絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

要約

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

要約

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of G_i2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.

概要

質量分析（MS）を使用してプロテオーム実験は、非標的（ショットガン）または標的化方法のいずれかを使用するように設計することができます。ディスカバリープロテオミクスは、一般的に、従来のデータ依存取得モードを使用することによって、または（ 例えば 、MS ^E、SWATH）最近開発されたデータに依存しない技術の一つ^1,2を用いてのいずれかで、ボトムアップショットガンMSに依存しています。ショットガンプロテオミクスは、ハイスループットペプチド同定および相対定量のための強力なツールですが、それは絶対的な定量化のための、またはタンパク質の小、定義されたセット（〜数十）を標的とするため、一般的に不適切です。最も頻繁に使用される標的プロテオミクスMS法は、その高い感度、速度、およびダイナミックレンジ^3-5の反応モニタリング（SRM）が選択されます。 SRMの代替は、高解像度、フルMSスキャン⁶を活用し、並列反応モニタリングを含みます。

SRMは、通常は、ナノフローreverを使用して実行されますトリプル四重極質量分析計（QQQ-MS）に取り付けられたナノエレクトロスプレーイオン化（ナノESI）イオン源に結合されたsedの相高速液体クロマトグラフィー（ナノRP-LC）装置。典型的な実験では、サンプルのタンパク質をタンパク質分解的に消化され、得られたペプチドは、クロマトグラフィー分離脱着およびイオン化されます。得られた前駆体イオンは、衝突ガスでそれらを衝突させて第二の四重極（Q2）の最初の四重極（Q1）によってフィルタリングされ、断片化されたm / zです。得られたフラグメントイオンであるのm / z濾過第四重極（Q3）及びダイノードによって定量しました。各前駆体およびフラグメントイオン対は、遷移と呼ばれ、各遷移が指定された期間（滞留時間、通常は2~50ミリ秒）のために監視されます。 LC-SRM中、QQQ-MSサイクル遷移の事前定義されたリストを（デューティサイクルは、典型的に≤3秒）であり、各遷移のクロマトグラムが生成されます。

代替strategタンパク質定量のためのIEは、典型的には、ドットブロット、ウェスタンブロット、ELISA法、抗体マイクロアレイ、逆相タンパク質マイクロアレイ、マイクロ流体イムノアッセイ、デジタルELISA法、およびマイクロスフェアベースのイムノアッセイ⁷などのイムノアッセイを使用しています。最高のイムノアッセイは、LC-SRMよりも著しく敏感であることができ、イムノアッセイのサンプルスループットLC-SRM ⁵のそれよりも有意に高くすることができます。しかし、開発イムノアッセイは高価なことができ、および/ ​​または時間がかかり、結果として得られるアッセイは、細胞/組織溶解/均質化法との互換性がない、交差反応性および/ ​​または干渉を受けやすいことができ、および/ ​​または適していない^5,8を多重します。これらの問題のいくつかは、抗体とMSベースの技術を結合することによって対処することができます。例えば、標的タンパク質は、タンパク質分解の前及びLC-SRM ^9-12に免疫沈降を使用して濃縮することができます。あるいは、SISCAPA技術は、ペプチドLEVEでタンパク質分解に続いて免疫沈降を採用しますL ^13,14。 immunoenrichment戦略に加えて、高存在量タンパク質の免疫除去は、分析物^15,16を共溶出することにより干渉を低減することにより、LC-SRMの感度を高めるために使用することができます。

MSベースのタンパク質定量は、相対および絶対定量に分割し、また、ラベルフリーと安定同位体標識（ 例えば 、代謝標識、化学標識、および重標識されたタンパク質およびペプチド内部標準）にすることができます。ラベルフリー技術は、相対的なタンパク質定量のために有用であるが、正確な絶対定量には適していないことができます。比較すると、標識技術は、試料調製及びMSの分散に関連する誤差を低減しており、多くの場合、相対的タンパク質定量¹⁷のために使用されます。例えば、安定同位体標識されたプロテオーム（SILAP）規格は、ヒト血清¹⁸のLC-SRMを介して、潜在的なバイオマーカーの相対的定量化を可能にし、培養ヒト細胞株を用いて調製し。 MSによる正確な絶対的なタンパク質定量は、精製、定量化し、同位体で標識されたタンパク質またはペプチド内部標準をスパイク-にすることは、MSの前に生物学的サンプルが必要です。 LC-SRMワークフローへの重い同位体で標識された内部標準の組み込みは、高い再現性と実験室^16,19の間で譲渡することが示されている絶対的定量を可能にします。

MSによる絶対的なタンパク質定量のための安定同位体標識された内部標準ペプチドの基準は、固相合成^20、連結されたプロテアーゼ切断可能なペプチド標準^21、および全長タンパク質標準²²からなるタンパク質を用いて調製が含まれます。標的タンパク質の共有結合修飾と不完全な試料調製（ すなわち 、不完全なサンプル溶解および均質化し、不完全なタンパク質の可溶化、変性、アルキル化、およびタンパク質分解）が正確な定量を弱体化させることができます。内部Protein基準は、これらの潜在的な問題の多くによって影響される可能性が最も低いですが、彼らは通常、準備するのが最も困難です。代替的には、アミノ末端およびカルボキシ末端の天然のフランキング残基を含むように設計された複数の内部ペプチド標準を使用して、各標的タンパク質を分析することです。かかわらず、内部標準のタイプが使用されるのは、スパイク、にすべきである生物学的サンプルとして早期にできるだけ試料調製中。また、複数のサンプル調製技術（ 例えば 、異なる変性条件）をテストする必要があります。複数の直交実験技術（実験クロスバリデーション）の使用量は^{、23〜25に}挑戦する最も可能性の定量化を克服するための実行可能な戦略です。

タンパク質のLC-SRMの定量化は、多種多様な用途で使用されてきた非常に柔軟な技術です。特に、それは内のペプチド及びタンパク質バイオマーカーを研究するために使用されています例えば、血清、コア生検、および微細針吸引物⁵として臨床サンプル。 LC-SRMはまた、ボツリヌス神経毒^27を検出するためにシグナル伝達経路⁵内タンパク質のリン酸化の動態を定量化するために、およびタンパク質構造²⁸の変化を定量化するために、タンパク質複合体^5,26の化学量論を測定するために使用されてきました。

私たちの研究室では、走化性経路シミュレーションの開発を支援するマクロファージ走化性を媒介するシグナル伝達タンパク質を定量化するために、LC-SRMを使用しています。プロトコル（ 図1）の全体的なスキームは、仮の目標ペプチドをランク付けすることから始まります。次いで、粗製の外部ペプチド標準を合成し、生物学的サンプルの定性分析のためにLC-SRMアッセイを開発するために使用されます。生体試料由来の標的ペプチドを検出した場合、精製された重標識ペプチド内部標準は、定量的LC-SRMのために調製されます。このプロトコルは、交流を使用することができcurately生物学的サンプルの様々なからのタンパク質を定量し、タンパク質標的の多様な研究を支援します。

プロトコル

注：このメソッドは、以前に^56を説明してきました。

1.ペプチドターゲットの選択

1. 標的タンパク質のリストをコンパイルし、生物学的サンプル全体の標準化のためのハウスキーピングタンパク質の数が少ないが含まれ、また、内部タンパク質標準（ 例えば 、ホタルルシフェラーゼ）が挙げられます。このようなタンパク質消化シミュレータ^29,30などのソフトウェアツールを使用してインシリコトリプシンペプチドに標的タンパク質を消化し ​​ます。
2. ペプチドは完全にトリプシンで、ノーミストリプシン切断部位が含まれていないことが必要です。潜在的に不完全なトリプシン消化^31を回避するために、隣接するトリプシン切断部位を有するペプチドを避けます。
3. 各ペプチドの長さは5〜20残基であることが必要です。より長いペプチドを考えてみましょうが、彼らは一般的に合成することが、より高価であることに注意してください。
4. それが天然の遺伝的変異体（ 例えば 、シングルnucleotidに対応する場合、ペプチドを避けますE多型）。また、トリプシンサイトは（ステップ1.2）に影響を受けないことを確認します。
5. それは翻訳後修飾（PTM）のサイトに対応する場合、ペプチドを避けます。それは、LC-MSサンプル調製中に化学的修飾を受けやすいであろう場合には同様に、ペプチドを避けます。具体的には、システインおよびメチオニン酸化、アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化、及びピログルタミン酸のアミノ末端グルタミンを形成する傾向ペプチドを避けます。トリプシンサイトは（ステップ1.2）に影響を受けないことを確認します。
   1. さらに、タンパク質の末端が翻訳後修飾（アミノ末端メチオニンの損失とアセチル化、およびカルボキシ末端アミド化）する傾向があるため、タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端に由来するペプチドを避けます。
6. 各標的ペプチドは、各標的タンパク質に固有であることを要求します。これが不可能な場合、ペプチドはアイソフォーム/ホモログのセットに固有のものであることが必要です。唯一のロイシン/イソロイシン置換によって異なるペプチドを治療これらは、LC-SRM中にほぼ同一に行うため、ペプチドの一意性を決定するとき、それらは同一であったかのように。
   1. 生物学的サンプルのすべてを包括的トランスクリプトーム解析（ 例えば 、RNA-seqのを）実行された場合は、代わりの種のプロテオーム全体を使用しての転写産物配列³²のシリコ翻訳を用いてペプチドの一意性を決定します。
7. 標的ペプチドは、プロテオれている必要があります。生物学的サンプルのショットガン型質量分析法^を使用して^1,2-プロテオタイピックペプチドを同定することは検討されて。 ！HTTPから別の方法として^{、（http://peptide.nist.gov/）33}などのNIST質量分析ライブラリなどのオンラインプロテオミクスデータベースからプロテオタイピックペプチドのペプチド同定を取得し、グローバルプロテオームマシン^34（X HUNTERスペクトルライブラリ：// WWW .thegpm.org / HUNTER / index.htmlを、とhttp://gpmdb.thegpm.org/からGPMDBのペプチド同定）、PeptideAtlas ³⁵ （http://www.peptideatlas.org/）アップし、PRIDEデータベース^{36（http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/）。}
8. 定量的な転写産物レベルが実行された生物学的サンプルの分析をした場合（ 例えば 、RNA-seqの、定量PCR）は、比較的少量の転写産物に対応するペプチドを標的とすることは避けてください。
9. 標的タンパク質オルソログのLC-SRM分析のために使用することができ、選択標的ペプチドを必要に応じて（ 例えば 、ヒトおよび標的タンパク質のマウスの形態の両方をアッセイするために）。
10. 標的タンパク質（可能であれば）当たり少なくとも2つの標的ペプチドを選択します。

ペプチド標準の調製

注：プロトコルのこのセクションでは、下流の分析のための20の凍結乾燥ペプチド標準のセット（数量でそれぞれが1ナノモル）の調製を記載します。ペプチドの異なる数のために、または異なるペプチドの量のために、それに応じて調整する必要があります。

1. このようなSPOT合成^20,37として、ペプチド合成技術を用いて凍結乾燥したペプチド標準（≥1ナノモル）を準備します。
   1. カルバミドメチル化されている外部のペプチド標準のシステイン残基（ヨードアセトアミドアルキル化によって形成された化学構造を）確認してください。対照的に、内部標準ペプチドのシステイン残基が修飾されていない保証する（これらは、以下に記載の試料調製中にアルキル化されます）。
   2. これらはアミノ末端およびカルボキシ末端のネイティブ残基に隣接するを含むように内部ペプチド標準を設計し（トリプシン消化効率を制御するために、それぞれが典型的には三から六残基長です）。
   3. 彼らは安定同位体標識されているように、内部ペプチド標準を設計します。ペプチド標識化戦略を選択する際に標的ペプチドの天然の同位体プロファイルとMSの質量測定精度を考慮してください。ペプチド重水素化の原因の逆相LC保持時間ため、重水素化ペプチド標準を使用しないでください^38をシフトすることです。
      注意：一般的に、トリプシン内部ペプチド標準は〜98％の純粋な^[13 C _^6、15 N _4] Argおよびカルボキシ末端に取り込まれた^[13 C _^6、15 N _2]のLysを用いて合成されます。
   4. HPLC ^39を使用して内部ペプチド標準を精製し、かつ正確にそれらに^40を定量化します。
2. 10μMのペプチド濃度を生成するために各1 nmolの凍結乾燥したペプチド標準に0.1％v / vのギ酸、20％（v / v）のアセトニトリル（ACN）の100μlを添加する（凍結乾燥したペプチドとしては十分に注意してください非常に低密度を有することができますと）簡単に失われることがあります。ボルテックスは2分、バスのためのサンプルは、ペプチドの溶解が完了したことを確実にするために5分間超音波処理して。
3. 溶解ペプチドをプールし、80μlの最終体積に真空濃縮器で得られた混合物を濃縮します。任意の沈殿したペプチドを溶解するためにACNの20μlを添加します。
   注：サンプルを今共同ntains各ペプチドと20％（v / v）のACNの10μM。
4. 内部ペプチド標準については、定量的LC-SRMのための希釈系列を準備します。
   1. 1μMの希釈液100μlを準備し、20％（v / v）のACNの90μLと10μMのペプチド混合物の10μlのを兼ね備えています。
   2. 100 nmの希釈液100μlを準備し、20％（v / v）のACNの90μLと1μMのペプチド混合物の10μlのを兼ね備えています。
5. 外部ペプチド標準については、0.1％v / vのギ酸および10μMのペプチド混合物の10μlを90μlのを組み合わせることにより、LC-MS用の1μMの希釈液100μlを準備します。
   注：サンプルは今1の各ペプチドμM、v / vのギ酸0.1％、および2％（v / v）のACNを含有し、LC-SRMアッセイ開発のために使用する準備ができています。

3. LC-SRMアッセイ開発

1. ナノフローHPLを使用してMSをショットガンして、外部ペプチド標準（注射当たり各ペプチドの約1〜10ピコモル）の混合物を分析三連四重極質量分析計（LC-QQQ-MS（/ MS））に結合されたCシステム。
   1. C-18メディア​​（≤5μmの直径、〜200オングストロームの細孔、長≥10センチ、ID = 50〜100ミクロン）（一般的に使用して製造およびナノESIチップを充填したキャピラリカラムを備えたLC-MSシステムを使用して、レーザープラー）。各LC-MSラン〜60分間の直線勾配（典型的には、0〜40％溶媒B）、カラム再生工程（〜80％溶媒B）であり、カラムの再平衡化工程（〜0％溶媒Bが含まれていることを確認）（溶媒A = 0.1％v / vのギ酸、H ₂ O、溶媒B = 0.1％v / vのACN中のギ酸を、流速= 200〜800 NL /分、ESI電圧= 1,800 V、Q3の分離幅= 0.7メートル/ Z、Q2のアルゴン圧力= 1.5トル）。
   2. 各前駆体イオンス​​キャンでは、動的にトップを選択〜タンデム質量分析（MS / MS）のための10の最も強い前駆体イオン。二つの異なる衝突エネルギーランプが使用されるように二重に各サンプルを実行します。最適な2前駆体イオンをフラグメント化するように設計された一つであり、他の3のための前駆体は^、41をイオン。
   3. LC-QQQ-MS（/ MS）が（Q2に低エネルギーのアルゴンの衝突から得られた前駆体イオンピークのテーリングを引き起こす可能性がQ1プリカーサーイオンスキャン）Q3前駆体イオンス​​キャンを用いて解析を実行。
   4. LC-MSシステムは、QCサンプルおよび技術的反復を分析することによって適切に行っていることを確認します。新たに作製したLCカラムを使用することにより、サンプル間の複数のブランクを実行することにより、サンプルのキャリーオーバーを防止します。
2. 外部ペプチド標準⁴²の配列に対して検索するデータベースを使用して得られたショットガンLC-QQQ-MS（/ MS）のデータを分析します。適切な場合には、ペプチドの識別信頼度（ 例えば 、期待値）または統計的モデル^42を使用してを使用して、あいまいなペプチド同定を捨てます。関係なく、手動でそれらはすべてあいまいでないことを確認するために、ペプチド同定⁴³のすべてを確認します。
3. コンするショットガンMSペプチドの同定を使用してください例えば、スカイラインなどのソフトウェアプログラムを使用して、スペクトルライブラリをストラクト。
   1. ≥2残基であるY、B-、およびイオン; +1と+2フラグメントイオン;前駆イオンあたり3-10最も強い遷移（+2と+3前駆体イオンを用いたLC-SRM遷移リストを作成長いです）。
   2. 前駆体およびフラグメントイオンのm / z値はQQQ-MSの質量測定精度内で重複する場合、前駆イオンの断片化が不完全なことがある（遷移を破棄し、モノアイソトピックと重い天然同位体の形態、ならびに非標識を考慮することを忘れないでくださいと重標識された形）。
   3. フラグメントイオンのm / zが同じ前駆イオンとは異なるフラグメントイオンのそれと重なる場合は同様に、移行を破棄します。
4. LC-SRMは外部ペプチド標準の混合物の分析を実行するために、得られた遷移リストを使用する（ステップ3.1で説明したように質量分析を行い、Q1とQ3の分離幅= 0.7のm / z;滞留時間= 2-50ミリ秒）。
5. マnually得られたLC-SRMデータを確認し、任意のパフォーマンスの低いアッセイ（LC-SRMデータの分析はセクション5で説明されている）を削除します。

生物学的サンプルの4 LC-SRMアッセイ

1. 培養細胞⁴⁴の料理を準備します。複数の実験条件は比較されている場合は、ブロックと任意の可能な体系的バイアス^45を減少させるために、サンプルをランダム化。
2. 細胞の各ディッシュについて、血清を含まないバッファ⁴⁴内のセルを無駄にし、中断し、細胞培養培地を吸引します。必要であれば、残りの細胞外タンパク質を除去するために、無血清緩衝液で細胞を洗浄します。
3. 各サンプルについて、生存染色（ 例えば 、トリパンブルー）および血球計または自動細胞計数器^44を用いて、生存および全細胞数をカウントします。
4. （典型的な細胞ペレットの体積は〜30μLである）を遠心分離により細胞をペレット化し^、44を無駄にし、上清を吸引除去します。
5. は、それぞれ（各細胞ペレット（100mMのHEPES∙NaOHをpHが8、塩酸ベスタチン、10μM、ペプスタチンA、10μM、およびいずれかの8 M尿素または0.1重量/容量％の界面活性剤に尿素溶解バッファーや界面活性剤の溶解緩衝液400μLを追加します）;新たに調製した;）などRapiGest SFやPPSサイレント界面活性剤として、酸に不安定なMS適合性界面活性剤を使用しています。他のプロテアーゼ阻害剤を使用している場合、彼らはトリプシンを阻害しないことを確認してください。
6. ビーズが漏れスナップキャップチューブを引き起こす可能性があることに注意してください（〜を含む0.1ミリメートルのジルコニア/シリカビーズを100μlを穏やかにピペッティングを使用して、各サンプルを混合し、（Oリング付きのスクリューキャップ付き）2 mlチューブにそれぞれの転送）。溶解フルスピードで5分間サンプルをボルテックスすることによって細胞（これはビーズビーティングによって細胞を溶解）。
   1. あるいは、異なる機械的な方法（ 例えば 、フレンチプレスまたは均質化のヒントを使用して）を使用して細胞を溶解。
      注意：これはotの可能性が沈殿したタンパク質をペレット化する可能性があるため、細胞溶解物を遠心分離しないでくださいherwiseトリプシン消化し、LC-MSにより検出すること。
7. 界面活性剤の変性サンプルについては、サンプルの均質化及びタンパク質変性を支援するために10分間90℃でそれらをインキュベートします。
8. バスは、均質化及びタンパク質変性を支援するために、室温で10分間、サンプルを超音波処理します。
   注：溶解物および溶解緩衝液（溶解緩衝液は、ステップ4.9と4.13のために必要とされる）-80℃で保存することができます。
9. （対照実験として、溶解バッファーの）溶解物のタンパク質濃度アッセイ^46（ 例えば 、ビシンコニン酸アッセイ）を実行します。
10. 定性分析のために（ すなわち 、内部ペプチド標準がスパイクない-にされるサンプル）、ピペットの細胞溶解物200μgの（タンパク質質量）新しい1.5 mlマイクロチューブに。定量分析のために、安定同位体希釈系列のための4つのそのようなサンプルを準備します。
11. 各サンプルについて、 例えば、（内部タンパク質標準を追加</ em>の、〜98％の純粋なホタルルシフェラーゼの〜5ピコモルを追加します）。
12. 定量分析のために、試料に内部ペプチド標準（ 例えば 、0、0.2、2、各ペプチドの20ピコモル）の等モル混合物の安定同位体希釈系列を追加します。
    1. 並行して、単独の内部ペプチド標準を使用して対照試料を調製し（ すなわち 、細胞溶解物）（ 例えば 、0、0.2、2、それぞれのペプチドの20ピコモル）。
    2. また、外部および内部ペプチド標準用いた対照試料調製（例えば：2各外部ペプチド標準のピコモル、0、0.2、2、及び各内部ペプチド標準の20ピコモル）を。
       注：それはトリプシン消化を妨げる可能性ペプチド標準は、ギ酸を含まないことを確認してください。
13. サンプルの全てが同一のボリュームになるように溶解バッファーを追加します。注意：代表的なサンプル量が70μLであるため、このボリュームは、このプロトコルのために使用されます。
14. 0を追加することによって、タンパク質のシステイン残基を減らします。7各試料に1 M DTT（新たに調製）（DTT、最終濃度が10 mMで）のμL、30分間60℃でサンプルをインキュベートします。
15. （最終ヨードアセトアミドの濃度は50 mMで）を各サンプルにし、暗闇の中で20分間、室温でサンプルをインキュベートする工程;（新たに調製し、ヨードアセトアミドの1M HEPES∙のNaOH pHが8を500 mM）のバッファリングヨードアセトアミドの7μLを添加することによりアルキル化タンパク質のシスチン（ヨードアセトアミドは、光に敏感です）。必要に応じて、50mMの最終濃度までDTTを添加することによって、残りのヨードアセトアミドを急冷。
16. サンプルの各々は、尿素を用いて変性するために、（トリプシンを大幅> 1 M尿素⁴⁷で阻害される）、最終尿素濃度を1Mになるように、100mMのHEPES∙のNaOHをpHが8の482μlを添加します。
17. トリプシンペプチドにタンパク質を消化します。
    1. 最終トリプシンconcentratように、細胞溶解物を含む各サンプルについて、0.5μgの/μlの配列決定グレードの8μlを添加するトリプシンを変更しましたトリプシン：サンプル、および18時間、37℃でサンプルをインキュベート：イオンは、1：50（Wタンパク質w）です。
    2. 細胞溶解物を含まない各サンプルについて、0.5μgの/ 0.5μLを追加μlの配列決定グレードトリプシンを変更して、2時間、37℃でサンプルをインキュベート（これらのサンプルの各々は対照実験のためのものであり、一般的には10 ngのが含まれていますペプチド+タンパク質質量の-10μgの）。
18. 尿素変性したサンプルのそれぞれについて、2％v / vのギ酸の440μLを加える（最終ギ酸濃度は、1％v / vです）。これらのサンプルは、pH約3であることを確認します。
    1. 界面活性剤の変性試料の各々を、0.5％vの914μlを添加するために/ TFA V（最終TFA濃度を0.5体積％である/ v）です。これらのサンプルは、pH約1.5であることを確認します。界面活性剤を加水分解するために60分間37℃でこれらのサンプルをインキュベートします。
19. マイクロ遠心界面活性剤の末端基と他のPRECをペレット化し、室温で20分間、21,000×gでのサンプルのすべてC-18 SPEカートリッジを詰まらせるであろうipitates。
20. 固相が使い捨てC-18 SPEカートリッジを用いて上清の各々を抽出（緩衝液A = 0.1％v / vのギ酸;緩衝液B = 0.1％v / vのギ酸、80％v / vのACN;〜100mgのC-カートリッジ当たり18樹脂）。抽出マニホールドを使用して、フラットな表面のゴム球を使用して、C-18 SPEカートリッジを介して、または5分間、10×gで15mlの遠心チューブにカートリッジを遠心分離することにより、移動相を強制します。
    1. 緩衝液Bを1mlを適用することにより、カラムを湿式倍緩衝液Aを1mlを適用することによって、それを平衡化、サンプルを適用し、そして二回緩衝液Aを1mlを適用することにより、カートリッジを洗浄します。ゆっくりバッファーBを1ml（約2分）を適用することによって、ペプチドを溶出します。
21. ACNを離れて蒸発させるために100μlの最終体積に真空濃縮器の各溶出液を濃縮します。各サンプルに、H ₂ O200μlのを追加し、すべての可能な再揮散する98μlの最終体積に真空濃縮器の各を集中maining ACN。
22. 各サンプルをACNで2μLの5％v / vのギ酸を加え（最終サンプル濃度は0.1％v / vのギ酸、2％（v / v）のACNです）。
    注：サンプルは-80℃で保存することができます。
23. （ステップ3.4のように）LC-SRMを使用してサンプルを分析します。定性的なLC-SRM分析のために、生物学的サンプルおよび外部ペプチド標準を実行して、一緒に得られたすべてのデータを分析します。定量的LC-SRM分析のために、各生体試料の同位体希釈シリーズを実行して、単独ペプチド標準からなるサンプルを実行して、一緒に得られたすべてのデータを分析します。

5. LC-SRMデータ分析

注：ペプチド同定および定量は非常に単純化し、部分的にこのようなスカイラインのようなソフトウェアを使用して自動化されたが、それはまだ強く、すべてのデータアノテーションを手動で見直されることをお勧めしますすることができます。また、手動ANNOT中のタンパク質レベルの情報を除外するのが最善ですLC-SRMデータのationがバイアスを防止します。

1. 各ペプチドの同定のために、各遷移溶出プロファイルの形状がほぼガウス分布であることを確認します。各遷移のために、溶出プロフィールは、（ すなわち 、MSノイズの一つまたは二つのランダムなスパイクの製品ではない）、MS検出器によって測定された複数の信号の積であることを確認します。
2. 各ペプチドの同定のために、ペプチド全体の溶出プロファイルが選択されていることを確認。ペプチド同定（重標識ペプチドの形、非標識形態、個々の前駆体イオン、および個々の遷移）のサブコンポーネントの溶出プロファイルの境界を調整する手動ですることは避けてください。
3. 各遷移の溶出プロファイルは、信号対雑音比（S / N）を持つことを確認し≥3。注：「ノイズ」は、分析物を共溶出からランダムMSノイズにではなく、再生可能な信号を指します。クロマトグラムの平滑化関数が大きく、ノイズの多いデータの分析を支援することができます。
4. 各ペプチドの同定のために、遷移の全てがほぼ同一の溶出プロファイル（;溶出プロフィールは、異なる振幅を有することができるだけでなく、同​​じピーク頂点回）を持っていることを確認します。
5. LC-SRMは、ペプチド標準（各ペプチドの典型的≥100フェムトモル）の大量の分析については、対応するペプチドの溶出プロフィールは、ペプチド同定が明らかな、とこと（典型的には≥100N / S）非常に強いであることを確認。注：これらの非常に自信を持って識別は、対応する生物学的サンプル由来のペプチドの同定のために重要となります。
6. 各ペプチドの同定のために、相対的な遷移強度は自信を持って同定されたペプチド標準のものと一致していることを確認。必要に応じて、ノイズの多い、比較的低強度の遷移溶出プロフィールを捨てるが、比較的強い遷移のどれが欠けていないことを確認してください。有意かつ明確に共同の影響を受けている比較的強い遷移溶出プロファイルを無視し汚染物質を溶出します。
7. 各ペプチドの同定のためには、（共溶出の検体からランダムMSノイズ+再現性の信号）背景信号によってランダムに生成された確率を推定します。
   1. 全体LC-SRMクロマトグラムを調べ、それぞれのペプチド同定の一意性を推定することにより、手動でこの確率を推定します。 5％の推定偽発見率（FDR）を持つ自信を持ってペプチド同定のセットを生成します。識別のより高い信頼セットが必要な場合（緩い基準の使用が推奨されていません）より厳格な基準（ 例えば 、FDR≤1％）を使用します。
   2. あるいは、mProphetアルゴリズム⁴⁸または監査アルゴリズム^49を使用しますが、手動で結果を確認します。
8. 各ペプチドの同定のために、観測された溶出時間（スカイライン、この計算を実行するように設計されている）は、ペプチドの疎水性と一致することを確認します。
9. 各ペプチドについて、次の点を確認してその溶出時間は、LCの実行全体で一貫しています。
   注：LC-SRMは時々体系的実行の間スキューさ溶出プロファイルを生成し分析します。系統的なシフトは、カラムの交換など機器の変更後に予想されます。また、早期に溶出するペプチドは、（列が容量の近くにロードされている場合は特に）シフトする傾向があることができ、後期溶出ペプチドはまた、シフトする傾向があることができます。ペプチド同定が完了しました。
10. ペプチドの定量化を改善するために、それぞれのペプチド同定を再検査し、ペプチド同定の他の遷移の溶出プロファイルと比較して、特に雑音がある場合の遷移溶出プロファイルを捨てます。その相対遷移強度は（ペプチド標準と比較して）間違っている場合に遷移溶出プロファイルを破棄します。
11. 各前駆体イオンと遷移溶出プロファイルの境界を検査します。必要に応じて、慎重に（またはIにバックグラウンド信号を離れてトリミングする溶出プロファイルの境界を調整しますmprove背景信号推定）。
12. 各内部ペプチド標準については、それは光のペプチドの検出可能な量で汚染されているかどうかを確認（LC-SRMによって決定さは、上述しただけで、内部ペプチド標準の分析します）。その後、大幅に内部ペプチド標準内の光 - ペプチド汚染によって損なわれていた光のペプチド溶出プロファイルを破棄します。
13. そのLCピーク面積を計算することにより、各遷移の溶出プロファイルを定量化します。適切な場合には、推定された背景信号を差し引きます。対応する遷移の定量値を合計することによって各ペプチドの溶出プロファイルを定量化する（以下、これを「Sum_Peak_Area」値と呼ばれます）。各生体試料ペプチドSum_Peak_Area値は、内部または外部のペプチド標準のLC-SRMからのデータを用いて、生物学的試料のペプチドモル存在量を計算する（正常な生物学的試料のペプチドの両方によって定量化しただけの遷移を使用しLC-SRMおよびペプチド標準のこと）。
    1. 外部ペプチド標準を使用して定量化する（推奨されません）：
       1. 外部ペプチド標準モル存在量値に対する外部ペプチド標準Sum_Peak_Area値をプロットします。 （;任意の非線形成分は、細心の注意を払って使用する必要があり、典型的には、ダイナミックレンジの唯一の線形成分を使用する必要がある）のデータに線形回帰をフィッティングすることにより、標準曲線を生成します。各生体試料ペプチドSum_Peak_Area値については、ペプチドモル存在量を計算するために、標準曲線を使用しています。
          注：それは、生物学的サンプルと外部ペプチド標準を別々LC-SRMによって調製し、分析しているため、試料調製及びLC-SRMが論証可能性堅牢であることが必要ですので、この定量方法はお勧めしません。また、マトリックス効果（分析物以外のサンプルの成分に起因する効果）を考慮していません。
    2. 内部を使用して定量化ペプチド標準（推奨）：
       1. 各生体試料ペプチドSum_Peak_Area値とそれに対応する重標識された内部ペプチド標準Sum_Peak_Area値については、光/重比を計算します。生体試料ペプチドのモル存在量を計算するために、対応する光/重ペプチドのモル存在比の尺度として、この比率を使用してください。具体的には、生体試料ペプチドのモル存在量は重鎖/軽Sum_Peak_Area比を乗じた内部ペプチド標準モル豊富に等しいです。
       2. 各生物学的複製および標的ペプチドについては、線形回帰を用いて標準曲線を作成することにより、LC-SRM定量の直線範囲を特定します。具体的には、重鎖/軽Sum_Peak_Area比の値に対する内部ペプチド標準モル存在量値をプロット（生体試料の質量は、データセット全体で一定であることに注意してください）​​。各生体試料ペプチドSum_Peak_Area値が線形範囲内にあること（typicを必要味方、ダイナミックレンジの線形成分のみを使用すべきです。任意の非線形成分）は、細心の注意を払って使用する必要があります。同様に、各標的ペプチドの移行について、このステップを実行します。
          注：LC-QQQ-SRMによる検体の定量化は、広いダイナミックレンジ（〜10,000）を介して、線形である必要があります。ローエンドでは、バックグラウンド信号（ランダムMSノイズ+共溶出の検体からの再現可能な信号）を定量精度と精度が低下します。ハイエンドでは、検出器の飽和が（最終的には、これは溶出プロファイルは、特定の信号強度でフラットな出発になることがあります）非直線性の原因となります。
14. 適切な場合には、事前の内部ペプチド標準のスパイクインにサンプル量のわずかな違いを補正するために、このような中心傾向の正規化⁵⁰として、サンプル全体でグローバルな正規化を行います。必要な場合は、ステップ1.1からのみのハウスキーピングタンパク質を使用しています。
15. 必要に応じて、不足しているquantificatを転嫁イオンは^51,52値 。
    注：そうすることが、人工的に定量化分散を減少させるであろう、と統計的検定（ 例えば 、ANOVAにつながる可能性があるため、これは単に定量化（LLOQ）または検出（LOD）の半分の限界の半分の下限で欠損値を置き換えるために不適切です）偽陽性の結果を生成する（タイプIエラー）。しかし、欠損値を無視することも問題となる可能性があります。半分本当の豊かさの値がLOD未満であり、残りの半分はLLOQを超えている場合たとえば、その後、平均観察豊富さは意味真の豊かさを過大評価することになります。
16. アッセイはLC-SRM ^23-25 ​​のために広く受け入れられたガイドラインを満たしていることを確認してください。なお、定量値の変動係数は、典型的には、臨床アッセイのため≤25％、および非臨床アッセイの²⁵のための≤35％であることが必要です。医療または調節アプリケーションのために考慮されるべきである獣医製品またはサービスに関連したLC-SRMアッセイのためrovalは、アッセイは、このようなアッセイのための厳格な精度要件を満たすことを要求：「各濃度レベルで決定精度は、それが20％を超えてはならないLLOQを除き、変動係数（CV）の15％を超えてはなりませんCV ^"23,24。

結果

シグナル伝達経路の予測計算モデルの開発は、システム生物学⁵³の基本的な目標の一つです。残念ながら、でも広く研究さと高い臨床的意義を持っているされているシグナル伝達経路のために、それを定量的摂動に応答して、経路の挙動を予測するために、一般的には可能ではない（ 例えば 、これはMAPK / ERK経路⁵⁴の場合も同様です）。最近では、調査は経路^56を

ディスカッション

絶対的なタンパク質定量は、バイオマーカーの検証とシグナル伝達経路のモデリングとして生物医学的用途の非常に多様な範囲のために不可欠です。最近では、LC-SRMを使用して標的プロテオミクスは、ペプチド標準品、HPLC、QQQ-MS、およびLC-SRMデータ解析を含む多数の技術の改善の恩恵を受けています。したがって、イムノアッセイへの強力な代替となっています。イムノアッセイは、多重化...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit	Fisher	23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm	BioSpec Products	11079101z
Bestatin hydrochloride	Sigma	B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)	Lonza	12-614F
Cell culture EDTA, 500mM, pH8	Gibco	15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11550
Cell culture L-glutamine	Sigma	G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Gibco	10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v	Lonza	17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules	Fisher	A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep	Marienfeld-Superior	0640030
HEPES, 1M, pH 7.2	Mediatech	25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-2000
LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media	Michrom Bioresources	PM5/61200/00
LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media	Michrom Bioresources	PM3/93100/00
LC coated silica capillary, 50µm id	Polymicro Technologies	1068150017
LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene	SUN SRI	200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone	SUN SRI	500-061
Luciferase, from Photinus pyralis	Sigma	L9506-1MG
Pepstatin A	EMD Millipore	516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)	EMD Chemicals	9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail	Roche	04906837001
RapiGest SF	Waters	186001861
Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge	Waters	WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position	Waters	WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb	Fisher	03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
SpeedVac vacuum concentrator	Fisher	SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Tube decapper for Micronic tubes	USA Scientific	1765-4000
Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile	Sarstedt	72.694.006
Urea	Sigma	U0631-500g
Water, LC-MS grade	Fisher	W6-1