I modelli chirurgici di reflusso gastroesofageo con Mice

Riepilogo

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Abstract

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett’s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

Introduzione

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a chronic disorder caused by the prolonged exposure of distal esophagus to gastric or gastroduodenal contents¹. Prolonged exposure to these noxious refluxates impairs the intrinsic defenses within the esophageal epithelium and thus results in esophagitis². Barrett’s esophagus arises in the setting of chronic reflux, and is a premalignant lesion with increased risk of esophageal adenocarcinoma^3,4. Despite the clinical importance, the mechanisms of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have not been well understood.

Animal models are essential for research on etiology, pathology, molecular mechanisms, prevention and treatment of human diseases. Up to date, various animal models of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have been developed using model animals^5,6. Mouse esophagus is lined with stratified squamous epithelium which is histologically similar to that in human esophagus. Although a mouse esophagus is different from human esophagus in terms of keratinization and the absence of submucosal glands, the mouse is still an appealing model animal because of its relatively low cost of maintenance and its potential of sophisticated genetic modifications. Two approaches are commonly used to model GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma in mice: reflux surgery and genetic modification. Reflux surgery is the best way to induce reflux and genetic modifications mimics molecular alterations^5,7. Reflux surgery can be combined with genetic modifications to further understand disease mechanisms⁸.

Many surgical procedures have been reported by us and others^6,9: (1) gastric reflux: pyloric ligation, pyloric constriction with forestomach ligation, Wendel cardioplasty, and esophagogastric anastomosis; (2) mixed reflux: esophagogastroduodenal anastomosis, esophagoduodenostomy (or esophagojejunostomy); (3) duodenal reflux: esophagogastroduodenal anastomosis plus gastrectomy; (4) reflux of chemical components: bilious reflux, pancreatic reflux, esophageal perfusion; and (5) esophageal transplantation⁵. Recently a microsurgical mouse model was reported to produce jejunal reflux via an esophagojejunostomy with magnets¹⁰. These surgical models have advantages over in vitro cell culture or organotypic culture models. In vitro, esophageal cells cannot tolerate a medium with high acidity or high concentrations of bile acids. Unconjugated bile acids which are commonly used to produce changes in esophageal epithelial cells in vitro are usually not present in the duodenal refluxate in vivo. Thus conclusions drawn from such in vitro studies should be taken with caution.

Surgery on the mouse esophagus remains a technical challenge because of its small size. A low rate of postoperative survival does not allow experiments which require certain sample size to reach statistically sound conclusions. In the past we have successfully developed and characterized surgical models of gastric reflux, mixed reflux, duodenal reflux with mice in long-term experiments^9,11,12. We have also provided consultation to several other groups in their mouse surgery. Herein, we describe three surgical procedures in mice in order to help the community to establish these models in their labs.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali e Usa Comitato Istituzionale.

1. Preparazione del mouse

1. Utilizzare i mouse sopra ~ 20 g di peso corporeo o superiori a ~ 6 settimane di età per la chirurgia.
2. Prima dell'intervento, dare topi un laboratorio chow e acqua ad libitum e mantenere su un ciclo luce-buio 00:12 h.
3. Radere l'area chirurgica con un tagliatore di capelli. Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di 80 mg / kg di ketamina e 12 mg / kg xilazina. Questa dose mette topi nel sonno in pochi minuti e fornisce anestesia sufficienti per le seguenti procedure chirurgiche.
4. Confermare anestesia corretta basata sull'assenza di riflesso corneale e l'incolumità fisica retrazione quando la zampa viene pizzicato. Applicare lubrificante pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza.
5. Sterilizzare pelle con la soluzione betadine.

2. reflusso gastrico Model (Figura 1B)

1. Fare un superioreincisione mediana di ~ 2 cm a partire dal xifoide indicando l'ano.
2. Aprire la cavità addominale attraverso la linea mediana. Rimuovere la xifoideo per migliorare l'esposizione con un paio di forbici.
3. Separare e tagliare il tessuto connettivo tra il fegato e lo stomaco. Legare e tagliare il fascio nave tra la milza e il fondo, al fine di liberare completamente il fondo.
4. Ruotare il fondo leggermente a sinistra ed esporre il lato sinistro della giunzione gastroesofageo nel campo. Effettuare una incisione longitudinale 5 mm sul muscolo lungo l'esofago distale usando un paio di forbici affilate per esporre l'epitelio.
5. Tagliare aprire l'epitelio lungo la stessa direzione (incisione 1, Figura 1B). Fare tre incisioni sulla il prestomaco (incisione 2, 3 e 4, Figura 1B) per tagliare più del prestomaco con le forbici operativi taglienti. Se lo stomaco non è vuoto, rimuovere con attenzione contenuto gastrico.
6. Inserire un Sutu 8-0 prolenere (con un punto conico ago) per il punto A (in esofago) e un punto '(sulla il prestomaco) con una precisione di mucosa mucosa opposizione. Allo stesso modo luogo suture per il punto B e il punto B ', e altre coppie di punti, rispettivamente. Uniformemente spazio queste suture 3-4 mm l'una dall'altra.
7. Lavare la cavità addominale con soluzione fisiologica per pulire sangue e contenuto gastrico. Chiudere la parete addominale con suture in seta e la pelle con clip metalliche.

3. Misto reflusso Modello (Figura 1C)

1. Seguire i passaggi da 2.1 a 2.4 per esporre la giunzione gastroesofagea.
2. Separare delicatamente il lato dorsale dell'esofago dai vasi sanguigni dietro l'esofago. Passare una piccola punta di cotone tra i vasi sanguigni e dell'esofago.
   Nota: Il cotone può essere parzialmente rimosso dalla punta per ridurne le dimensioni. Questa punta di cotone due scopi, sollevando l'esofago e proteggere i vasi sanguigni.
3. Fai inc due 5 millimetri longitudinaleisions ciascuno sulla giunzione gastroesofageo e l'estremità prossimale del duodeno adiacente al piloro con le forbici operativi taglienti. Per l'incisione sul duodeno, evitare i vasi sanguigni e immettere sul confine anti-mesenterica.
4. Anastomose le incisioni con mucosa preciso per mucosa opposizione con interrotti 8-0 punti di sutura Prolene. Solitamente posizionare 3-4 sutura sul lato dorsale e 2-3 suture sul lato anteriore.
5. Rimuovere la punta di cotone. Lavare la cavità addominale con soluzione salina normale e chiudere la parete addominale e la pelle.

4. duodenale reflusso Modello (Figura 1D)

1. Seguire il passaggio da 3.1 a 3.4 per generare reflusso misto.
2. Sollevare delicatamente lo stomaco per esporre il suo lato posteriore. Un lobo del fegato può essere catturato da tessuto connettivo tra il fegato e la parte posteriore dello stomaco. Asportare accuratamente i tessuti connettivi, adeguatamente proteggere il fegato, ed esporre i vasi sanguigni sul lato dorsale dell 'esofago.
3. Legare etagliare i vasi sanguigni. Legare e tagliare l'esofago all'incrocio gastroesofageo.
4. Legare duodeno al piloro. Legare e tagliare il mesentere. Rimuovere l'intero stomaco.
5. Lavare la cavità addominale con soluzione fisiologica. Chiudere la parete addominale e la pelle.

Il trattamento post-chirurgico 5.

1. Dopo l'intervento chirurgico mantenere la temperatura corporea con una piastra elettrica. Solo dopo aver ripreso decubito sternale, posizionare il mouse posteriore con altri animali.
2. Dare antibiotici e analgesici per prevenire l'infezione e alleviare il dolore. Iniettare Baytril (10 mg / kg, ip, qd, per 3 giorni) per prevenire l'infezione, e buprenorfina cloridrato (0,05 mg / kg, sc, offerta. Per due giorni) come antidolorifico. Il digiuno non è necessario dopo l'intervento chirurgico.
   Una dieta liquida o morbido può essere dato.
3. Valutare lo stato di salute generale basis.If giornaliere topi mostrano i seguenti segni (drammatica perdita di peso> 15%, la mancanza di appetite, vocalizzazione, scaricare dalla bocca, il naso o gli occhi, gesto curvo, l'inattività, l'attività anormale grooming), l'eutanasia i topi.

Risultati

La maggior parte dei topi (> 95%) possono sopravvivere chirurgia. Durante il periodo perioperatorio, le principali cause di morte includono sovradosaggio di anestetici, sanguinamento e motivi sconosciuti.

Quattro settimane dopo l'intervento,> 90% topi con reflusso gastrico o reflusso misto e> 80% topi con reflusso duodeno possono sopravvivere. Durante questo periodo, i topi muoiono principalmente da stenosi esofagea e l'incapacità di mangiare. Questi topi mostrano segni di ...

Discussione

Vari modelli chirurgici sono stati stabiliti per imitare gastrica, duodenale e reflusso misto nei roditori. Queste tre procedure descritte sono adatte per esperimenti a lungo termine con tassi ragionevoli di sopravvivenza postoperatoria. Un ricercatore con esperienza chirurgica dovrebbe essere in grado di cogliere la tecnica, dopo un breve periodo di pratica.

Il sanguinamento può derivare da iniezione intraperitoneale di anestetici prima dell'intervento chirurgico, la lacerazione del fe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5"	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" Smooth	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0	Ethicon US, LLC
Ringer's solution	Henry Schein, Inc.
ketamine	Henry Schein, Inc.
xylazine	Henry Schein, Inc.