, e são muitas vezes utilizados para a quantificação relativa de proteína ^17. Por exemplo, os padrões de isótopos estáveis ​​proteoma marcado (SILAP) preparado utilizando uma linha de células humanas de cultura permitiu a quantificação relativa de biomarcadores potenciais através de LC-SRM de soro humano ¹⁸. Accurate quantificação absoluta de proteína por MS requer que as normas internas purificada, quantificado, proteínas isotopicamente marcada ou peptídeo ser cravado-em amostras biológicas antes de MS. A incorporação de padrões internos marcados com isótopos pesados ​​em um fluxo de trabalho LC-SRM permite a quantificação absoluta de que foi mostrado ser altamente reprodutível e transferível entre laboratórios ^16,19.

Rotulados padrões internos de isótopos estáveis ​​para a quantificação absoluta de proteína por MS incluem padrões de peptídeos preparados usando a síntese em fase sólida ^20, proteínas compostas de padrões de peptídeos protease clivável concatenadas ^21, e padrões de proteína de comprimento total ^22. Alvo modificação covalente de proteínas e preparação de amostras incompletas (por exemplo, a lise da amostra incompleta e homogeneização, e solubilização de proteínas incompletas, a desnaturação, a alquilação, e a proteólise) pode prejudicar a quantificação precisa. P Internonormas rotein são os menos susceptíveis de serem afectadas pela maioria desses problemas potenciais, mas eles geralmente são os mais difíceis de preparar. Uma alternativa é a de analisar cada proteína alvo utilizando vários padrões peptídicos internos que são concebidos para incluir os resíduos de flanqueamento nativos amino e carboxi-terminais. Independentemente de qual o tipo de padrão interno é utilizado, ele deve ser cravado-os em amostras biológicas, o mais a altura durante a preparação da amostra quanto possível. Além disso, técnicas de preparação de amostras múltiplas (por exemplo, as diferentes condições de desnaturação) deve ser testado. O uso de várias técnicas experimentais ortogonais (de validação cruzada experimental) é uma estratégia viável para a superação de mais quantificação potencial desafia ^23-25.

LC-SRM quantificação de proteínas é uma técnica altamente flexível, que foi utilizado numa ampla variedade de aplicações. Notavelmente, tem sido utilizada para estudar peptídicos e proteicos biomarcadores dentroamostras clínicas, tais como soro, biópsias, e punção aspirativa por agulha fina ^5. LC-SRM também tem sido utilizado para medir a estequiometria de complexos de proteínas ^5,26, para detectar neurotoxinas botulínicas ^27, para quantificar dinâmica de fosforilação de proteína dentro de vias de sinalização ^5, e para quantificar as alterações na conformação da proteína ^28.

Nosso laboratório está usando LC-SRM para quantificar as proteínas sinalizadoras que medeiam a quimiotaxia de macrófagos para apoiar o desenvolvimento de simulações via quimiotaxia. O esquema geral do protocolo (Figura 1) começa com o ranking dos peptídeos alvo provisórias. Subsequentemente, padrões externos de péptidos em bruto são sintetizados e utilizados para desenvolver testes de LC-SRM para análises qualitativas de amostras biológicas. Se o péptido alvo biológico derivado de amostra é detectada, padrões peptídicos internos pesados ​​marcado purificados são preparados por LC-quantitativa SRM. Este protocolo pode ser utilizado para accurately quantificar proteínas a partir de uma grande variedade de amostras biológicas, e para apoiar as investigações de uma grande variedade de alvos de proteína.

Protocolo

NOTA: Este método foi descrito anteriormente ^56.

1. Peptide seleção de alvos

1. Compilar uma lista das proteínas alvo, e incluem um pequeno número de proteínas de limpeza para a normalização entre amostras biológicas, e também incluir um padrão interno de proteínas (por exemplo, luciferase de pirilampo). Digerir as proteínas-alvo em peptídeos trípticos in silico usando uma ferramenta de software, como a proteína digestão Simulator ^29,30.
2. Exigir que os peptídeos são totalmente tríptico e não contêm locais de clivagem de tripsina em falta. Evitar péptidos com locais de clivagem de tripsina vizinhos para evitar a digestão de tripsina potencialmente incompleto ^31.
3. Exigem que o comprimento de cada péptido é 5-20 resíduos. Considere péptidos mais longos, mas note que eles são geralmente mais caros de sintetizar.
4. Evitar um péptido se ele corresponde a uma variante genética natural (por exemplo, um único nucleotidpolimorfismo e). Também confirmam que os sites de tripsina não são afetados (Passo 1.2).
5. Evite um peptídeo se corresponder a um local de modificação pós-tradução (PTM). Da mesma forma, evitar um péptido se que seria propenso a modificação química durante o LC-MS a preparação da amostra. Especificamente, evitar péptidos propensas à cisteína e à oxidação de metionina, asparagina e glutamina desamidação, e a formação de glutamina no terminal amino de piroglutamato. Confirme que os locais de tripsina não são afetados (Passo 1.2).
   1. Além disso, evitar a péptidos que se originam a partir de proteínas e amino terminais carboxi terminais da proteína porque são propensos a modificação pós-tradução (perda de metionina amino-terminal e acetilação, e amidação do terminal carboxi).
6. Exigir que cada péptido alvo é única para cada proteína alvo. Se isso não for possível, requerem que o péptido é único para um conjunto de isoformas / homólogos. Trate péptidos diferindo apenas pelas leucina / substituição isoleucinacomo se fossem idênticos ao determinar peptídeo singularidade porque estes executam quase idêntica durante LC-SRM.
   1. Se uma análise do transcriptoma abrangente de todas as amostras biológicas tem sido realizada (por exemplo, ARN-SEQ), determinar péptido usando singularidade em traduções in silico da transcrição sequências ³² ​​em vez de usar todo o proteoma da espécie.
7. Exigir que os péptidos alvo são proteotípicos. Identificar os péptidos utilizando espectrometria de massa proteotípicos espingarda ^1,2 das amostras biológicas a ser estudada. Alternativamente, recuperar identificações peptídicas de péptidos proteotípicos de bancos de dados de proteômica online, como a espectrometria de massa NIST bibliotecas de ³³ (http://peptide.nist.gov/), A Máquina Proteome global ³⁴ (X CAÇADOR bibliotecas espectrais de http: // www .thegpm.org / HUNTER / index.html, e GPMDB identificações peptídicos de http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas ³⁵ (http://www.peptideatlas.org/), eo banco de dados PRIDE ³⁶ (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
8. Se análise quantitativa do nível de transcrição as amostras biológicas foram realizadas (por exemplo, ARN-SEQ, qPCR), em seguida, evitar os péptidos alvo que correspondem aos transcritos relativamente baixa abundância.
9. Se necessário, seleccione péptidos alvo que possam ser utilizados para ensaios de LC-SRM de ortólogos proteína alvo (por exemplo, para ensaiar a ambos as formas de ratinho de uma proteína alvo e humano).
10. Seleccionar pelo menos dois péptidos alvo por proteína alvo (se possível).

2. Preparação do Péptido Padrões

NOTA: Esta seção do protocolo descreve a preparação de um conjunto de vinte padrões de peptídeos liofilizados (cada um sendo 1 nmol em quantidade) para análises a jusante. Para um número diferente de péptidos, ou em quantidades diferentes de péptidos, que terá de ser ajustado em conformidade.

1. Preparar padrões liofilizados peptídicas (≥1 nmol), utilizando uma tecnologia de síntese de peptídeos, tais como SPOT síntese ^20,37.
   1. Assegurar que os resíduos de cisteína de padrões de peptídeos externos são carbamidomethylated (a estrutura química formada por alquilação iodoacetamida). Em contraste, a garantir que os resíduos de cisteína de padrões peptídicos internos são não modificada (estes irão ser alquilado durante a preparação da amostra, descrito abaixo).
   2. Conceber padrões peptídicos internos de modo a que eles contêm nativa de amino e carboxi-terminal de resíduos que flanqueiam (para controlar a eficiência da digestão de tripsina; cada um é normalmente de três a seis resíduos de comprimento).
   3. Projetar padrões de peptídeos internos para que eles sejam rotulados isótopo estável. Considere o perfil isotópica natural do péptido alvo e a precisão da medição da massa MS quando se selecciona uma estratégia de rotulagem péptido. Não use padrões de peptídeos deuterados porque causas peptídeo deuterização de fase reversa tempo de retenção LCs para deslocar ^38.
      Nota: Normalmente, os padrões de péptidos trípticos internos são sintetizados usando ~ 98% puro ^[13 C _6, ¹⁵ N _4] Arg e ^[13 C _6, ¹⁵ N _2] Lys incorporada no carboxi-terminais.
   4. Purificar padrões de peptídeos internos utilizando HPLC ^39, e quantificá-los com precisão ^40.
2. Adicionar 100 ul de 0,1% v / v de ácido fórmico, 20% v / v de acetonitrilo (ACN) a cada 1 nmol padrão péptido liofilizado para produzir uma concentração de péptido de 10 uM (utilização de cuidados de que o péptido liofilizado pode ter uma muito baixa densidade e pode ser facilmente perdido). Agitar as amostras durante 2 min e sonicar banho-los, durante 5 minutos para assegurar que a dissolução está completa péptido.
3. Reúnem-se os péptidos dissolvidos, e concentra-se a mistura resultante num concentrador de vácuo a um volume final de 80 ul. Adicionar 20 ul de ACN para dissolver qualquer precipitado de péptido.
   Nota: A amostra agora contains 10 uM de cada péptido e 20% v / v de ACN.
4. Para os padrões de peptídeos internos, preparar uma série de diluição para quantitativa LC-SRM:
   1. Prepare a 100 ul de uma diluição de 1 uM: combinar 90 ul de 20% v / v de ACN e 10 ul da mistura de péptidos de 10 uM.
   2. Prepare a 100 ul de uma diluição de 100 nM: combinar 90 ul de 20% v / v de ACN e 10 ul da mistura de péptidos 1 uM.
5. Para padrões de péptidos externos, preparar a 100 ul de uma diluição de 1 uM para LC-MS através da combinação de 90 ul de 0,1% v / v de ácido fórmico e 10 ul da mistura de péptidos de 10 uM.
   Nota: A amostra agora contém 1 uM de cada péptido, v / v de ácido fórmico a 0,1% e 2% v / v de ACN, e está pronto a ser utilizado para a LC-SRM desenvolvimento do ensaio.

3. LC-SRM Ensaio Desenvolvimento

1. Analisar as misturas de péptidos de os padrões externos (cerca de 1-10 pmol de cada péptido por injecção) por shotgun MS usando um HPL nano-flowC sistema acoplado a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo (LC-qq-MS (/ MS)).
   1. Use um sistema LC-MS equipado com uma coluna capilar embalado com C-18 mídia (≤5 mm de diâmetro, ~ 200 poros A, de comprimento ≥10 cm, id = 50-100 mm) e uma ponta nano-ESI (tipicamente produzida usando um laser-extrator). Certifique-se de que cada série de LC-MS inclui um gradiente linear de ~ 60 min (tipicamente, 0-40% de solvente B), um passo de regeneração de coluna (~ 80% de Solvente B), e uma etapa de re-equilibração da coluna (~ 0% de Solvente B ) (solvente A = 0,1% v / v de ácido fórmico em _H2O, Solvente B = 0,1% v taxa / v de ácido fórmico em ACN, fluxo = 200-800 nl / min, tensão ESI = 1800 V, largura isolamento Q3 = 0,7 m / z, a pressão de árgon q2 = 1,5 mTorr).
   2. Para cada verificação de iões precursor, selecione dinamicamente o top ~ 10 íons precursores mais intensos para a espectrometria de massa em tandem (MS / MS). Executar cada amostra em duplicado, de modo que duas rampas de energia de colisão são usados ​​diferentes: um concebido para fragmentar optimamente dois iões precursores, e os outrospara 3 precursor íons ^41.
   3. Realize o LC-qq-MS (/ MS) utilizando análises de varredura ion Q3 precursor (digitalização de iões precursor Q1 pode causar tailing dos picos de iões precursor resultantes de colisões de argônio de baixa energia em Q2).
   4. Certifique-se de que o sistema LC-MS está executando adequadamente, analisando amostras de CQ e repetições técnicas. Prevenir a mistura de amostras utilizando colunas para LC feitas na hora e executando vários espaços em branco entre as amostras.
2. Analisar os espingarda LC-qq-MS (/ MS) os dados resultantes usando banco de dados busca contra as sequências dos padrões de peptídeos externos ^42. Se for o caso, descartar identificações peptídicas ambíguas usando os escores de identificação de péptidos de confiança (por exemplo, valores esperados) ou utilizando modelagem estatística ^42. Independentemente disso, rever manualmente todas as identificações de péptidos ⁴³ para garantir que todos eles são inequívocas.
3. Use a espingarda MS identificações peptídicas para construct uma biblioteca espectro usando um programa de software como o Skyline.
   1. Prepare uma lista de transição LC-SRM utilizando os 3-10 transições mais intensos por íon precursor (2 e 3 íons precursores; 1 e 2 de fragmentos de íons; Y-, B-, e A-iões que são ≥2 resíduos grandes).
   2. Descartar uma transição se os valores de precursor e o fragmento de iões m / z sobrepõem dentro da precisão de medição de massa do QQQ-EM (ião precursor de fragmentação é por vezes incompleto; lembrar de considerar o monoisotópico e os isótopos pesados ​​formas naturais, bem como a não marcado e formas heavy-identificadas).
   3. Da mesma forma, se uma transição descartar o fragmento ião m / z que se sobrepõe de um fragmento ião diferente a partir do mesmo precursor de ião.
4. Utilize as listas de transição resultante para efectuar análises de LC-SRM das misturas dos padrões de péptidos externos (executar espectrometria de massa, conforme descrito no Passo 3.1; Q1 e Q3 isolamento largura = 0,7 m / z, tempo de retenção = 2-50 ms).
5. Mamãenually rever os dados resultantes LC-SRM e excluir quaisquer ensaios de desempenho insatisfatório (a análise dos dados LC-SRM é descrito na Seção 5).

4. LC-SRM Os ensaios de amostras biológicas

1. Preparar os pratos de células cultivadas ^44. Se várias condições experimentais estão sendo comparados, bloco e embaralhar as amostras para reduzir eventuais desvios sistemáticos ^45.
2. Para cada placa de células, aspirar o meio de cultura de células para o lixo e suspender as células num tampão isento de soro ^44. Se necessário, lavar as células num tampão isento de soro para remover qualquer proteína extracelular restante.
3. Para cada amostra, contar o número de células viáveis ​​e totais utilizando uma mancha de viabilidade (por exemplo, azul de tripano) e um hemocitómetro ou um contador de células automatizado ^44.
4. Agregar as células por centrifugação, e aspirar os sobrenadantes para o lixo ⁴⁴ (um volume de sedimento celular típica é de ~ 30 ul).
5. Adicionar 400 ul de tampão de lise de ureia ou Tensioactivo tampão de lise a cada sedimento de células (100 mM de HEPES ∙ NaOH a pH 8, 10 uM de bestatina, 10 ^ M de cloridrato de pepstatina A, e ou 8 M de ureia ou 0,1% w / v de agente tensioactivo (respectivamente ); preparados na hora, use um surfactante compatível MS-ácido-lábil, como RapiGest SF ou PPS silenciosa surfactante). Se utilizar outros inibidores da protease, garantir que eles não inibem a tripsina.
6. Misture cada amostra utilizando pipetagem suave, e transferir para um tubo de cada 2 ml (com uma tampa de rosca com um anel-O) contendo ~ 100 l de 0,1 milímetros de zircônia / contas de sílica (note que as contas podem causar tubos snap-cap a vazar ). Lisar as células por vórtice as amostras durante 5 minutos à velocidade máxima (isto lisa as células por talão de batimento).
   1. Alternativamente, lisar as células com um processo mecânico diferente (por exemplo, usando um francês de imprensa ou de homogeneização dicas).
      Nota: Evitar centrifugação lisados ​​de células porque este pode sedimentar a proteína precipitada que poderia otherwise tryptically ser digerido e detectado por LC-MS.
7. Para as amostras desnaturadas surfactante, incubá-las a 90 ° C durante 10 minutos para auxiliar a homogeneização da amostra e a desnaturação de proteínas.
8. Banho sonicar as amostras durante 10 min a temperatura ambiente para ajudar a homogeneização e a desnaturação de proteínas.
   Nota: O tampão de lise e os lisados ​​podem ser armazenados a -80 ° C (o tampão de lise será necessário para obter as etapas 4.9 e 4.13).
9. Realizar um ensaio de concentração de proteína de ⁴⁶ (por exemplo, um ensaio de ácido bicinconínico) dos lisados ​​(e do tampão de lise como uma experiência de controlo).
10. Para as análises qualitativas (ou seja, não há padrões de peptídeos internos serão incrementadas-nas amostras), pipetas 200 mg (massa de proteína) de ligado celular em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para análises quantitativas, prepare quatro amostras, para uma série de diluição de isótopos estáveis.
11. Para cada amostra, adicionar um padrão de proteína interna (por exemplo </ Em>, adicione ~ 5 pmol de ~ 98% de vaga-lume puro luciferase).
12. Para análise quantitativa, adicionar a série de diluição com isótopos estáveis ​​da mistura equimolar dos padrões peptídicos internos (por exemplo, 0, 0,2, 2, 20 pmol de cada peptídeo) com as amostras.
    1. Em paralelo, preparar amostras de controlo, usando os padrões peptídicos interno sozinho (isto é, sem lisado celular) (por exemplo, 0, 0,2, 2, 20 pmol de cada péptido).
    2. Também preparar amostras de controlo que utilizam os padrões de péptidos externos e internos (por exemplo: 2 pmoles de cada péptido padrão externo, e 0, 0,2, 2, e 20 pmol de cada péptido padrão interno).
       Nota: Certifique-se de que os padrões de peptídeos são livres de ácido fórmico, pois pode interferir com a digestão de tripsina.
13. Adicionar tampão de lise, de modo que todas as amostras são volumes idênticos. Nota: Um volume de amostra típico é 70 ul, de modo que este volume irá ser utilizada para este protocolo.
14. Reduzir os resíduos de cisteína da proteína por adição de 0.7 ul de DTT 1 M (preparada de fresco) a cada amostra (a concentração final é de DTT 10 mM) e incubou-se as amostras a 60 ° C durante 30 min.
15. Cistinas alquilato de proteínas por adição de 7 uL de iodoacetamida tamponada (500 mM de iodoacetamida, 1 M de HEPES ∙ NaOH a pH 8;) preparadas de fresco para cada amostra (a concentração final é de iodoacetamida 50 mM) e a incubação das amostras à temperatura ambiente durante 20 minutos na escuridão (iodoacetamida é sensível à luz). Se necessário, extinguir a iodoacetamida remanescente por adição de DTT até uma concentração final de 50 mM.
16. Para cada uma das amostras desnaturadas usando ureia, adicionar 482 ul de 100 mM de HEPES ∙ NaOH a pH 8, de modo que a concentração final é de ureia a 1 M (tripsina é significativamente inibida a> 1 ⁴⁷ M de ureia).
17. Tryptically digerir as proteínas em péptidos.
    1. Para cada amostra, que contém lisado celular, adicionar 8 mL de 0,5 ug de grau de sequenciação / uL de tripsina modificada de modo que a última concentrat tripsinaião é de 1:50 (w proteína: w) de tripsina: amostra, e incuba-se a amostra a 37 ° C durante 18 h.
    2. Para cada amostra que não contenha lisado celular, adicionar 0,5 mL de 0,5 ug / sequenciação de grau modificado ul de tripsina, e incuba-se a amostra a 37 ° C durante 2 horas (cada uma destas amostras são para experiências de controlo, e contêm tipicamente apenas 10 ng -10 ug de péptido + massa de proteína).
18. Para cada uma das amostras desnaturadas ureia, adicionar 440 ul de 2% v / v de ácido fórmico (a concentração final de ácido fórmico é de 1% v / v). Confirme que estas amostras são pH ~ 3.
    1. Para cada uma das amostras desnaturadas surfactante, adicionar 914 ul de 0,5% v / v de TFA (a concentração final é de TFA a 0,5% v / v). Confirme que estas amostras são pH ~ 1,5. Incubar as amostras a 37 ° C durante 60 minutos para hidrolisar o surfactante.
19. Microcentrífuga todas as amostras a 21.000 × g durante 20 min à temperatura ambiente para sedimentar o grupo de cauda e qualquer outro agente tensioactivo precipitates que iria entupir um cartucho de SPE C-18.
20. Fase sólida extrair cada um dos sobrenadantes utilizando um C-18 descartável cartucho de SPE (Tampão A = 0,1% v / v de ácido fórmico; tampão B = 0,1% v / v de ácido fórmico, 80% v / v de ACN; ~ 100 mg de C- 18 resina por cartucho). Forçar as fases móveis, através do cartucho de SPE C-18 utilizando uma lâmpada de borracha de superfície plana, usando uma conduta distribuidora de extracção, ou por centrifugação do cartucho num tubo de centrífuga de 15 ml em 10 x g durante 5 min.
    1. Molhar da coluna por aplicação de 1 ml de Tampão B, equilibrar-lo através da aplicação de 1 ml de Tampão A, duas vezes, aplicar a amostra, e lava-se o cartucho através da aplicação de 1 ml de Tampão A, duas vezes. Elui-se os péptidos através da aplicação de 1 ml de Tampão B lentamente (~ 2 min).
21. Concentra-se cada eluído num concentrador de vácuo, para um volume final de 100 ul para evaporar ACN. Adicionar 200 ul de _H2O a cada amostra, e concentra-se cada uma em um concentrador de vácuo, para um volume final de 98 ul para evaporar qualquer re possívelmaining ACN.
22. Adicionar 2 mL de 5% v / v de ácido fórmico em ACN a cada amostra (as concentrações finais de amostra são de 0,1% v / v de ácido fórmico, a 2% v / v ACN).
    Nota: As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C.
23. Analisar as amostras utilizando LC-SRM (como no Passo 3.4). Para as análises qualitativa LC-SRM, execute as amostras biológicas e os padrões de peptídeos externos, e analisar todos os dados resultantes juntos. Para as análises quantitativa LC-SRM, executar a série de diluição isotópica de cada amostra biológica, e também executar os exemplos que consistem nos padrões de peptídeos sozinho, e analisar todos os dados resultantes juntos.

5. Análise de Dados LC-SRM

NOTA: identificação e quantificação Peptide pode ser altamente simplificada e parcialmente automatizados usando softwares como o Skyline, mas ainda é altamente recomendável que todos os dados da anotação ser revistos manualmente. Além disso, é melhor para excluir informações sobre o nível de proteínas durante annot Manualção de dados de LC-SRM para evitar viés.

1. Para cada péptido de identificação, confirmar que a forma de cada perfil de eluição de transição é de aproximadamente Gaussiana. Para cada transição, confirmar que o perfil de eluição é o produto dos múltiplos sinais medidos pelo detector MS (isto é, não é o produto de um ou dois pontos aleatórios de ruído MS).
2. Para cada péptido de identificação, assegurar que todo o perfil de eluição de péptidos é seleccionada. Evitar ajustar manualmente os limites do perfil de eluição de subcomponentes do péptido de identificação (o péptido pesado forma marcada, a forma não marcada, os iões individuais de precursor, e transições individuais).
3. Confirmar que cada perfil de eluição de transição tem uma relação sinal-para-ruído (S / N) ≥3. Nota: "Ruído" refere-se ao ruído aleatório MS, não reprodutíveis sinal de analitos coeluting. Cromatograma funções de suavização pode ajudar muito a análise dos dados ruidosos.
4. Para cada péptido de identificação,confirmar que todas as transições têm perfis de eluição quase idênticas (e não apenas vezes vértice do pico iguais; os perfis de eluição podem ter amplitudes diferentes).
5. Para as análises de LC-SRM de uma grande quantidade de padrões de péptidos (tipicamente ≥100 fmol de cada péptido), confirmar que os perfis de eluição de péptidos correspondentes são muito intensos (normalmente s / n ≥100), e que as identificações de péptidos não são ambíguas. Nota: Estas identificações altamente confiável serão críticos para a identificação dos péptidos correspondentes derivados em amostras biológicas.
6. Para cada identificação de péptidos, confirmar que as intensidades de transição relativos coincidir com os do padrão de peptídeo com confiança identificados. Se necessário, descarte, relativamente baixa intensidade perfis de eluição de transição ruidosos, mas confirmam que nenhuma das transições relativamente intensos estão faltando. Desconsidere perfis de eluição de transição relativamente intensos que são significativamente e de forma inequívoca afetados por uma coeluindo contaminante.
7. Para cada identificação de péptidos, estimar a probabilidade de que ele foi produzido aleatoriamente pelo sinal de fundo (ruído aleatório MS acrescido de sinal reprodutível de analitos coeluting).
   1. Estimar essa probabilidade manualmente, examinando todo o cromatograma LC-SRM e estimar a singularidade de cada identificação de péptidos. Produzir um conjunto de identificações peptídicas confiantes que tem uma taxa estimada falsa descoberta (FDR) de 5%. Use critérios mais rigorosos (por exemplo, FDR ≤1%) se for necessária uma maior confiança conjunto de identificações (não é recomendado o uso de critérios mais flexíveis).
   2. Em alternativa, usar o algoritmo mProphet ⁴⁸ ou o algoritmo de Auditoria ^49, mas reveja manualmente os resultados.
8. Para cada péptido de identificação, confirmam que o tempo de eluição observado é consistente com a hidrofobicidade do péptido (Skyline é concebido para desempenhar este cálculo).
9. Para cada péptido, que confirmamseu tempo de eluição é consistente entre os LC é executado.
   NOTA: LC-SRM análises, por vezes, produzir perfis de eluição que são sistematicamente enviesado entre as execuções. Desvios sistemáticos são de esperar depois alterações do instrumento, tais como a substituição de uma coluna. Além disso, os peptídeos que eluem cedo pode ser propenso a deslocar (em especial se a coluna é carregada perto de capacidade), e péptidos que eluem final também pode ser propenso a deslocar. Identificação Peptide agora está completa.
10. Para melhorar a quantificação péptido, inspecionar novamente cada péptido de identificação e descartar um perfil de eluição de transição se é especialmente barulhento em comparação com os outros perfis de eluição de transição do péptido de identificação. Descarte um perfil de eluição de transição, se a sua intensidade de transição relativo é errado (em comparação com o padrão de péptido).
11. Inspeccionar os limites de cada um dos perfis de eluição e ião precursor de transição. Se necessário, ajuste com cuidado as fronteiras perfil de eluição para cortar afastado sinal de fundo (ou ifundo ELHORAR estimativa do sinal).
12. Para cada padrão de péptido interno, verificar se está contaminado com uma quantidade detectável de péptido luz (determinado por LC-SRM análises dos padrões peptídicos internos sozinho, descrito acima). Posteriormente, descartar quaisquer perfis leves de eluição de péptidos que foram comprometidos de forma significativa pela contaminação de luz peptídeo dentro dos padrões de peptídeos internos.
13. Quantificar cada perfil de eluição de transição calculando a sua área de pico LC. Se for caso disso, deduzir o sinal de fundo estimado. Quantificar cada perfil de eluição de péptidos pela soma dos valores de quantificação transição correspondentes (a seguir, isto é referido como o valor "Sum_Peak_Area"). Para cada valor Sum_Peak_Area péptido amostra biológica, calcular a abundância molar de péptido amostra biológica usando dados de LC-SRM de padrões peptídicos internos ou externos (uso apenas as transições que foram quantificados com sucesso tanto pelo péptido amostra biológicaLC-SRM e que o padrão de péptido).
    1. Quantificação utilizando padrões de peptídeos externos (não recomendado):
       1. Traçar os valores Sum_Peak_Area padrão peptídicas externo versus os valores de abundância padrão molar peptídeo externo. Produzir uma curva padrão por ajuste de uma regressão linear aos dados (tipicamente, apenas o componente linear da faixa dinâmica devem ser utilizados, e qualquer componente não linear deve ser usado com cuidado extremo). Para cada valor Sum_Peak_Area péptido amostra biológica, usar a curva padrão para calcular a abundância molar de péptido.
          Nota: Este método de quantificação não é recomendado porque ele requer que a preparação da amostra e LC-SRM ser demonstrabilidade robusta porque as amostras biológicas e padrões de peptídeos externos são preparadas e analisadas por LC-SRM separadamente. Além disso, ele não tem em conta os efeitos da matriz (efeitos devido a componentes de uma amostra que não seja a substância a analisar).
    2. Quantificação usando internopadrões de peptídeos (recomendado):
       1. Para cada valor Sum_Peak_Area peptídeo amostra biológica e correspondente peptídeo interno valor Sum_Peak_Area padrão heavy-rotulados, calcular a razão leve / pesado. Use este rácio como uma medida da / péptido pesado proporção molar abundância luz correspondente para calcular a abundância molar do péptido amostra biológica. Especificamente, a abundância molar peptídeo amostra biológica é igual ao peptídeo interno abundância molar padrão multiplicado pela relação Sum_Peak_Area leve / pesado.
       2. Para cada replicado e péptido alvo biológico, identificar a gama linear da quantificação LC-SRM, criando uma curva padrão, utilizando uma regressão linear. Especificamente, plotar os valores de abundância molar padrão peptídeo interno versus os valores da relação pesados ​​de luz / Sum_Peak_Area (note que a massa da amostra biológica é constante em todo o conjunto de dados). Exigir que cada amostra valor peptídeo Sum_Peak_Area biológica está dentro da faixa linear (typicaliado, apenas o componente linear da faixa dinâmica deve ser utilizado; qualquer componente não linear deve ser usado com cuidado extremo). Da mesma forma, executar esta etapa para cada transição peptídeo alvo.
          Nota: Analyte quantificação por LC-qq-SRM deve ser linear ao longo de uma ampla faixa dinâmica (~ 10000). Na extremidade baixa, sinal de fundo (ruído aleatório MS acrescido de sinal reprodutível de analitos coeluting) irá reduzir a precisão quantificação e precisão. Na parte alta, saturação detector causará linearidade (em última análise, isso pode causar perfis de eluição de partida para ser plana em uma intensidade de sinal específico).
14. Se apropriado, a uma normalização global em amostras, tais como uma normalização tendência central ^50, para corrigir pequenas diferenças na quantidade de amostra, antes da cravação-no dos padrões peptídicos internos. Se necessário, use apenas as proteínas de limpeza do Passo 1.1.
15. Se necessário, imputar falta quantification valoriza ^51,52.
    Nota: É impróprio para simplesmente substituir os valores em falta com a metade do limite inferior de quantificação (LIQ) ou a metade do limite de detecção (LOD), pois isso reduziria artificialmente variância quantificação, e pode resultar em um teste estatístico (por exemplo, uma análise de variância ), produzindo um resultado falso positivo (um erro de tipo I). No entanto, ignorando os valores em falta também pode ser problemática. Por exemplo, se metade dos valores de abundância verdadeiros estão abaixo do LOD, ea outra metade estão acima do LLOQ, em seguida, a média observada abundância seria superestimar a verdadeira abundância dizer.
16. Certifique-se de que os ensaios satisfazer as orientações amplamente aceitas para LC-SRM ^23-25. Notavelmente, exigem que o coeficiente de variação dos valores de quantificação é tipicamente ≤25% para ensaios clínicos, e ≤35% para os ensaios clínicos ^não-25. Para os ensaios de LC-SRM relacionados à saúde e veterinária produtos ou serviços que estão a ser consideradas para a aplicação de regulamentaçãoRoval, exigem que os ensaios de satisfazer os mais estritos requisitos de precisão para estes ensaios: "A precisão determinado em cada nível de concentração não deve exceder 15% do coeficiente de variação (CV), excepto para o LIQ, em que não deve exceder 20% do CV ^"23,24.

Resultados

O desenvolvimento de modelos computacionais preditivos de vias de transdução de sinal é um dos objectivos fundamentais da Biologia de Sistemas ^53. Infelizmente, mesmo para as vias de sinalização que têm sido estudados extensivamente e têm um elevado significado clínico, que ainda não é geralmente possível prever o comportamento quantitativamente via em resposta a perturbações (por exemplo, isto é verdadeiro para a MAPK / ERK ^54). Recentemente, uma investigação empregada pro...

Discussão

Quantificação absoluta de proteína é essencial para uma gama muito diversificada de aplicações biomédicas tais como validação de biomarcadores e modelagem via de transdução de sinal. Recentemente, proteômica direcionados utilizando LC-SRM beneficiou de melhorias para várias tecnologias, incluindo a preparação de péptidos padrão, HPLC, qq-MS, e análise de dados LC-SRM. Por conseguinte, tornou-se uma alternativa poderosa para imunoensaios. Imunoensaios podem ser extremamente sensíveis e de alto rendimen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit	Fisher	23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm	BioSpec Products	11079101z
Bestatin hydrochloride	Sigma	B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)	Lonza	12-614F
Cell culture EDTA, 500mM, pH8	Gibco	15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11550
Cell culture L-glutamine	Sigma	G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco	10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v	Lonza	17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules	Fisher	A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep	Marienfeld-Superior	0640030
HEPES, 1M, pH 7.2	Mediatech	25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-2000
LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media	Michrom Bioresources	PM5/61200/00
LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media	Michrom Bioresources	PM3/93100/00
LC coated silica capillary, 50µm id	Polymicro Technologies	1068150017
LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene	SUN SRI	200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone	SUN SRI	500-061
Luciferase, from Photinus pyralis	Sigma	L9506-1MG
Pepstatin A	EMD Millipore	516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)	EMD Chemicals	9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail	Roche	04906837001
RapiGest SF	Waters	186001861
Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge	Waters	WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position	Waters	WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb	Fisher	03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
SpeedVac vacuum concentrator	Fisher	SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Tube decapper for Micronic tubes	USA Scientific	1765-4000
Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile	Sarstedt	72.694.006
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS grade	Fisher	W6-1