Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Özet

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Özet

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of G_i2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.

Giriş

Kütle spektrometrisi (MS) kullanmak proteomik deneyler hedefli olmayan (av tüfeği) veya hedeflenen yöntemleri ya kullanmak için dizayn edilebilir. Keşif proteomik genellikle geleneksel veri bağımlı toplama modunu kullanarak, ya da (örneğin, MS ^E, SWATH) son zamanlarda geliştirilen veri bağımsız tekniklerden birini ^1,2 kullanarak, ya aşağıdan yukarıya av tüfeği MS dayanır. Shotgun proteomik yüksek verimli peptit tanımlama ve nispi ölçümü için güçlü bir araçtır, ama mutlak ölçümü için veya proteinlerin küçük tanımlanan setler (~ onlarca) hedefleme için genellikle uygun değildir. En sık hedeflenen proteomik için kullanılan MS yöntemi nedeniyle yüksek hassasiyet, hız ve dinamik aralık ^3-5 tepkisini izleme (SRM) seçilir. SRM alternatifleri yüksek çözünürlüklü, tam MS tarama ⁶ yararlanır paralel reaksiyon izleme içerir.

SRM genellikle nano-akış Rever kullanılarak gerçekleştirilirSED-fazlı yüksek-performanslı sıvı kromatografisi (nano RP-LC) nano-elektrosprey iyonizasyon bağlanmış cihaz üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi (qqq-MS) takılmış bir (daha nano-ESI) iyon kaynağı. Tipik bir deneyde, örnek proteinler proteolitik olarak sindirilir ve elde edilen peptitler, kromatografik ayrıldı, desorbe ve iyonize edilebilir. Elde edilen öncül iyonları m / ilk kuadruple (Q1) tarafından filtre z ve çarpışma gazı ile çarpışarak tarafından ikinci kuadropol (q2) parçalanmış bulunmaktadır. Elde edilen fragman, iyonlarıdır m / z-süzüldü üçüncü dört kutuplu (Q3) ve bir dynode ile nicelendirildi. Her bir ön-madde ve fragman iyon çifti bir geçiş olarak ifade edilir ve her bir geçiş belirli bir süre (kalma süresi tipik olarak 2-50 msn) izlenir. LC-SRM sırasında geçişler önceden tanımlanmış bir liste üzerinden qqq-MS döngüleri (görev döngüsü genellikle ≤3 sn olan) ve her bir geçiş kromatogram üretilir.

Alternatif strategProtein ölçümü için ler, tipik olarak bu nokta, blotlar, Western blotlar, ELISA antikor mikrodizileri, ters fazlı protein mikrodizilerinin, mikroakışkan bağışıklık dijital ELISA ve mikroküre bazlı bağışıklık ⁷ olarak immün kullanımı. En iyi immünodeneyler LC-ARM önemli ölçüde daha fazla duyarlı olabilir ve bağışıklık örnek hacmi LC-SRM ⁵ önemli ölçüde daha yüksek olabilir. Ancak, gelişmekte olan immünoanalizler pahalı olabilir ve / veya zaman alıcı ve elde edilen analizler hücrenin / doku lizis / homojenizasyon yöntemleri ile uyumsuz, çapraz reaksiyon ve / veya müdahale savunmasız olabilir ve / veya uygun olmayan ^5.8 multiplekslemesi için. Bu sorunlardan bazıları antikor ve MS tabanlı teknikler birleştirilmesi ele alınabilir. Örneğin, hedef proteinleri önce proteoliz ve LC-SRM ^9-12 immunoprecipitation kullanılarak zenginleştirilebilir. Seçenek olarak ise, SISCAPA tekniği peptid leve de proteolize sonra imüno kullanmaktadırl ^13,14. Buna ek olarak stratejiler immunoenrichment için, yüksek bolluk proteinlerin bağışıklık sistemine analitleri ^15,16 elüsyona alarak paraziti azaltarak LC-SRM duyarlılığını artırmak için istihdam edilebilir.

MS-bazlı protein ölçümü etiket özgür ve izotop etiketleme (örneğin, metabolik etiketleme, etiketleme kimyasal ve ağır etiketli protein ve peptid iç standartlar) içine de göreli ve mutlak ölçümü ayrılır ve yapılabilir. Etiket serbest teknikler göreli protein ölçümü için yararlı olabilir, ancak kesin mutlak ölçümü için uygun değildir olabilir. Karşılaştırma olarak, etiketleme teknikleri numune hazırlama ve MS varyans ile ilişkili hata azaltmıştır, ve çoğu zaman görece protein miktarının ¹⁷ kullanılmaktadır. Örneğin, izotop etiketli proteome (SILAP) standartları, insan serumu ¹⁸ LC-ARM üzerinden olası biyolojik belirteçler nispi miktarını etkin kültürlenmiş insan hücre hattı kullanılarak hazırlandı. MS ile Doğru mutlak protein ölçümü saflaştırılmış, sayısal, izotopik olarak etiketlenmiş protein ya da peptid iç standartlar çivili-içine olması MS öncesinde biyolojik örnekler gerektirir. LC-SRM iş akışına ağır izotop etiketli dahili standartların dahil son derece tekrarlanabilir ve laboratuarlar ^16,19 arasında transfer olduğu gösterilmiştir mutlak kantifikasyonunu sağlar.

MS ile saf protein ölçümü için izotop etiketli dahili standartlar peptid standartları, katı faz sentezi ^20, birleştirilmiş proteaz klivaj peptid standartları ²¹ oluşan proteinler, ve tam uzunluktaki protein standartlarını ²² kullanılarak hazırlandı bulunmaktadır. Hedef protein kovalent modifikasyon ve eksik numune hazırlama (yani eksik örnek parçalama ve homojenizasyon ve eksik protein solübilizasyon, denatürasyonu, alkilasyon ve proteoliz) doğru kantifikasyon sarsar. İç protein standartlar bu potansiyel sorunların en etkilenecek en az olasıdır, ancak genellikle hazırlamak için en zor bulunmaktadır. Alternatif bir amino- ve karboksi-terminal ana kuşatan kalıntılarını içerecek şekilde tasarlanan çok sayıda dahili peptid standartları kullanılarak her bir hedef protein analiz etmektir. Ne olursa olsun, iç standart türü kullanıldığında bunlar, bu katkılı halinde gereken biyolojik örnekler gibi erken bir noktada mümkün olduğu numune hazırlama sırasında. Ayrıca, birden çok örnek hazırlama teknikleri (örneğin, farklı bir denatürasyon koşulları) test edilmelidir. Birden dik deneysel teknikler (deneysel çapraz doğrulama) kullanımı ^23-25 ​​zorluklar çoğu potansiyel kantifikasyon üstesinden gelmek için uygun bir stratejidir.

Proteinlerin LC-SRM miktar geniş bir uygulama yelpazesinde kullanılabilir olan son derece esnek bir tekniktir. Özellikle, bu içindeki peptid ve protein biyolojik işaretleri incelemek için kullanılmıştırBöyle serum, çekirdek biyopsiler ve ince iğne aspiratları ⁵ klinik örnekler. LC-SRM ayrıca, botulinum nörotoksinlerinin ²⁷ tespit etmek için sinyal yolları ⁵ içinde protein fosforilasyon dinamikleri ölçmek için ve protein konformasyonuna ²⁸ değişiklikleri ölçmek için, protein kompleksleri ^5,26 stokiyometri ölçmek için kullanılmıştır.

Laboratuvarımız kemotaksis yolu simülasyonları gelişimini desteklemek için makrofaj kemotaksisini arabuluculuk sinyal proteinleri ölçmek için LC-SRM kullanıyor. protokol genel şeması (Şekil 1) kesin olmayan hedef peptidleri sıralaması ile başlar. Daha sonra, ham dış peptid standartları sentezlendi ve biyolojik numunelerin nitel analiz için LC-SRM tahlilleri geliştirmek için kullanılır. Biyolojik numune türetilen hedef peptid tespit edilirse, saflaştırılmış ağır etiketli dahili peptid standartları niceliksel LC-ARM hazırlanır. Bu protokol, ac için kullanılabilircurately biyolojik örneklerin çeşitli proteinleri ölçmek ve protein hedeflerinin çok çeşitli araştırmalar desteklemek.

Protokol

NOT: Bu yöntem, daha önce ⁵⁶ tarif edilmiştir.

1. Peptid hedef seçimi

1. Hedef proteinlerin bir listesini derlemek ve biyolojik örnekler arasında normalleştirme için konum idaresi proteinlerinin az sayıda içerir ve aynı zamanda bir iç protein standardı (örneğin ateşböceği lusiferaz) içerir. Böyle Protein Sindirim Simülatörü ^29,30 gibi bir yazılım aracı kullanarak silico triptik peptidler içine hedef proteinleri sindirmek.
2. Peptidler tam triptik ve hiçbir eksik tripsin bölünme siteleri içerdiğini gerektir. Potansiyel eksik tripsin sindirimi ³¹ önlemek için komşu tripsin bölünme siteleri ile peptidler kaçının.
3. Her bir peptidin uzunluğu 5-20 kalıntıları olduğunu gerektirir. Daha uzun peptidler düşünün, ama genellikle sentezlenmesi için daha pahalı olduğunu not edin.
4. Doğal bir genetik varyant (örneğin, tek nükleotid karşılık eğer bir peptit kaçınıne polimorfizmi). Ayrıca tripsin siteleri (1.2 Adım) etkilenmemiş olduğunu onaylayın.
5. Bu Posttranslasyonel değişiklik (PTM) bir siteye karşılık eğer bir peptit kaçının. LC-MS numune hazırlama sırasında kimyasal modifikasyona yatkın olacaktır Benzer şekilde, bir peptit kaçının. Spesifik olarak, sistein ve metionin oksidasyon, asparagin ve glutamin deamidasyon ve piroglutamat amino-terminal glutamin oluşumuna eğilimli peptidler kaçının. Tripsin siteleri (1.2 Adım) etkilenmemiş olduğunu onaylayın.
   1. Ayrıca, protein, termini translasyon sonrası modifikasyonu (amino-terminal metionin kaybı ve asetilasyon ve karboksi-terminal amidasyon) eğilimli olduğu için, protein, amino-ve karboksi-termini kaynaklanan peptidler kaçının.
6. Her hedef peptit, her hedef proteine ​​özgü gerektirir. Eğer bu mümkün değilse, peptid izoformları / homologların bir dizi özgüdür gerektirir. Sadece lösin / izolösin ikamesi farklı peptidler davranınsanki bu LC-ARM sırasında neredeyse aynı performans nedeniyle peptid teklik belirlerken onlar aynıydı.
   1. Biyolojik numunelerin her kapsamlı transkriptomik analizi (örneğin, RNA-DİZ) gerçekleştirilmiş olması halinde, transkriptin siliko çevirileri kullanılan benzersiz peptid belirleme ³² yerine türlerin tüm Proteomun kullanılarak sekansları.
7. Hedef peptidler Proteotypic gerektirir. Biyolojik örneklerin av tüfeği kütle spektrometresi ^1,2 kullanarak Proteotypic peptidler tespit çalışılmaktadır. Alternatif olarak, NIST kütle spektrometresi gibi online proteomik veri tabanlarından Proteotypic peptidlerin peptid tanımlamaları kütüphanelerinde almak ³³ (http://peptide.nist.gov/), Küresel Proteome Makinası ³⁴ (X http HUNTER spektral kütüphaneleri: // www http://gpmdb.thegpm.org/ gelen .thegpm.org / HUNTER / index.html ve GPMDB peptid tanımlamaları), PeptideAtlas ³⁵ yukarı (http://www.peptideatlas.org/) ve GURUR veritabanı ³⁶ (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
8. Kantitatif transkript düzeyinde yapılmıştır biyolojik örneklerin analizleri (örneğin, RNA-seq, qPCR), daha sonra nispeten düşük bolluk transkript karşılık peptitler hedefleyen kaçının.
9. Hedef protein ortologlar LC-SRM deneyleri için kullanılabilir seçin hedef peptidleri gerekirse (örneğin, insan ve hedef proteinin fare biçimlerinin tahlil).
10. (Mümkünse) hedef proteinin en az iki hedef peptidleri seçin.

Peptid Standartları 2. Hazırlık

Not: Protokolün bu kısmı alt analizler için yirmi liyofilili peptid standartları (miktar Her biri 1 nmol), bir dizi hazırlanmasını tarif etmektedir. Peptidlerin başka bir sayısı için, ya da farklı peptit miktarları için, buna göre ayarlanması gerekecektir.

1. Böyle SPOT sentezi ^20,37 gibi bir peptit sentezi teknolojisi kullanılarak liyofilize peptid standartları (≥1 nmol) hazırlayın.
   1. Carbamidomethylated harici peptid standartları sistein kalıntılarını (iyodoasetamid alkilasyon oluşturduğu kimyasal yapısı) sağlanması. Bunun aksine, dahili peptid standartları sistein kalıntıları modifiye edilmemiş sağlamak (bunlar, aşağıda tarif edilen numune hazırlama sırasında alkile olacaktır).
   2. Onlar amino ve karboksi-terminal yerli artıklarını yan içermesi, böylece iç peptid standartları Tasarım (tripsin sindirim verimliliği kontrol etmek için, her biri tipik 3-6 kalıntıları uzun).
   3. Onlar kararlı izotop etiketli böylece iç peptid standartları tasarlayın. Bir peptid etiketleme stratejisi seçerken hedef peptidin doğal izotopik profil ve MS kütle ölçüm doğruluğunu düşünün. Döteryumlu peptid standartları kullanmayın peptid dötertumlanma nedenleri ters fazlı LC tutma süresi nedeniyles ³⁸ kaydırmak için.
      Not: Genellikle, triptik dahili peptid standartları olarak saf ~% 98 kullanılarak sentezlendi: ^[13 C ₆ ¹⁵ K _4] Arg ve ^[13 C _6, ¹⁵ _N2] karboksi-termini de dahil Lys.
   4. HPLC ³⁹ kullanılarak iç peptid standartları arındırmak ve bunları doğru bir şekilde ölçmek ^40.
2. H / h formik asit, liyofilize peptidin bir 10 uM peptit konsantrasyonu (kullanımı dikkat üretmek için her 1 nmol liyofilili peptid standart% 20 hac / hac asetonitril (ACN), çok düşük bir yoğunluğa sahip olabilir,% 0.1, 100 ul ekle ve) kolayca kaybolabilir. 2 dakika ve banyo için numuneler 5 dakika boyunca onları sonikasyon Girdap peptid çözünme tamamlanmasını sağlamak üzere.
3. Çözülmüş peptidler havuz, 80 ul son hacim olması için bir vakum deriştirme aygıtı içinde, elde edilen karışımın konsantre edilir. Herhangi bir çökelmiş peptidi eritmek için ACN 20 ul ekle.
   Not: örnek şimdi contains her peptit ve% 20 hac / hac ACN 10 uM.
4. İç peptid standartlar için, kantitatif LC-ARM için seyreltme dizi hazırlamak:
   1. 1 uM seyreltme 100 ul hazırlanması:% 20 h / h ACN 90 ul 10 uM peptid karışımı 10 ul birleştirir.
   2. 100 nM seyreltme 100 ul hazırlanması:% 20 h / h ACN 90 ul, 1 uM peptid karışımı 10 ul birleştirir.
5. Dış peptid standartları için,% 0.1 v / v formik asit 90 ul 10 uM peptid karışımı 10 ul birleştirerek LC-MS için 1 uM seyreltme 100 ul hazırlar.
   Not: Örnek 1 şimdi, her peptidin uM, hacim / hacim formik asit,% 0.1 ve% 2 v / v ACN içeren, ve LC-SRM tahlil geliştirme için kullanılmak üzere hazır hale gelir.

3. LC-SRM tahlil geliştirme

1. Bir nano-akış HPL kullanarak MS tüfek ile dış peptid standartları (enjeksiyon başına her peptit kabaca 1-10 pmol) karışımları analizÜçlü dört kutuplu kütle spektrometresi (LC-qqq-MS (/ MS)) bağlanmış Cı sistemi.
   1. Cı-18 ortamı (≤5 um çapı, ~ 200 gözenekler, uzunluk ≥10 cm id = 50-100 um) ile dolu bir kılcal sütunu ile donatılmış bir LC-MS sistemi ve nano-ESI ucu (tipik olarak kullanılarak üretilen kullanın Bir lazer çektirmesi). Her bir LC-MS tarafından işletilen bir ~ 60 dakika doğrusal eğimi (tipik haliyle,% 0-40 Çözücü B) bir sütun rejenerasyon aşamasını (~% 80 Çözücü B) ve sütun yeniden dengeleme adım (~% 0 Çözücü B içeren emin olun ) (Çözücü A =% 0.1 hac / hac H formik asit _2, O, B Solventi =% 0.1 hac / hac ACN içinde formik asit, akış hızı = 200-800 Nl / min, ESI voltajı = 1800 V, Q3 yalıtım genişliği = 0,7 m / z, q2 argon basıncı = 1.5 mTorr).
   2. Her habercisi iyon tarama için, dinamik üst seçin ~ tandem kütle spektrometresi (MS / MS) 10 en yoğun habercisi iyonları. Optimal +2 habercisi iyonları parçalara için tasarlanmış bir ve diğer: İki farklı çarpışma enerjisi rampaları kullanıldığı böylece kopya halinde her bir numune çalıştırın3 için ön-madde ⁴¹ iyonları.
   3. LC-qqq-MS (/ MS) (q2 düşük enerji argon çarpışmaları sonucu habercisi iyon zirveleri kuyruklanmasını neden olabilir Q1 habercisi iyon tarama) Q3 habercisi iyon tarama kullanarak analizleri gerçekleştirin.
   4. LC-MS sistemi QC örnekleri ve teknik çoğaltır analiz ederek yeterli performans emin olun. Taze yapılmış LC sütunlar kullanılarak ve örnekler arasındaki çoklu boşlukları çalıştırarak örnek taşınmasını önlemek.
2. Dış peptid standartlarının ⁴² dizileri karşı arama veritabanı kullanarak ortaya çıkan tüfek LC-qqq-MS (/ MS) verileri analiz edin. Eğer uygunsa, peptid kimlik güven puanları (örneğin, beklenti değerleri) veya istatistiksel modelleme ⁴² kullanılarak kullanarak muğlak peptid tanımlamaları atın. Ne olursa olsun, el hepsi açık olduğundan emin olmak için peptid kimlikleri ⁴³ tüm gözden geçirin.
3. Con av tüfeği, MS peptid tanımlamaları kullanınBöyle Skyline gibi bir yazılım programını kullanarak bir spektrum kütüphanesi struct.
   1. Öncül iyonu (başına 3-10 en yoğun geçişleri kullanarak LC-SRM geçiş listesini hazırlayın +2 ve +3 öncüsü iyonları +1 ve +2 fragmanı iyonları; y-, b- ve ≥2 kalıntıları olduğu bir-iyonları Uzun).
   2. Habercisi ve fragmanı iyon m / z değerleri qqq-MS kitle ölçüm hassasiyeti içinde çakışıyorsa habercisi iyon parçalanma tamamlanmamış bazen (bir geçiş atın, monoizotopik ve ağır doğal izotop formları yanı sıra etiketlenmemiş dikkate hatırlamak ve ) formları ağır etiketli.
   3. Parça iyon m / z aynı ön-madde iyonu farklı bir fragman iyonun örtüşür Benzer şekilde, bir geçiş atın.
4. LC-SRM dış peptid standartları karışımların analizleri gerçekleştirmek için ortaya çıkan geçiş listelerini kullanın (Adım 3.1 anlatıldığı gibi kütle spektrometresi gerçekleştirmek, Q1 ve Q3 izolasyon width = 0,7 m / z; bekleme süresi = 2-50 msn).
5. Annenually herhangi kötü performans analizleri (LC-SRM verilerin analizini Bölüm 5'te açıklanmıştır) elde edilen LC-SRM verileri gözden ve silin.

Biyolojik örnekler 4. LC-SRM Tahliller

1. Kültürlü hücrelerin ⁴⁴ yemekleri hazırlayın. Birden fazla deney koşulları, blok karşılaştırılmış ve olası sistematik önyargıları ⁴⁵ azaltmak için numune rastgele yapılıyorsa.
2. Hücrelerin her yemeğin için, serumsuz bir tampon ⁴⁴ hücreleri atık ve askıya hücre kültür ortamı aspire. Gerekirse, herhangi bir kalan hücre dışı proteinin ayrılması için bir serumsuz tampon hücreleri yıkayın.
3. Her numune için, bir canlılığı leke (örneğin, tripan mavi) ve bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı ⁴⁴ kullanarak uygulanabilir ve toplam hücre sayısını.
4. Santrifüj hücreleri Pelet ve ⁴⁴ atık süpernatantlar aspire (tipik hücre pelet hacmi 30 ul ~ is).
5. (sırasıyla her bir hücre peleti (100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, hidroklorür bestatin, 10 uM, 10 uM pepstatin A, ve ya da 8 M üre veya% 0.1 ağ / hac yüzey aktif madde üre Liziz Tamponu veya yüzey aktif madde Lizis Tamponu 400 ul ekle ), taze hazırlanmış, bu tür RapiGest SF ya da PPS Sessiz yüzey aktif madde olarak, bir asit-labil MS uyumlu yüzey aktif madde kullanırlar). Diğer proteaz inhibitörleri kullanılarak, bunlar tripsin önleme yok olduğundan emin olun.
6. Boncuklar sızıntı için ek kap tüpleri neden olduğuna dikkat (~ 0.1 mM zirkonya / silika boncuk 100 ul yumuşak pipetleme ile her bir örnek karıştırın ve (bir O-halkası ile bir vida kapak ile) 2 ml tüp, her bir aktarma ). Lyse tam hızda 5 dakika boyunca numune vorteks hücreler (bu boncuk dayaktan hücreleri lyses).
   1. Alternatif olarak, (bir Fransız basını ya da homojenleştirme ipuçlarını kullanarak, örneğin) bir farklı mekanik yöntemi kullanarak hücrelerin lize.
      Not: Hücre lizatları santrifüj önlemek ot ki, bu çökelmiş proteinin pelet çünküherwise tryptically sindirilir ve LC-MS ile tespit edilebilir.
7. Yüzey aktif cismi örnekleri için denatüre edilmiş, örnek homojenleştirme ve protein denatürasyonunu yardımcı olmak için, 10 dakika boyunca 90 ° C'de inkübe.
8. Banyo homojenizasyon ve protein denatürasyonunu yardımcı olmak için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır örnekleri.
   Not: lizatları ve lizis tamponu -80 ° C'de muhafaza edilebilir (lizis tamponu adımları 4.9 ve 4.13 için gerekli olacaktır).
9. Lisatlann protein konsantrasyonu, tahlil ⁴⁶ (örneğin, bisinkoninik asit deneyi) uygulayın (ve bir kontrol deneyi olarak liziz tamponu).
10. Taze bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine kalitatif analizler (yani, hiçbir iç peptid standartları çivili-içine edilecek numuneler) hücre lizatının, pipet 200 ug (protein kütlesi) için. Nicel analizler için, bir izotop seyreltme serisi için dört tür numunelerin hazırlanması.
11. Her numune için, bir iç protein standardı (örneğin, / Em>)% 98 saf ateşböceği lusiferaz ~ ve ~ 5 pmol ekleyin.
12. Nicel analizler için, iç peptid standartları eşmolar karışımının izotop seyreltme serisi ekleyin (örneğin, 0, 0,2, 2, her peptit 20 pmol) örnekleri.
    1. Buna paralel olarak, tek başına dahili peptid standartları kullanılarak kontrol numuneleri hazırlanması (örneğin, bir hücre lizatı) (örneğin, 0, 0.2, 2, her bir peptidin 20 pmol).
    2. Ayrıca iç ve dış peptid standartları kullanılarak kontrol numuneleri hazırlanması (örneğin: 2 her bir harici peptit standart pmol ve 0, 0.2, 2, ve her bir dahili peptid standardı 20 pmol).
       Not: tripsin sindirim engel olabilecek peptid standartları formik asit içermeyen emin olun.
13. Numunelerin hepsinin aynı miktarlar, böylece lizis tamponu ekleyin. Not: Tipik bir örnek hacmi 70 ul, bu nedenle bu hacmi bu protokol için kullanılacaktır.
14. 0 ekleyerek protein sistein artıklarını azaltın.Her numune (son DTT konsantrasyon 10 mM) ve 30 dakika boyunca 60 ° C'de örneklerin inkübe edilmesi için (yeni hazırlanmış) 1 M DTT 7 ul.
15. Alkilat proteini tamponlu iyodoasetamit 7 ul ekleyerek cystines (500 mM iyodoasetamit, 1 M HEPES NaOH pH 8 ∙, taze hazırlanmış) her bir örneğe (nihai konsantrasyon 50 mM iyodoasetamid) ve karanlıkta 20 dakika boyunca oda sıcaklığında örneklerin inkübe (iyodoasetamid duyarlı ışık). Gerekirse, 50 mM nihai konsantrasyona kadar DTT eklenerek geri kalan iodoasetamid gidermek.
16. Numunelerin her üre kullanılarak denatüre için, (tripsin anlamlı> 1 M üre ⁴⁷ de engellenir) nihai üre konsantrasyonu 1 M böylece 100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8 482 ul ekleyin.
17. Tryptically peptidler içine proteinleri sindirmek.
    1. Hücre lizatı içerir Her bir örnek için, 0.5 mg / ml dizileme gradlı modifiye tripsin 8 ul olacak şekilde ilave nihai tripsin concentrattripsin: Örnek, ve 18 saat 37 ° C'de inkübe örnek: İyon 1:50 (a Protein h) arasındadır.
    2. Hücre lizatı içermeyen her bir numune, 0.5 ug / ul dizileme gradlı modifiye tripsin 0.5 uL ekleyin ve 2 saat (bu numunelerin her kontrol deneyleri için, ve tipik olarak sadece 10 ng içeren 37 ° C 'de örnek inkübe için peptid + protein kütlesinin -10 ug).
18. Üre denatüre örneklerin her biri için,% 2 v / v formik asit 440 ul (nihai formik asit konsantrasyonu,% 1 v / v). Bu örnekler, pH ~ 3 olduğunu doğrulayın.
    1. Yüzey aktif cismi, denatüre örneklerin her biri,% 0.5 v 914 ul için / TFA hac (nihai TFA konsantrasyonu% 0.5 v / v). Bu örnekler pH ~ 1.5 olduğunu onaylayın. 60 dakika yüzey aktif madde hidrolize etmek için 37 ° C 'de, bu örneklerin inkübe edin.
19. Mikrosantrifüj örneklerinin her yüzey aktif madde uç grubu ve diğer Yağışlı pelet, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 21,000 x g'debir C-18 SPE kartuşu yapışmasına neden olur ipitates.
20. Katı faz, bir tek C-18 SPE kartuşu kullanılarak süpernatanların her özü (Tampon A =% 0.1 hacim / hacim formik asit; Tampon B =% 0.1 h / h formik asit,% 80 h / h ACN; ~ 100 mg C- kartuş başına 18 reçine). Ya da 5 dakika için 10 x g'da 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne kartuşu santrifüjle bir ekstraksiyon manifoldu kullanılarak, düz yüzeyli kauçuk ampulü kullanılarak C-18 SPE kartuşu içinden mobil fazlar zorla.
    1. Tampon B içinde 1 ml uygulayarak sütun Islak, iki kere tampon A ile 1 ml uygulayarak bunu dengeye örnek uygulanır ve iki kez tampon A ile 1 ml uygulayarak kartuşu yıkayın. Yavaş yavaş Tampon B 1 ml uygulamak (~ 2 dk) ile peptidler Zehir.
21. ACN şekilde buharlaştırılır, 100 ul'lik nihai bir hacme kadar vakum yoğunlaştırıcısı her eluat konsantre edilir. Her bir örnek için, _H2O 200 ul ekleyin ve olası yeniden uzaklıkta buharlaştırılması için 98 ul'lik nihai bir hacme kadar vakum yoğunlaştırıcısı her konsantreisti ACN ilave et.
22. Her bir örnek için ACN içinde 2 uL% 5 h / h formik asit ilave edin (nihai numune konsantrasyonları,% 0.1 v / v formik asit,% 2 h / h ACN) vardır.
    Not: Örnekler, -80 ° C'de saklanabilir.
23. (Adım 3.4 gibi) LC-SRM kullanarak örnekleri analiz edin. Nitel LC-SRM analizleri için, biyolojik örnekler ve dış peptid standartları çalıştırmak ve birlikte ortaya çıkan tüm verileri analiz eder. Kantitatif LC-SRM analizleri için, her biyolojik numunenin izotop seyreltme serisi çalıştırın ve aynı zamanda tek başına peptid standartları oluşan örnekleri çalıştırmak ve birlikte ortaya çıkan tüm verileri analiz eder.

5. LC-SRM Veri Analizi

NOT: Peptit tanımlama ve miktar oldukça basit ve kısmen böyle Skyline gibi yazılımları kullanarak otomatikleştirilmiş, ama yine de güçlü tüm veriler açıklama elle gözden geçirilmesi tavsiye edilmektedir edilebilir. Ayrıca, manuel Annot sırasında protein seviyesi bilgilerini dışlamak için en iyisiLC-SRM verilerinin tirme yanlılığı önlemek için.

1. Her bir peptid tanımlaması için, her bir geçiş yapılan ayırma profilinin şekli yaklaşık Gauss olduğunu teyit etmektedir. Her bir geçiş için, elüsyon profili MS detektör tarafından ölçülen sinyallerin çok ürünü olduğunu teyit (yani, MS gürültü, bir ya da iki rasgele sivri ürünü değildir).
2. Her peptid tanımlanması için tüm peptit elüsyon profili seçili olduğundan emin olun. Peptid tanımlanması (ağır etiketli peptid formunda, etiketsiz formu, bireysel habercisi iyonları ve bireysel geçişler) ve alt bileşenlerinin elüsyon profili sınırlarını ayarlama manuel kaçının.
3. Her geçiş elüsyon profili, bir sinyal-gürültü oranı (s / n) ≥3 olduğunu doğrulayın. Not: "Gürültü" elüsyona analitlerden sinyal tekrarlanabilir değil, rastgele MS gürültü anlamına gelir. Kromatogram yumuşatma fonksiyonları büyük ölçüde gürültülü verilerin analizini yardımcı olabilir.
4. Her bir peptid tanımlaması için,geçişler tüm neredeyse özdeş yıkama profillerine sahip olduğunu teyit (sadece eşit zirve tepe kez, elüsyon profilleri farklı amplitüdlere olabilir).
5. LC-SRM peptid standartları (herbir peptidden tipik haliyle ≥100 fmol) büyük bir miktar analizleri için, karşılık gelen peptit elüsyon profilleri peptid tanımları net olduğunu ve (tipik olarak ≥100 N / S) yoğun olduğu teyit etmektedir. Not: Bu son derece güvenen tanımlamalar gelen biyolojik numune türetilen peptidler belirlenmesi için kritik olacak.
6. Her peptid tanımlanması için, göreceli geçiş yoğunlukları güvenle tanımlanan peptid standardının eşleşen onaylayın. Gerekirse, gürültülü, nispeten düşük yoğunluklu geçiş elüsyon profilleri atmak, ama nispeten yoğun geçişlerin olduğu hiçbiri eksik onaylayın. Anlamlı ve açıkça bir eş etkilenen nispeten yoğun geçiş elüsyon profilleri göz ardıkirleticinin, elüsyon.
7. Her peptid tanımlaması için, (elüsyona analitlere rasgele MS gürültü artı tekrarlanabilir sinyali) arka plan sinyali tarafından rastgele üretilen olasılığını tahmin ediyoruz.
   1. Tüm LC-SRM kromatogram inceleyerek ve her peptid kimlik benzersizliğini tahminine göre elle olasılığının tahmini. % 5 tahmini yanlış keşif oranı (FDR) sahiptir emin peptid teşhislerin bir dizi üretin. Sıkı kriterleri özdeşleşmeler set daha yüksek bir güven gerekiyorsa (gevşek kriterlerin kullanılması tavsiye edilmez) (örn FDR ≤1%) kullanın.
   2. Alternatif olarak, mProphet algoritması ⁴⁸ veya denetim algoritması ⁴⁹ kullanabilirsiniz, ancak elle sonuçları gözden geçirin.
8. Her peptid tanımlanması için, gözlenen elüsyon zamanı (Skyline Bu hesaplamayı gerçekleştirmek için tasarlanmıştır) peptid hidrofobluğu tutarlı olduğunu teyit etmektedir.
9. Her bir peptid için, onaylamakonun elüsyon zamanı LC çalışır tutarlı olduğunu.
   NOT: LC-SRM bazen sistematik çalışmalar arasında çarpık olan elüsyon profilleri üretmek analizleri. Sistematik vardiya böyle bir sütun değiştirilmesi gibi enstrüman değişikliklerden sonra beklenmez. Ayrıca erken elüsyon peptidler (kolon kapasitesine yakın yerleştirildiğinden özellikle) kayması eğilimli olabilir, ve geç elüsyon peptidler Aynı zamanda, vites eğilimli olabilir. Peptid tanımlama tamamlanmıştır.
10. Peptid miktarının iyileştirmek için, her peptid kimlik reinspect ve peptid kimlik diğer geçiş elüsyon profilleri karşılaştırıldığında özellikle gürültülü ise geçiş elüsyon profili atın. Göreli geçiş yoğunluğu (peptid standardına göre) yanlış ise bir geçiş elüsyon profili atın.
11. Her habercisi iyon ve geçiş elüsyon profili sınırlarını kontrol edin. Gerekirse, dikkatlice arka plan sinyalini uzak kırpmak için elüsyon profili sınırlarını ayarlayın (ya da improve Arka sinyal tahmini).
12. Işık peptidin saptanabilir bir miktarı ile kirlenmiş olan, her bir iç peptid standardı için, (LC-SRM ile belirlenen, yukarıda tarif edilen, tek başına dahili peptid standartları analizleri) kontrol edin. Daha sonra, önemli ölçüde iç peptid standartları içinde ışık-peptid kirlenme tehlikeye edildi herhangi bir ışık peptid elüsyon profilleri atın.
13. Onun LC pik alanı hesaplanarak, her geçiş elüsyon profili niceliğini. Eğer uygunsa, tahmin edilen plan sinyalini düşeriz. Karşılık gelen geçiş miktar değerler toplanarak her bir peptit elüsyon profilini niceliğini (bundan sonra bu "Sum_Peak_Area" değeri olarak ifade edilir). Iç veya dış peptid standartları her biyolojik numune peptid Sum_Peak_Area değeri, verileri kullanılarak biyolojik numune peptid molar bolluk hesaplamak LC-SRM (kullanım başarıyla hem biyolojik numune peptid tarafından ölçüldü sadece geçişlerLC-SRM ve peptid standardı o).
    1. Dış peptid standartları (önerilmez) kullanarak Niceleme:
       1. Dış peptid standart molar bolluk değerleri karşı dış peptid standart Sum_Peak_Area değerlerini çizilir. Verilere lineer regresyon uydurma bir standart eğri üretin (genellikle dinamik aralığının sadece doğrusal bileşeni kullanılması gerektiğini, herhangi bir doğrusal olmayan bileşen çok dikkatli kullanılmalıdır). Her biyolojik numune peptid Sum_Peak_Area değeri, peptit molar bolluk hesaplamak için standart eğri kullanın.
          Not: biyolojik örnekler ve dış peptid standartları ayrı LC-SRM ile hazırlanır ve analiz edilir, çünkü örnek hazırlama ve LC-SRM demonstrability sağlam olması gerekir, çünkü bu miktar yöntem önerilmez. Ayrıca, matris etkilerinden (analit dışındaki bir örnek bileşenlerine bağlı etkiler) için hesap değil.
    2. İç kullanarak Nicelemepeptid standartları (önerilir):
       1. Her biyolojik numune peptid Sum_Peak_Area değeri ve karşılık gelen ağır etiketli dahili peptid standart Sum_Peak_Area değeri, hafif / ağır oranı hesaplanır. Biyolojik numune peptidin mol miktarım hesaplamak için karşılık gelen hafif / ağır peptit mol bolluğu oranının bir ölçüsü olarak, bu oranı kullanın. Özellikle, biyolojik numune peptid molar bereket hafif / ağır Sum_Peak_Area oranı ile çarpılması iç peptid standart molar bolluk eşittir.
       2. Her biyolojik tekrarlanan ve hedef peptid için, lineer regresyon kullanılarak bir standart eğri oluşturarak LC-SRM ölçümü doğrusal aralığı belirlemek. Özellikle, ağır / hafif Sum_Peak_Area oranı değerleri karşı iç peptid standart molar bolluk değerlerini çizmek (biyolojik numune kütlesi veri kümesi boyunca sabit olduğunu unutmayın). Her bir biyolojik numune peptid Sum_Peak_Area değeri lineer aralıkta olduğunu (Typic gerektirirmüttefiki, dinamik aralığının sadece doğrusal bileşeni kullanılmalıdır; Herhangi bir doğrusal olmayan bileşen) çok dikkatli kullanılmalıdır. Aynı şekilde, her bir hedef peptid geçiş için bu adımı gerçekleştirin.
          Not: LC-qqq-ARM tarafından analit miktar geniş bir dinamik aralık (~ 10.000) üzerinde doğrusal olmalıdır. Düşük sonunda, arka plan sinyali (rastgele MS gürültü artı elüsyona analitlerden tekrarlanabilir sinyali) ölçümü doğruluğu ve kesinliği azaltacaktır. Yüksek sonunda, dedektör doygunluğu (sonuçta bu yıkama profilleri, belirli bir sinyal yoğunluğu yassı bir başlangıç ​​olmasına neden olabilir) lineer olmayan neden olacaktır.
14. Eğer uygunsa, önce iç peptid standartları spiking-in örnek miktarı hafif farklılıkları düzeltmek için, böyle bir merkezi eğilim normalleşme ⁵⁰ örneklerin genelinde global bir normalleşme gerçekleştirin. Gerekirse, Adım 1.1 yalnızca temizlik proteinleri kullanın.
15. Gerekirse, quantificat eksik imputeion ^51,52 değer verir.
    O bunu yaparken yapay miktar varyansı azaltacaktır çünkü basitçe miktarının (LLOQ) ya da algılama (LOD) yarım sınırının yarısı alt sınırı ile eksik değerleri değiştirmek için uygunsuz olduğu, ve (bir istatistik testi örneğin, bir ANOVA neden olabilir: Not ) yanlış pozitif sonuç üreten (bir tür hata). Ancak, eksik değerleri göz ardı da sorunlu olabilir. Yarım gerçek bolluk değerleri LOD altında, diğer yarısı LLOQ üstünde iseniz Örneğin, sonra ortalama gerçek bolluk demek abartma olur bolluk gözlendi.
16. Tahliller LC-SRM ^23-25 ​​için geniş kabul gören kuralları tatmin olduğundan emin olun. Özellikle, miktar değerleri varyasyon katsayısı tipik olarak klinik deneyler için ≤25 ve% klinik olmayan tahliller için ²⁵ ≤35% olduğu gerektirir. Düzenleyici uygulaması için dikkate alınması gereken sağlık hizmetleri veya veterinerlik ürünleri veya hizmetleri ile ilgili LC-SRM tahlilleri içinroval, tahliller gibi deneyleri için sıkı hassas gereksinimlerini karşılamak gerektirir: "Her konsantrasyon seviyesinde belirlenir hassas bunun% 20'sini aşmamalıdır LLOQ hariç varyasyon katsayısı (CV)% 15 geçmemelidir CV ^"23,24.

Sonuçlar

sinyal iletim yollarının tahmini hesaplama modellerinin geliştirilmesi sistem biyolojisi ⁵³ temel hedeflerinden biridir. Ne yazık ki, hatta yoğun çalışılan ve yüksek klinik öneme sahip olan sinyal yolları için, bu nicel tedirginlikler cevaben yolu davranışlarını tahmin etmek için genellikle hala mümkün değildir (örn bu MAPK / ERK yolu ⁵⁴ için geçerlidir). Son zamanlarda, bir soruşturma yolunun ⁵⁶ sinyal fare makrofaj kemotaksisini çalışmak için hedef...

Tartışmalar

Mutlak Protein ölçümü bu biyobelirteç doğrulama ve sinyal iletim yolu modelleme gibi biyomedikal uygulamalarda bir çok farklı aralık için gereklidir. Son zamanlarda, LC-SRM kullanılarak hedeflenen proteomik peptid standart hazırlama, HPLC, qqq-MS ve LC-SRM veri analizi de dahil olmak üzere çok sayıda teknolojilere iyileştirmeler yararlanmıştır. Sonuç olarak, bağışıklık karşı güçlü bir alternatif haline gelmiştir. Immünoanalizler ve / veya uygun değildir multiplekslemesi için, son derece...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit	Fisher	23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm	BioSpec Products	11079101z
Bestatin hydrochloride	Sigma	B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)	Lonza	12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8	Gibco	15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11550
Cell culture L-glutamine	Sigma	G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco	10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v	Lonza	17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules	Fisher	A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep	Marienfeld-Superior	0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2	Mediatech	25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id	Polymicro Technologies	1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene	SUN SRI	200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone	SUN SRI	500-061
Luciferase, from Photinus pyralis	Sigma	L9506-1MG
Pepstatin A	EMD Millipore	516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)	EMD Chemicals	9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail	Roche	04906837001
RapiGest SF	Waters	186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge	Waters	WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position	Waters	WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb	Fisher	03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
SpeedVac vacuum concentrator	Fisher	SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Tube decapper for Micronic tubes	USA Scientific	1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile	Sarstedt	72.694.006
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS grade	Fisher	W6-1