Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines

Résumé

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Résumé

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of G_i2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.

Introduction

Expériences protéomiques qui utilisent la spectrométrie de masse (MS) peuvent être conçus pour utiliser soit non ciblée (fusil de chasse) ou des méthodes ciblées. protéomique de découverte repose généralement sur ​​shotgun bottom-up MS, soit en utilisant un mode d'acquisition traditionnelle dépendant des données, ou en utilisant l'une des techniques de données indépendante récemment développés (par exemple, MS ^E, COULOIR) ^1,2. Protéomique fusil de chasse est un outil puissant pour l'identification à haut débit de peptide et la quantification relative, mais il est généralement impropre à la quantification absolue ou pour cibler les petits ensembles définis (~ RTE) de protéines. La méthode de MS le plus souvent utilisé pour la protéomique ciblées est sélectionné surveillance de réaction (SRM) en raison de sa haute sensibilité, la vitesse, et la gamme dynamique ^3-5. Alternatives à SRM comprennent la surveillance de réaction parallèle, qui tire parti de haute résolution, MS balayage complet ^6.

SRM est habituellement effectuée en utilisant un rever nano-débitChromatographie sed phase liquide à haute performance (nano-RP-LC) couplée à un instrument ionisation nano-électrospray (nano-ESI) source d'ions attaché à un spectromètre de masse triple quadripôle (QQQ-MS). Dans une expérience typique, les protéines de l'échantillon sont digérés par protéolyse, et les peptides obtenus sont séparés par chromatographie, désorbés, et ionisés. Les ions précurseurs qui en résultent sont m / z filtré par le premier quadrupôle (Q1) et fragmentée dans le deuxième quadrupôle (Q2) par les collisions avec un gaz de collision. Les ions fragments résultant sont m / z-filtré dans le troisième quadrupôle (Q3) et quantifié par une dynode. Chaque paire de précurseur et ion de fragment est considéré comme une transition, et chaque transition est surveillée pour une période déterminée de temps (le temps de séjour; typiquement 2-50 msec). Pendant LC-SRM, les cycles QQQ-MS à travers une liste prédéfinie de transitions (le cycle de service est généralement ≤3 sec), et un chromatogramme de chaque transition est produite.

Alternative stratégs pour la quantification des protéines utilisent généralement des dosages immunologiques tels que des transferts de points, des transferts de Western, ELISA, anticorps, puces inverse des puces à protéines de phase, immunoessais microfluidiques, ELISA numériques et immunoessais base ^{microsphères-7.} Les meilleurs dosages immunologiques peuvent être beaucoup plus sensibles que les LC-SRM, et le débit de l'échantillon des immunodosages peuvent être significativement supérieur à celui de LC-SRM ^5. Cependant, immunoessais en développement peuvent être coûteux et / ou de temps, et les dosages en résultent peuvent être vulnérables à la réactivité croisée et / ou des interférences, incompatible avec la cellule / lyse des tissus / méthodes d'homogénéisation et / ou ne se prêtent pas au multiplexage ^5,8. Certains de ces problèmes peuvent être résolus par couplage techniques anticorps-et MS. Par exemple, les protéines cibles peuvent être enrichies en utilisant une immunoprécipitation préalable à la protéolyse et LC-SRM ^12/09. En variante, la technique d'immunoprécipitation SISCAPA emploie ultérieure à la protéolyse à la leve peptidiquel ^13,14. En plus des stratégies immunoenrichment, immunodéplétion de protéines de grande abondance peut être utilisé pour augmenter la sensibilité LC-SRM en réduisant les interférences par coélution analytes ^15,16.

Quantification des protéines MS peut être divisé en quantification relative et absolue, et aussi dans et stable sans marqueur isotopique étiquetage (par exemple, l'étiquetage métabolique, l'étiquetage des produits chimiques, et de protéines lourde marqué et peptidiques normes internes). Techniques sans étiquette peut être utile pour la quantification des protéines rapport, mais ne conviennent pas pour la quantification absolue précision. Par comparaison, les techniques de marquage ont réduit erreur associée à la préparation de l'échantillon et la variance MS, et sont souvent utilisés pour la protéine par rapport quantification ^17. Par exemple, les normes (Silap) des isotopes stables du protéome marqué préparés en utilisant une lignée cellulaire humaine cultivées permis quantification relative de biomarqueurs potentiels via LC-SRM de sérum humain ¹⁸. Absolue précise la quantification des protéines par MS exige que les normes internes purifiée, quantifiés, protéines ou peptides marqués par des isotopes être dopés-en échantillons biologiques avant MS. L'incorporation des normes internes marqués d'isotopes lourd dans un flux de travail LC-SRM permet une quantification absolue qui a été montré pour être hautement reproductible et transférable entre les laboratoires ^16,19.

Isotopes stables étiquetés normes internes pour la protéine absolue quantification par MS comprennent des normes peptidiques préparés en utilisant la synthèse en phase solide ^20, composées de protéines normes peptidiques de la protéase clivable concaténés ^21, et ²² normes protéines pleine longueur. Cible de modification covalente de protéines et de préparation de l'échantillon incomplet (c.-à-lyse incomplète de l'échantillon et l'homogénéisation, et incomplète solubilisation de la protéine, dénaturation, alkylation, et la protéolyse) peut nuire à une quantification précise. P internerotein normes sont les moins susceptibles d'être affectés par la plupart de ces problèmes potentiels, mais ils sont généralement les plus difficiles à préparer. Une alternative consiste à analyser chaque protéine cible à l'aide de multiples normes de peptides internes qui sont conçues pour inclure des résidus flanquant natifs amino et du carboxy terminal. Indépendamment du type de l'étalon interne est utilisé, il doit être enrichi dans les échantillons-biologiques au plus tôt un point lors de la préparation de l'échantillon que possible. En outre, les techniques de préparation d'échantillons multiples (par exemple, différentes conditions de dénaturation) doivent être testés. L'utilisation de plusieurs techniques expérimentales orthogonales (cross-validation expérimentale) est une stratégie viable pour surmonter les plus quantification potentiel défis ^23-25.

LC-SRM quantification de protéines est une technique très souple qui a été utilisée dans une grande variété d'applications. Notamment, il a été utilisé pour étudier peptides et de protéines à l'intérieur de biomarqueurséchantillons cliniques tels que le sérum, les biopsies de base, et des aspirations à l'aiguille fine ^5. LC-SRM a également été utilisée pour mesurer la stoechiométrie des complexes protéiques ^5,26, pour détecter des neurotoxines botuliniques ^27, pour quantifier la dynamique de phosphorylation de protéine à l'intérieur des voies de signalisation ^5, et à quantifier des changements dans la conformation des protéines ^28.

Notre laboratoire utilise LC-SRM pour quantifier les protéines de signalisation qui interviennent dans le chimiotactisme des macrophages pour soutenir le développement de simulations de la voie de la chimiotaxie. Le schéma global du protocole (Figure 1) commence avec le classement des peptides cibles provisoires. Par la suite, les normes peptidiques externes bruts sont synthétisés et utilisés pour développer des tests LC-SRM pour des analyses qualitatives des échantillons biologiques. Si le peptide cible biologique de l'échantillon dérivé est détectée, les normes lourds marqué purifiés peptidiques internes sont préparés pour quantitative LC-SRM. Ce protocole peut être utilisé pour acquantifier curately protéines à partir d'une grande variété d'échantillons biologiques, et d'appuyer les enquêtes d'une grande variété de protéines cibles.

Protocole

NOTE: Cette méthode a été décrite précédemment ^56.

1. Sélection peptide cible

1. Dresser une liste des protéines cibles, et inclure un petit nombre de protéines de ménage pour la normalisation à travers des échantillons biologiques, et comprennent également une norme de protéine interne (par exemple, la luciférase de luciole). Digérer les protéines cibles en peptides tryptiques in silico en utilisant un outil logiciel tels que la digestion des protéines Simulator ^29,30.
2. Exiger que les peptides sont entièrement tryptique et ne contiennent aucun des sites de clivage de la trypsine manquantes. Évitez les peptides avec des sites de clivage de la trypsine voisins pour éviter potentiellement incomplètes digestion de la trypsine ^31.
3. Exiger que la longueur de chaque peptide est de 5 à 20 résidus. Envisager des peptides plus longs, mais il faut noter qu'ils sont généralement plus coûteux à synthétiser.
4. Évitez un peptide si elle correspond à une variante génétique naturelle (par exemple, un seul nucléotide-e polymorphisme). Confirment également que les emplacements ne sont pas affectés de la trypsine (étape 1.2).
5. Éviter un peptide si elle correspond à un site de modification post-traductionnelle (PTM). De même, d'éviter un peptide si elle serait sujette à des modifications chimiques au cours de LC-MS préparation de l'échantillon. En particulier, d'éviter les peptides sujettes à l'oxydation de la cystéine et la méthionine, l'asparagine et la glutamine désamidation, la glutamine et la formation d'amino-terminale de pyroglutamate. Confirmer que les sites de la trypsine ne sont pas affectés (étape 1.2).
   1. En outre, d'éviter les peptides qui proviennent d'amino- et carboxy de la protéine car extrémités terminales des protéines sont sujettes à la modification post-traductionnelle (la perte de methionine amino-terminal et une acétylation, et l'amidation carboxy-terminale).
6. Exiger que chaque peptide cible est unique à chaque protéine cible. Si cela est impossible, exiger que le peptide est unique à un ensemble d'isoformes / homologues. Traiter les peptides ne diffèrent que par la leucine / isoleucine de substitutioncomme si elles étaient identiques lors de la détermination peptide unique parce que ceux-ci effectuent presque identique pendant LC-SRM.
   1. Si une analyse du transcriptome complet de l'ensemble des échantillons biologiques a été effectuée (par exemple, l'ARN-seq), déterminer peptide unique en utilisant des traductions de la transcription des séquences in silico ³² au lieu d'utiliser l'ensemble du protéome de l'espèce.
7. Exiger que les peptides cibles sont protéotypique. Identifier des peptides protéotypiques moyen d'un fusil de spectrométrie de masse ^1,2 des échantillons biologiques à l'étude. Alternativement, récupérer identifications peptidiques de peptides protéotypiques des bases de données de protéomique en ligne tels que la spectrométrie de masse NIST bibliothèques ³³ (http://peptide.nist.gov/), le protéome machine mondial ³⁴ (X HUNTER bibliothèques spectrales de http: // www .thegpm.org / HUNTER / index.html, et GPMDB peptidiques identifications de http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas ³⁵ (http://www.peptideatlas.org/), et la base de données de PRIDE ³⁶ (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
8. Si au niveau du compte rendu des analyses quantitatives des échantillons biologiques ont été effectués (par exemple, l'ARN-Seq, qPCR), puis éviter de cibler les peptides qui correspondent aux transcriptions d'abondance relativement faibles.
9. Si nécessaire, sélectionner des peptides cibles qui peuvent être utilisées pour des dosages LC-SRM des orthologues des protéines cibles (par exemple, pour analyser à la fois les formes de la souris d'une protéine cible et humain).
10. Sélectionner au moins deux peptides cibles par protéine cible (si possible).

2. Préparation d'un peptide normes

NOTE: Cette section du protocole décrit la préparation d'un ensemble de vingt normes de peptide lyophilisé (chacun étant 1 nmol en quantité) pour des analyses en aval. Pour un nombre différent de peptides, ou pour des quantités de peptides différents, il devra être ajustée en conséquence.

1. Préparer normes lyophilisées peptidiques (≥1 d'nmol) en utilisant une technologie de synthèse peptidique telle que la synthèse SPOT ^20,37.
   1. Veiller à ce que les résidus cystéine de normes peptidiques externes sont carbamidomethylated (la structure chimique formé par alkylation iodoacétamide). En revanche, en sorte que les résidus de cysteine ​​des normes de peptides internes sont non modifié (ceux-ci seront alkylé pendant la préparation de l'échantillon, décrite ci-dessous).
   2. Normes de conception de peptides internes de manière qu'elles contiennent native amino- et carboxy-terminale des résidus flanquant (pour contrôler l'efficacité de digestion de la trypsine; chacun d'eux est généralement de trois à six résidus de long).
   3. Concevoir des normes peptidiques internes afin qu'ils soient isotope stable marqué. Considérons le profil isotopique naturelle du peptide cible et la précision de la mesure de masse de la station mobile lors de la sélection d'une stratégie de marquage peptidique. Ne pas utiliser les normes peptidiques deutérées car les causes peptide de deutération en phase inverse temps de rétention de LCs à ³⁸ déplacer.
      Remarque: En règle générale, les normes de peptides tryptiques internes sont synthétisés en utilisant ~ 98% ^[13 C _6, ¹⁵ N _4] Arg et ^[13 C _6, ¹⁵ N _2] Lys incorporé à l'extrémité carboxy-terminales.
   4. Purifier normes peptidiques internes par HPLC ^39, et de quantifier avec précision les ^40.
2. Ajouter 100 ul de 0,1% v / v d'acide formique, 20% v / v d'acétonitrile (ACN) pour chaque 1 nmol lyophilisée Indice de peptide pour produire une concentration de peptide de 10 uM (utilisation de soin que le peptide lyophilisé peut avoir une très basse densité et peut être facilement perdu). Vortex les échantillons pendant 2 minutes et le bain sonication eux pendant 5 minutes pour assurer que le peptide dissolution complète.
3. Regrouper les peptides en solution, et on concentre le mélange résultant dans un concentrateur sous vide à un volume final de 80 ul. Ajouter 20 ul d'ACN pour dissoudre tout peptide précipité.
   Remarque: L'échantillon désormais contains 10 uM de chaque peptide et 20% v / v d'ACN.
4. Pour les normes peptidiques internes, préparer une série de dilution pour quantitative LC-SRM:
   1. Préparer 100 ul d'une dilution 1 uM: combiner 90 ul de 20% v / v d'ACN et 10 ul du mélange de peptides de 10 uM.
   2. Préparer 100 ul d'une dilution 100 nM: combiner 90 ul de 20% v / v d'ACN et 10 ul du mélange de peptides de 1 uM.
5. Pour peptidiques standards externes, préparer 100 ul d'une dilution à 1 uM pour LC-MS en combinant 90 ul de 0,1% v / v d'acide formique et 10 ul du mélange de peptides de 10 uM.
   Note: L'échantillon contient maintenant une uM de chaque peptide, v / v d'acide formique à 0,1% et 2% v / v ACN, et est prêt à être utilisé pour le développement de tests LC-SRM.

3. LC-SRM Assay développement

1. Analyser les mélanges des normes peptidiques externes (environ 1-10 pmol de chaque peptide par injection) par MS en utilisant un fusil de chasse HPL nano-débitC système couplé à un spectromètre de masse triple quadripôle (LC-MS-QQQ (/ MS)).
   1. Utilisez un système LC-MS équipé d'une colonne capillaire emballé avec C-18 médias (≤5 de diamètre, um ~ 200 pores de A, longueur ≥10 cm, id = 50-100 um) et une pointe nano-ESI (généralement produites à l'aide un laser-extracteur). Assurez-vous que chaque série LC-MS comprend un gradient min ~ 60 linéaire (typiquement, 0-40% de solvant B), une étape colonne de régénération (~ 80% de solvant B), et une étape colonne ré-équilibrage (~ 0% de solvant B ) (solvant A = 0,1% v / v d'acide formique dans H ₂ O, solvant B = 0,1% v / v d'acide formique dans de l'ACN, débit = 200 à 800 nl / min, tension ESI = 1,800 V, la largeur d'isolation de Q3 = 0,7 m / z, pression d'argon de Q2 = 1,5 mTorr).
   2. Pour chaque balayage précurseur d'ions, sélectionner dynamiquement le haut ~ 10 ions précurseurs les plus intenses pour la spectrométrie de masse en tandem (SM / SM). Exécuter chaque échantillon en double exemplaire, de telle sorte que deux rampes de l'énergie de collision différents sont utilisés: l'un destiné à fragmenter de façon optimale deux ions précurseurs, et l'autrepour trois précurseur ions ^41.
   3. Effectuez la LC-MS-QQQ (/ MS) analyses par analyse ion précurseur de Q3 (de balayage précurseur d'ions Q1 peut causer des résidus des pics précurseur d'ions résultant de collisions d'argon à faible énergie au T2).
   4. Assurez-vous que le système LC-MS-ci fonctionne correctement en analysant des échantillons de CQ et répétitions techniques. Éviter le report d'échantillon à l'aide de colonnes CL fraîchement préparés et en exécutant plusieurs ébauches entre les échantillons.
2. Analyser les fusil de chasse LC-MS-QQQ (/ MS) à l'aide de données issues base de données de recherche contre les séquences des normes peptidiques externes ^42. Le cas échéant, jetez identifications peptidiques ambiguës utilisant les scores d'identification de peptide de confiance (par exemple, les valeurs moyennes) ou en utilisant la modélisation statistique ^42. Peu importe, examiner manuellement tous les identifications peptidiques ⁴³ pour assurer qu'ils sont tous sans ambiguïté.
3. Utilisez le fusil de chasse MS identifications peptidiques de construct une bibliothèque de spectre en utilisant un logiciel tel que Skyline.
   1. Préparer une liste de transition LC-SRM en utilisant les 3-10 transitions les plus intenses par ion précurseur (2 et 3 ions précurseurs; +1 et +2 fragments ions; y-, b-, et a-ions qui sont ≥2 résidus long).
   2. Jeter une transition si le précurseur et le fragment ion m / z valeurs se chevauchent au sein de la précision de mesure de masse de la QQQ-MS (fragmentation précurseur d'ions est parfois incomplète, souvenez-vous de considérer la monoisotopique et les formes isotopiques naturelles lourds, ainsi que la non marqué et formes lourde marqué).
   3. De même, jetez une transition si le fragment ions m / z chevauche celle d'un autre ion fragment de la même ion précurseur.
4. Utilisez les listes de transition résultant d'effectuer LC-SRM analyse des mélanges des normes peptidiques externes (effectuer spectrométrie de masse comme décrit dans l'étape 3.1; Q1 et Q3 largeur d'isolement = 0,7 m / z; le temps de séjour = 2-50 msec).
5. Mamannuellement examiner les données LC-SRM résultant et de suppression des dosages peu performants (l'analyse de données de LC-SRM est décrit à la section 5).

4. LC-SRM dosages d'échantillons biologiques

1. Préparer les plats de cellules cultivées ^44. Si plusieurs conditions expérimentales sont comparées, bloc et randomisent les échantillons pour réduire les biais systématiques possibles ^45.
2. Pour chaque boîte de cellules, aspirer le milieu de culture cellulaire aux déchets et les cellules en suspension dans un tampon sans sérum ^44. Le cas échéant, laver les cellules dans un tampon sans sérum pour éliminer toute protéine restante extracellulaire.
3. Pour chaque échantillon, compter le nombre de cellules viables et le total en utilisant une tache de viabilité (par exemple, bleu trypan) et un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé ^44.
4. Pellet les cellules par centrifugation, et à aspirer les déchets surnageants ⁴⁴ (un volume typique de culot de cellules est d'environ 30 ul).
5. Ajouter 400 pi de l'urée tampon de lyse ou tensioactif tampon de lyse à chaque culot cellulaire (100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, 10 uM bestatine chlorhydrate, 10 pm pepstatine A, et soit 8 M urée ou 0,1% p / v tensioactif (respectivement ); fraîchement préparée; utiliser un tensioactif MS-compatible acidolabile comme RapiGest SF ou PPS silencieux tensioactif). Si l'on utilise d'autres inhibiteurs de protéase, en sorte qu'ils ne sont pas inhiber la trypsine.
6. Mélanger chaque échantillon en utilisant pipetage doux, et transférer chacun à un tube de 2 ml (avec un bouchon à vis avec un joint torique) contenant ~ 100 pi de 0,1 mm zircone / billes de silice (à noter que les perles peuvent causer des tubes à bouchon à fuir ). Lyse des cellules par vortex les échantillons pendant 5 min à pleine vitesse (ce lyse des cellules par perle coups).
   1. Alternativement, la lyse des cellules en utilisant une méthode mécanique différent (par exemple, en utilisant une presse ou d'homogénéisation des conseils français).
      Remarque: Evitez de centrifugation lysats cellulaires parce que cela pourrait sédimenter protéine précipitée qui pourrait otherwise tryptically être digéré et détectée par LC-MS.
7. Pour les échantillons dénaturés tensioactifs, les incuber à 90 ° C pendant 10 min pour faciliter l'homogénéisation de l'échantillon et la dénaturation des protéines.
8. Bain de traitement par ultrasons des échantillons pendant 10 min à la température ambiante pour aider l'homogénéisation et la dénaturation des protéines.
   Remarque: Le tampon de lyse et les lysats peuvent être conservés à -80 ° C (le tampon de lyse sera nécessaire pour les étapes 4.9 et 4.13).
9. Effectuer une analyse de la concentration de protéine ⁴⁶ (par exemple, un dosage de l'acide bicinchoninique) des lysats (et du tampon de lyse aussi une expérience témoin).
10. Pour les analyses qualitatives (c.-à-pas de normes peptidiques internes seront dopés dans les échantillons), pipette 200 ug (masse de protéines) de lysat cellulaire dans un tube de 1,5 ml frais de microcentrifugeuse. Pour les analyses quantitatives, préparer quatre de ces échantillons pour une série de dilution des isotopes stables.
11. Pour chaque échantillon, ajouter un étalon interne de la protéine (par exemple </ Em>, ajouter ~ 5 pmol de ~ 98% pur luciole luciférase).
12. Pour les analyses quantitatives, ajouter la série de dilution isotopique stable du mélange équimolaire des normes peptidiques internes (par exemple, 0, 0,2, 2, 20 pmol de chaque peptide) aux échantillons.
    1. En parallèle, préparer des échantillons témoins en utilisant les normes de peptide interne seul (pas de lysat de cellules) (par exemple, 0, 0,2, 2, 20 pmol de chaque peptide).
    2. Préparer également des échantillons témoins en utilisant les normes de peptides internes et externes (par exemple: 2 pmoles de chaque norme de peptide externe, et 0, 0,2, 2, et 20 pmol de chaque étalon interne peptidique).
       Remarque: Assurez-vous que les normes peptidiques sont libres d'acide formique car elle peut interférer avec la digestion de la trypsine.
13. Ajouter du tampon de lyse de telle sorte que tous les échantillons sont des volumes identiques. Remarque: Un volume d'échantillon typique est de 70 pi, donc ce volume sera utilisé pour ce protocole.
14. Réduire les résidus de cysteine ​​des protéines par addition de 0.7 pl de DTT 1 M (fraîchement préparé) à chaque échantillon (la concentration finale de DTT est de 10 mM) et l'incubation des échantillons à 60 ° C pendant 30 min.
15. Alkyler cystines de la protéine en ajoutant 7 ul de l'iodoacétamide tamponnée (500 mM d'iodoacétamide, 1 M de HEPES ∙ NaOH pH 8, fraîchement préparées) à chaque échantillon (la concentration de l'iodoacétamide finale est de 50 mM) et l'incubation des échantillons à la température ambiante pendant 20 min dans l'obscurité (iodoacétamide est sensible à la lumière). Si nécessaire, arrêter la iodoacétamide restant en ajoutant du DTT à une concentration finale de 50 mM.
16. Pour chacun des échantillons dénaturés en utilisant l'urée, ajouter 482 ul de 100 mM d'HEPES ∙ NaOH pH 8, de sorte que la concentration finale de l'urée est de 1 M (trypsine est inhibée de manière significative à> 1 M d'urée ^47).
17. Digérer Tryptically les protéines en peptides.
    1. Pour chaque échantillon qui contient un lysat de cellules, ajouter 8 pl de 0,5 pg / pl de qualité de séquençage trypsine modifiée de sorte que le concentrat de la trypsine finaleion est de 1:50 (protéine p: p) trypsine: échantillon, et incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 18 heures.
    2. Pour chaque échantillon ne contenant pas de lysat cellulaire, ajouter 0,5 ul de 0,5 ug / ul teneur modifiée de la trypsine de séquençage, et incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 2 heures (chacun de ces échantillons sont pour des expériences de contrôle, et généralement ne contiennent que 10 ng -10 pg de peptide + masse protéique).
18. Pour chacun des échantillons dénaturés urée, ajouter 440 ul de 2% v / v d'acide formique (concentration finale de l'acide formique est de 1% v / v). Confirment que ces échantillons sont pH ~ 3.
    1. Pour chacun des échantillons dénaturés tensioactifs, ajouter 914 ul de 0,5% v / v de TFA (la concentration finale est de 0,5% de TFA v / v). Confirment que ces échantillons sont pH ~ 1,5. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 60 min pour hydrolyser l'agent tensio-actif.
19. Microcentrifugeuse tous les échantillons à 21 000 xg pendant 20 min à la température ambiante pour obtenir un culot agent tensio-actif du groupe de queue et tout autre precipitates qui obstruer une cartouche C-18 SPE.
20. Phase solide extraire chacun des surnageants en utilisant un C-18 cartouche SPE jetable (tampon A = 0,1% v / v d'acide formique; tampon B = 0,1% v / v d'acide formique, 80% v / v ACN; ~ C- 100 mg 18 résine par cartouche). Forcer les phases mobiles grâce à la cartouche C-18 SPE en utilisant une poire en caoutchouc à surface plane, en utilisant un collecteur d'extraction, ou par centrifugation la cartouche dans un tube de 15 ml de centrifugeuse à 10 g pendant 5 min.
    1. Mouiller la colonne en appliquant 1 ml de tampon B, équilibrer en appliquant 1 ml de tampon A deux reprises, appliquer l'échantillon, et laver la cartouche en appliquant 1 ml de tampon A deux fois. Éluer les peptides en appliquant 1 ml de tampon B lentement (~ 2 min).
21. Concentré chaque éluat dans un concentrateur sous vide à un volume final de 100 ul à évaporer à une distance de ACN. Ajouter 200 ul de H ₂ O pour chaque échantillon, et on concentre chacune dans un concentrateur sous vide à un volume final de 98 ul à évaporer à une distance de tout re possiblerestant ACN.
22. Ajouter 2 ul de 5% v / v d'acide formique dans de l'ACN à chaque échantillon (les concentrations de l'échantillon final est de 0,1% v / v d'acide formique, de 2% v / v ACN).
    Remarque: Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C.
23. Analyser les échantillons en utilisant LC-MRS (comme dans l'étape 3.4). Pour les analyses qualitative LC-SRM, exécutez les échantillons biologiques et les normes peptidiques externes, et d'analyser toutes les données résultant ensemble. Pour les analyses quantitative LC-SRM, exécutez la série de dilution isotopique de chaque échantillon biologique, et aussi exécuter les échantillons constitués des seules normes peptidiques, et d'analyser toutes les données résultant ensemble.

5. Analyse LC-SRM données

NOTE: identification et la quantification de peptides peuvent être très simplifiées et partiellement automatisés à l'aide de logiciels tels que Skyline, mais il est toujours fortement recommandé que tous annotation des données soit revu manuellement. Aussi, il est préférable d'exclure les informations de niveau de protéines pendant Annot manuelation des données LC-SRM pour empêcher partialité.

1. Pour chaque identification de peptide, de confirmer que la forme de chaque profil transition d'élution est à peu près gaussienne. Pour chaque transition, confirment que le profil d'élution est le produit de plusieurs signaux mesurés par le détecteur de MS (c.-à-pas est le produit d'une ou deux des pointes aléatoires de bruit MS).
2. Pour chaque identification de peptide, veiller à ce que l'ensemble du profil d'élution peptide est sélectionné. Évitez ajuster le profil d'élution limites de sous-composantes de l'identification de peptides (sous forme de peptide lourde marqué, la forme non marquée, les ions précurseurs individuelles, et les transitions individuelles) manuellement.
3. Vérifiez que chaque profil d'élution transition a un rapport signal-sur-bruit (S / N) ≥3. Remarque: "bruit" fait référence au bruit de MS aléatoire, pour ne pas reproductibles signal du co-éluées analytes. Fonctions de lissage CHROMATOGRAMME peuvent grandement aider l'analyse de données bruitées.
4. Pour chaque identification d'un peptide,confirmer que toutes les transitions ont des profils d'élution presque identiques (pas seulement les fois apex pointe égales; profils d'élution peuvent avoir des amplitudes différentes).
5. Pour LC-SRM analyse d'une grande quantité des normes peptidiques (typiquement ≥100 de fmoles de chaque peptide), confirmer que les profils peptide d'élution correspondants sont très intenses (s généralement / n ≥100), et que les identifications peptidiques sont sans ambiguïté. Remarque: Ces identifications très confiants seront cruciales pour l'identification des peptides d'échantillons biologiques dérivés correspondants.
6. Pour chaque identification d'un peptide, confirment que les intensités relatives de transition correspondent à celles de l'étalon de peptide identifié en toute confiance. Si nécessaire, jetez profils bruyants, d'intensité relativement faible transition élution, mais confirmer qu'aucun des transitions relativement intenses sont manquants. Ne tenez pas compte des profils de transition élution relativement intenses qui sont considérablement et sans ambiguïté touchés par un coéluant contaminant.
7. Pour chaque identification de peptide, estimer la probabilité qu'il a été produit de façon aléatoire par un signal de fond (bruit de MS aléatoire signal plus reproductible d'analytes co-éluées).
   1. Estimer cette probabilité manuellement en examinant l'ensemble du chromatogramme LC-SRM et l'estimation de l'unicité de chaque identification de peptide. Produire une série d'identifications peptidiques confiant qui a un taux estimé de fausse découverte (FDR) de 5%. Utilisez des critères plus stricts (par exemple, FDR ≤1%) si une plus grande confiance définir des identifications est nécessaire (utilisation de critères plus souples est pas recommandé).
   2. Vous pouvez également utiliser l'algorithme mProphet ⁴⁸ ou l'algorithme de vérification ^49, mais examiner manuellement les résultats.
8. Pour chaque identification d'un peptide, confirment que le temps d'élution observé est cohérent avec l'hydrophobicité du peptide (Skyline est conçu pour effectuer ce calcul).
9. Pour chaque peptide, confirmer queson temps d'élution est cohérent à travers les pistes LC.
   NOTE: LC-SRM analyses parfois produire des profils d'élution qui sont systématiquement biaisée entre les courses. Changements systématiques sont à prévoir après les modifications d'instruments tels que le remplacement d'une colonne. En outre, les peptides à élution précoce peut être sujette à l'évolution (en particulier si la colonne est chargé à pleine capacité), et à la fin peptides élution peuvent également être sujettes à se déplacer. l'identification des peptides est maintenant terminée.
10. Pour améliorer peptide quantification, réinspecter chaque identification de peptides et jeter un profil d'élution transition si elle est particulièrement bruyant par rapport aux autres profils d'élution de transition à l'identification des peptides. Jeter un profil d'élution transition si son intensité relative de transition est faux (par rapport à la norme de peptide).
11. Inspecter les limites de chaque profil d'ion précurseur et la transition élution. Si nécessaire, ajuster soigneusement les limites de profil d'élution à rogner signal de fond (ou improve fond d'estimation de signal).
12. Pour chaque norme de peptide interne, vérifier si elle est contaminée par une quantité détectable de peptide lumière (déterminé par le LC-SRM analyse des normes peptidiques internes seul, décrit ci-dessus). Par la suite, jeter tous les profils d'élution peptide légers qui ont été considérablement compromises par la contamination lumière peptide dans les normes peptidiques internes.
13. Quantifier chaque profil d'élution de transition en calculant surface de son pic de LC. Le cas échéant, déduire le signal de fond estimé. Quantifier chaque profil d'élution des peptides en additionnant les valeurs de quantification transition correspondantes (ci-après, ceci est considéré comme la valeur "Sum_Peak_Area»). Pour chaque valeur de Sum_Peak_Area échantillon de peptide biologique, calculer l'abondance biologique molaire de peptide de l'échantillon en utilisant les données de LC-SRM de normes peptidiques internes ou externes (utilisation seulement les transitions qui ont été quantifiés avec succès à la fois par le peptide échantillon biologiqueLC-SRM et celle de la norme de peptide).
    1. Quantification en utilisant des normes peptidiques externes (non recommandé):
       1. Tracer les peptides externe valeurs Sum_Peak_Area standards par rapport aux peptides externe valeurs d'abondance molaires standard. Produire une courbe standard en ajustant une régression linéaire pour les données (généralement, seule la composante linéaire de la plage dynamique doit être utilisé; tout composant non linéaire doit être utilisé avec une extrême prudence). Pour chaque valeur de Sum_Peak_Area échantillon de peptide biologique, utiliser la courbe standard pour calculer l'abondance molaire de peptide.
          Note: Cette méthode de quantification est déconseillée car elle exige que la préparation de l'échantillon et LC-SRM être démontrabilité robuste parce que les échantillons biologiques et des normes peptidiques externes sont préparés et analysés par LC-SRM séparément. En outre, il ne tient pas compte des effets de matrice (effets dus à des composants d'un échantillon autres que l'analyte).
    2. Quantification utilisant internenormes peptidiques (recommandé):
       1. Pour chaque valeur de Sum_Peak_Area échantillon de peptide biologique et peptide interne valeur Sum_Peak_Area norme lourde marqué correspondant, calculer le rapport clair / lourd. Utilisez ce rapport comme une mesure de la lumière / peptide lourd rapport d'abondance molaire correspondant à calculer l'abondance molaire du peptide de l'échantillon biologique. Plus précisément, l'abondance biologique molaire de peptide de l'échantillon est égale à l'abondance molaire peptide standard interne multiplié par le rapport clair / de Sum_Peak_Area lourde.
       2. Pour chaque réplicat et peptide cible biologique, d'identifier la plage linéaire de la quantification LC-SRM en créant une courbe d'étalonnage en utilisant une régression linéaire. Plus précisément, tracer les peptides interne valeurs d'abondance molaire standards par rapport à la lumière des valeurs lourds / de Sum_Peak_Area ratio (à noter que la masse de l'échantillon biologique est constante à travers l'ensemble de données). Exiger que chaque échantillon valeur peptide Sum_Peak_Area biologique est dans la gamme linéaire (typicallié, seule la composante linéaire de la gamme dynamique doit être utilisé; tout composant non linéaire doit être utilisé avec une extrême prudence). De même, effectuer cette étape pour chaque transition de peptide cible.
          Remarque: Analyte quantification par LC-QQQ-SRM devrait être linéaire sur une large plage dynamique (~ 10 000). À l'extrémité inférieure, signal de fond (bruit de MS aléatoire signal plus reproductible d'analytes co-éluées) permettront de réduire la précision de quantification et de précision. À l'extrémité supérieure, la saturation du détecteur provoquera la non-linéarité (en fin de compte, cela peut entraîner des profils d'élution d'être au départ plat une intensité de signal spécifique).
14. Le cas échéant, procéder à une normalisation internationale pour les échantillons, par exemple une normalisation tendance centrale ^50, pour corriger les légères différences dans la quantité de l'échantillon avant l'ensemencement dans des normes de peptides internes. Si nécessaire, utilisez uniquement les protéines d'entretien ménager de l'étape 1.1.
15. Si nécessaire, imputer quantificat manquantValeurs ion ^51,52.
    Remarque: Il est inapproprié de simplement remplacer les valeurs manquantes par la moitié de la limite inférieure de quantification (LIQ) ou la moitié de la limite de détection (LOD) parce que cela permettrait de réduire artificiellement la quantification variance et pourrait entraîner un test statistique (par exemple, une analyse de la variance ) la production d'un résultat faussement positif (une erreur de type I). Cependant, en ignorant les valeurs manquantes peut également être problématique. Par exemple, si la moitié des vraies valeurs d'abondance sont en dessous de la limite de détection, et l'autre moitié sont au dessus de la LIQ, alors la moyenne observée abondance serait surestimer la véritable abondance signifie.
16. Veiller à ce que les essais satisfont aux lignes directrices largement acceptées pour LC-SRM ^23-25. En particulier, exigent que le coefficient de variation des valeurs de quantification est typiquement ≤25% pour des essais cliniques, et ≤35% pour les essais non cliniques ^25. Pour les analyses LC-MRS liées à la santé ou vétérinaires produits ou services qui doivent être pris en considération pour l'application réglementaireroval, exigent que les tests répondent aux exigences de précision plus strictes pour ces essais: "La précision déterminée à chaque niveau de concentration ne doit pas dépasser 15% du coefficient de variation (CV) à l'exception de la LIQ, où il ne devrait pas dépasser 20% de la CV ^"23,24.

Résultats

Le développement de modèles informatiques de prévision de voies de signalisation est l'un des objectifs fondamentaux de la biologie des systèmes ^53. Malheureusement, même pour les voies qui ont été largement étudiés et ont une haute signification clinique de signalisation, il est encore généralement pas possible de prédire quantitativement le comportement voie en réponse à des perturbations (par exemple, cela est vrai pour le / ERK MAPK ^54). Récemment, une enquête emplo...

Discussion

Absolute quantification de protéine est essentielle pour une gamme très diversifiée d'applications biomédicales telles que la validation de biomarqueurs et la transduction du signal de modélisation de la voie. Récemment, la protéomique ciblées utilisant LC-SRM a bénéficié des améliorations apportées à de nombreuses technologies, y compris peptide préparation standard, HPLC, QQQ-MS et LC-SRM analyse des données. Par conséquent, il est devenu une alternative puissante aux immunoessais. Immunoessais pe...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit	Fisher	23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm	BioSpec Products	11079101z
Bestatin hydrochloride	Sigma	B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)	Lonza	12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8	Gibco	15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11550
Cell culture L-glutamine	Sigma	G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco	10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v	Lonza	17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules	Fisher	A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep	Marienfeld-Superior	0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2	Mediatech	25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id	Polymicro Technologies	1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene	SUN SRI	200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone	SUN SRI	500-061
Luciferase, from Photinus pyralis	Sigma	L9506-1MG
Pepstatin A	EMD Millipore	516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)	EMD Chemicals	9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail	Roche	04906837001
RapiGest SF	Waters	186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge	Waters	WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position	Waters	WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb	Fisher	03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
SpeedVac vacuum concentrator	Fisher	SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Tube decapper for Micronic tubes	USA Scientific	1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile	Sarstedt	72.694.006
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS grade	Fisher	W6-1