Modelos quirúrgicos de reflujo gastroesofágico con ratones

Resumen

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Resumen

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett’s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

Introducción

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a chronic disorder caused by the prolonged exposure of distal esophagus to gastric or gastroduodenal contents¹. Prolonged exposure to these noxious refluxates impairs the intrinsic defenses within the esophageal epithelium and thus results in esophagitis². Barrett’s esophagus arises in the setting of chronic reflux, and is a premalignant lesion with increased risk of esophageal adenocarcinoma^3,4. Despite the clinical importance, the mechanisms of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have not been well understood.

Animal models are essential for research on etiology, pathology, molecular mechanisms, prevention and treatment of human diseases. Up to date, various animal models of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have been developed using model animals^5,6. Mouse esophagus is lined with stratified squamous epithelium which is histologically similar to that in human esophagus. Although a mouse esophagus is different from human esophagus in terms of keratinization and the absence of submucosal glands, the mouse is still an appealing model animal because of its relatively low cost of maintenance and its potential of sophisticated genetic modifications. Two approaches are commonly used to model GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma in mice: reflux surgery and genetic modification. Reflux surgery is the best way to induce reflux and genetic modifications mimics molecular alterations^5,7. Reflux surgery can be combined with genetic modifications to further understand disease mechanisms⁸.

Many surgical procedures have been reported by us and others^6,9: (1) gastric reflux: pyloric ligation, pyloric constriction with forestomach ligation, Wendel cardioplasty, and esophagogastric anastomosis; (2) mixed reflux: esophagogastroduodenal anastomosis, esophagoduodenostomy (or esophagojejunostomy); (3) duodenal reflux: esophagogastroduodenal anastomosis plus gastrectomy; (4) reflux of chemical components: bilious reflux, pancreatic reflux, esophageal perfusion; and (5) esophageal transplantation⁵. Recently a microsurgical mouse model was reported to produce jejunal reflux via an esophagojejunostomy with magnets¹⁰. These surgical models have advantages over in vitro cell culture or organotypic culture models. In vitro, esophageal cells cannot tolerate a medium with high acidity or high concentrations of bile acids. Unconjugated bile acids which are commonly used to produce changes in esophageal epithelial cells in vitro are usually not present in the duodenal refluxate in vivo. Thus conclusions drawn from such in vitro studies should be taken with caution.

Surgery on the mouse esophagus remains a technical challenge because of its small size. A low rate of postoperative survival does not allow experiments which require certain sample size to reach statistically sound conclusions. In the past we have successfully developed and characterized surgical models of gastric reflux, mixed reflux, duodenal reflux with mice in long-term experiments^9,11,12. We have also provided consultation to several other groups in their mouse surgery. Herein, we describe three surgical procedures in mice in order to help the community to establish these models in their labs.

Protocolo

Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional.

1. Preparación del ratón

1. Utilice ratones durante ~ 20 g en el peso corporal o por encima de ~ 6 semanas de edad para la cirugía.
2. Antes de la cirugía, los ratones dar un laboratorio chow y agua ad libitum y mantener en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
3. Afeitarse el área quirúrgica con una cortadora de cabello. Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de 80 mg / kg de ketamina y 12 mg / kg de xilazina. Esta dosis pone ratones en el sueño en unos pocos minutos y proporciona anestesia suficiente para los siguientes procedimientos quirúrgicos.
4. Confirme anestesia adecuada en base a la ausencia de reflejo corneal y la retracción del miembro cuando se pellizca la almohadilla plantar. Aplicar lubricante pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad.
5. Esterilizar la piel con una solución de betadine.

2. Reflujo gástrico Modelo (Figura 1B)

1. Hacer una superiorincisión en la línea media de ~ 2 cm a partir de la xifoides señalando el ano.
2. Abre la cavidad abdominal a través de la línea media. Retire el xifoides para mejorar la exposición con un par de tijeras.
3. Separar y cortar los tejidos conectivos entre el hígado y el estómago. Ligar y cortar el haz buque entre el bazo y el fondo de ojo con el fin de liberar completamente el fondo de ojo.
4. Girar el fundus ligeramente a la izquierda y exponer el lado izquierdo de la unión gastroesofágica en el campo. Haga una incisión longitudinal 5 mm en el músculo lo largo del esófago distal usando un par de tijeras afiladas para exponer el epitelio.
5. Cortar abrir el epitelio a lo largo de la misma dirección (incisión 1, Figura 1B). Hacer tres incisiones en la forestomach (incisión 2, 3 y 4, la Figura 1B) para cortar la mayor parte del forestomach con unas tijeras afiladas de funcionamiento. Si el estómago no está vacío, retire con cuidado el contenido gástrico.
6. Coloque una sutu 8-0 prolenere (con un punto de la forma cónica de la aguja) por el punto A (en el esófago) y el punto A '(en la panza) con una precisión de la mucosa de la mucosa de la oposición. Igualmente lugar suturas por el punto B y el punto B ', y otros pares de puntos, respectivamente. Espaciar uniformemente estas suturas 3-4 mm uno del otro.
7. Lavar la cavidad abdominal con solución salina normal para limpiar la sangre y el contenido gástrico. Cierre de la pared abdominal con suturas de seda y la piel con grapas metálicas.

3. Mixta Modelo reflujo (Figura 1C)

1. Siga los pasos 2.1 a 2.4 para exponer la unión gastroesofágica.
2. Separar suavemente la cara dorsal del esófago de los vasos sanguíneos detrás del esófago. Pasar una pequeña punta de algodón entre el esófago y los vasos sanguíneos.
   Nota: El algodón puede ser eliminado parcialmente de la punta para reducir su tamaño. Esta punta de algodón tiene dos propósitos, levantando el esófago y la protección de los vasos sanguíneos.
3. Hacer inc dos 5 mm longitudinalisions cada uno en la unión gastroesofágica y el extremo proximal del duodeno adyacente al píloro con unas tijeras afiladas de funcionamiento. Para la incisión en el duodeno, evitar los vasos sanguíneos y el lugar en la frontera anti-mesentérica.
4. Anastomosan las incisiones con una precisión de la mucosa de la mucosa oposición interrumpidas 8-0 suturas Prolene. Por lo general, colocar 3-4 suturas en la cara dorsal y 2-3 suturas en la parte frontal.
5. Retire la punta de algodón. Lavar la cavidad abdominal con solución salina normal y cerrar la pared abdominal y la piel.

4. duodenal Reflujo Modelo (Figura 1D)

1. Siga paso 3.1 a 3.4 para generar reflujo mixto.
2. Levante con cuidado el estómago para exponer su cara posterior. Un lóbulo del hígado puede ser atrapado por los tejidos conectivos entre el hígado y la parte posterior del estómago. Corte cuidadosamente los tejidos conectivos, adecuadamente proteger el hígado, y exponer los vasos sanguíneos en la cara dorsal del esófago.
3. Ligar ycortar los vasos sanguíneos. Ligar y cortar el esófago en la unión gastroesofágica.
4. Ligar el duodeno en el píloro. Ligar y cortar el mesenterio. Retire todo el estómago.
5. Lavar la cavidad abdominal con solución salina normal. Cierre la pared abdominal y la piel.

Tratamiento 5. Post-quirúrgica

1. Después de la cirugía mantener la temperatura corporal con una almohadilla térmica. Sólo después de recuperar decúbito esternal, coloque el ratón hacia atrás con otros animales.
2. Dar antibióticos y analgésicos para prevenir la infección y aliviar el dolor. Inyectar Baytril (10 mg / kg, ip, una vez al día, durante 3 días) para prevenir la infección, y clorhidrato de buprenorfina como analgésico (0,05 mg / kg, sc, apuesta por dos días.). El ayuno no es necesario después de la cirugía.
   Una dieta líquida o blanda se puede dar.
3. Evaluar el estado de salud general sobre basis.If diarias los ratones muestran los siguientes signos (dramática pérdida de peso> 15%, la falta de aplicaciónetite, vocalización, la descarga de la boca, la nariz o los ojos, gesto encorvada, la inactividad, la actividad anormal de aseo), la eutanasia a los ratones.

Resultados

La mayoría de los ratones (> 95%) pueden sobrevivir a la cirugía. Durante el período perioperatorio, las principales causas de muerte son la sobredosis de anestésicos, sangrado y razones desconocidas.

Cuatro semanas después de la cirugía,> 90% ratones con reflujo gástrico o reflujo mixta y> 80% los ratones con el reflujo duodenal pueden sobrevivir. Durante este período, los ratones mueren principalmente de estenosis esofágica y la incapacidad para comer. Estos ratones muest...

Discusión

Varios modelos quirúrgicos se han establecido para imitar gástrica, duodenal y reflujo mixto en roedores. Estos tres procedimientos descritos aquí son adecuados para los experimentos a largo plazo con tasas razonables de supervivencia postoperatoria. Un investigador con experiencia quirúrgica debe ser capaz de captar la técnica después de un corto período de práctica.

El sangrado puede ser el resultado de la inyección intraperitoneal de anestésicos antes de la cirugía, laceración...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5"	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" Smooth	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0	Ethicon US, LLC
Ringer's solution	Henry Schein, Inc.
ketamine	Henry Schein, Inc.
xylazine	Henry Schein, Inc.