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Method Article
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Expériences protéomiques qui utilisent la spectrométrie de masse (MS) peuvent être conçus pour utiliser soit non ciblée (fusil de chasse) ou des méthodes ciblées. protéomique de découverte repose généralement sur shotgun bottom-up MS, soit en utilisant un mode d'acquisition traditionnelle dépendant des données, ou en utilisant l'une des techniques de données indépendante récemment développés (par exemple, MS E, COULOIR) 1,2. Protéomique fusil de chasse est un outil puissant pour l'identification à haut débit de peptide et la quantification relative, mais il est généralement impropre à la quantification absolue ou pour cibler les petits ensembles définis (~ RTE) de protéines. La méthode de MS le plus souvent utilisé pour la protéomique ciblées est sélectionné surveillance de réaction (SRM) en raison de sa haute sensibilité, la vitesse, et la gamme dynamique 3-5. Alternatives à SRM comprennent la surveillance de réaction parallèle, qui tire parti de haute résolution, MS balayage complet 6.
SRM est habituellement effectuée en utilisant un rever nano-débitChromatographie sed phase liquide à haute performance (nano-RP-LC) couplée à un instrument ionisation nano-électrospray (nano-ESI) source d'ions attaché à un spectromètre de masse triple quadripôle (QQQ-MS). Dans une expérience typique, les protéines de l'échantillon sont digérés par protéolyse, et les peptides obtenus sont séparés par chromatographie, désorbés, et ionisés. Les ions précurseurs qui en résultent sont m / z filtré par le premier quadrupôle (Q1) et fragmentée dans le deuxième quadrupôle (Q2) par les collisions avec un gaz de collision. Les ions fragments résultant sont m / z-filtré dans le troisième quadrupôle (Q3) et quantifié par une dynode. Chaque paire de précurseur et ion de fragment est considéré comme une transition, et chaque transition est surveillée pour une période déterminée de temps (le temps de séjour; typiquement 2-50 msec). Pendant LC-SRM, les cycles QQQ-MS à travers une liste prédéfinie de transitions (le cycle de service est généralement ≤3 sec), et un chromatogramme de chaque transition est produite.
Alternative stratégs pour la quantification des protéines utilisent généralement des dosages immunologiques tels que des transferts de points, des transferts de Western, ELISA, anticorps, puces inverse des puces à protéines de phase, immunoessais microfluidiques, ELISA numériques et immunoessais base microsphères-7. Les meilleurs dosages immunologiques peuvent être beaucoup plus sensibles que les LC-SRM, et le débit de l'échantillon des immunodosages peuvent être significativement supérieur à celui de LC-SRM 5. Cependant, immunoessais en développement peuvent être coûteux et / ou de temps, et les dosages en résultent peuvent être vulnérables à la réactivité croisée et / ou des interférences, incompatible avec la cellule / lyse des tissus / méthodes d'homogénéisation et / ou ne se prêtent pas au multiplexage 5,8. Certains de ces problèmes peuvent être résolus par couplage techniques anticorps-et MS. Par exemple, les protéines cibles peuvent être enrichies en utilisant une immunoprécipitation préalable à la protéolyse et LC-SRM 12/09. En variante, la technique d'immunoprécipitation SISCAPA emploie ultérieure à la protéolyse à la leve peptidiquel 13,14. En plus des stratégies immunoenrichment, immunodéplétion de protéines de grande abondance peut être utilisé pour augmenter la sensibilité LC-SRM en réduisant les interférences par coélution analytes 15,16.
Quantification des protéines MS peut être divisé en quantification relative et absolue, et aussi dans et stable sans marqueur isotopique étiquetage (par exemple, l'étiquetage métabolique, l'étiquetage des produits chimiques, et de protéines lourde marqué et peptidiques normes internes). Techniques sans étiquette peut être utile pour la quantification des protéines rapport, mais ne conviennent pas pour la quantification absolue précision. Par comparaison, les techniques de marquage ont réduit erreur associée à la préparation de l'échantillon et la variance MS, et sont souvent utilisés pour la protéine par rapport quantification 17. Par exemple, les normes (Silap) des isotopes stables du protéome marqué préparés en utilisant une lignée cellulaire humaine cultivées permis quantification relative de biomarqueurs potentiels via LC-SRM de sérum humain 18. Absolue précise la quantification des protéines par MS exige que les normes internes purifiée, quantifiés, protéines ou peptides marqués par des isotopes être dopés-en échantillons biologiques avant MS. L'incorporation des normes internes marqués d'isotopes lourd dans un flux de travail LC-SRM permet une quantification absolue qui a été montré pour être hautement reproductible et transférable entre les laboratoires 16,19.
Isotopes stables étiquetés normes internes pour la protéine absolue quantification par MS comprennent des normes peptidiques préparés en utilisant la synthèse en phase solide 20, composées de protéines normes peptidiques de la protéase clivable concaténés 21, et 22 normes protéines pleine longueur. Cible de modification covalente de protéines et de préparation de l'échantillon incomplet (c.-à-lyse incomplète de l'échantillon et l'homogénéisation, et incomplète solubilisation de la protéine, dénaturation, alkylation, et la protéolyse) peut nuire à une quantification précise. P internerotein normes sont les moins susceptibles d'être affectés par la plupart de ces problèmes potentiels, mais ils sont généralement les plus difficiles à préparer. Une alternative consiste à analyser chaque protéine cible à l'aide de multiples normes de peptides internes qui sont conçues pour inclure des résidus flanquant natifs amino et du carboxy terminal. Indépendamment du type de l'étalon interne est utilisé, il doit être enrichi dans les échantillons-biologiques au plus tôt un point lors de la préparation de l'échantillon que possible. En outre, les techniques de préparation d'échantillons multiples (par exemple, différentes conditions de dénaturation) doivent être testés. L'utilisation de plusieurs techniques expérimentales orthogonales (cross-validation expérimentale) est une stratégie viable pour surmonter les plus quantification potentiel défis 23-25.
LC-SRM quantification de protéines est une technique très souple qui a été utilisée dans une grande variété d'applications. Notamment, il a été utilisé pour étudier peptides et de protéines à l'intérieur de biomarqueurséchantillons cliniques tels que le sérum, les biopsies de base, et des aspirations à l'aiguille fine 5. LC-SRM a également été utilisée pour mesurer la stoechiométrie des complexes protéiques 5,26, pour détecter des neurotoxines botuliniques 27, pour quantifier la dynamique de phosphorylation de protéine à l'intérieur des voies de signalisation 5, et à quantifier des changements dans la conformation des protéines 28.
Notre laboratoire utilise LC-SRM pour quantifier les protéines de signalisation qui interviennent dans le chimiotactisme des macrophages pour soutenir le développement de simulations de la voie de la chimiotaxie. Le schéma global du protocole (Figure 1) commence avec le classement des peptides cibles provisoires. Par la suite, les normes peptidiques externes bruts sont synthétisés et utilisés pour développer des tests LC-SRM pour des analyses qualitatives des échantillons biologiques. Si le peptide cible biologique de l'échantillon dérivé est détectée, les normes lourds marqué purifiés peptidiques internes sont préparés pour quantitative LC-SRM. Ce protocole peut être utilisé pour acquantifier curately protéines à partir d'une grande variété d'échantillons biologiques, et d'appuyer les enquêtes d'une grande variété de protéines cibles.
NOTE: Cette méthode a été décrite précédemment 56.
1. Sélection peptide cible
2. Préparation d'un peptide normes
NOTE: Cette section du protocole décrit la préparation d'un ensemble de vingt normes de peptide lyophilisé (chacun étant 1 nmol en quantité) pour des analyses en aval. Pour un nombre différent de peptides, ou pour des quantités de peptides différents, il devra être ajustée en conséquence.
3. LC-SRM Assay développement
4. LC-SRM dosages d'échantillons biologiques
5. Analyse LC-SRM données
NOTE: identification et la quantification de peptides peuvent être très simplifiées et partiellement automatisés à l'aide de logiciels tels que Skyline, mais il est toujours fortement recommandé que tous annotation des données soit revu manuellement. Aussi, il est préférable d'exclure les informations de niveau de protéines pendant Annot manuelation des données LC-SRM pour empêcher partialité.
Le développement de modèles informatiques de prévision de voies de signalisation est l'un des objectifs fondamentaux de la biologie des systèmes 53. Malheureusement, même pour les voies qui ont été largement étudiés et ont une haute signification clinique de signalisation, il est encore généralement pas possible de prédire quantitativement le comportement voie en réponse à des perturbations (par exemple, cela est vrai pour le / ERK MAPK 54). Récemment, une enquête emplo...
Absolute quantification de protéine est essentielle pour une gamme très diversifiée d'applications biomédicales telles que la validation de biomarqueurs et la transduction du signal de modélisation de la voie. Récemment, la protéomique ciblées utilisant LC-SRM a bénéficié des améliorations apportées à de nombreuses technologies, y compris peptide préparation standard, HPLC, QQQ-MS et LC-SRM analyse des données. Par conséquent, il est devenu une alternative puissante aux immunoessais. Immunoessais pe...
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
Urea | Sigma | U0631-500g | |
Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
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