Modelos cirúrgicos de refluxo gastroesofágico com Ratos

Resumo

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Resumo

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett’s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

Introdução

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a chronic disorder caused by the prolonged exposure of distal esophagus to gastric or gastroduodenal contents¹. Prolonged exposure to these noxious refluxates impairs the intrinsic defenses within the esophageal epithelium and thus results in esophagitis². Barrett’s esophagus arises in the setting of chronic reflux, and is a premalignant lesion with increased risk of esophageal adenocarcinoma^3,4. Despite the clinical importance, the mechanisms of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have not been well understood.

Animal models are essential for research on etiology, pathology, molecular mechanisms, prevention and treatment of human diseases. Up to date, various animal models of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have been developed using model animals^5,6. Mouse esophagus is lined with stratified squamous epithelium which is histologically similar to that in human esophagus. Although a mouse esophagus is different from human esophagus in terms of keratinization and the absence of submucosal glands, the mouse is still an appealing model animal because of its relatively low cost of maintenance and its potential of sophisticated genetic modifications. Two approaches are commonly used to model GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma in mice: reflux surgery and genetic modification. Reflux surgery is the best way to induce reflux and genetic modifications mimics molecular alterations^5,7. Reflux surgery can be combined with genetic modifications to further understand disease mechanisms⁸.

Many surgical procedures have been reported by us and others^6,9: (1) gastric reflux: pyloric ligation, pyloric constriction with forestomach ligation, Wendel cardioplasty, and esophagogastric anastomosis; (2) mixed reflux: esophagogastroduodenal anastomosis, esophagoduodenostomy (or esophagojejunostomy); (3) duodenal reflux: esophagogastroduodenal anastomosis plus gastrectomy; (4) reflux of chemical components: bilious reflux, pancreatic reflux, esophageal perfusion; and (5) esophageal transplantation⁵. Recently a microsurgical mouse model was reported to produce jejunal reflux via an esophagojejunostomy with magnets¹⁰. These surgical models have advantages over in vitro cell culture or organotypic culture models. In vitro, esophageal cells cannot tolerate a medium with high acidity or high concentrations of bile acids. Unconjugated bile acids which are commonly used to produce changes in esophageal epithelial cells in vitro are usually not present in the duodenal refluxate in vivo. Thus conclusions drawn from such in vitro studies should be taken with caution.

Surgery on the mouse esophagus remains a technical challenge because of its small size. A low rate of postoperative survival does not allow experiments which require certain sample size to reach statistically sound conclusions. In the past we have successfully developed and characterized surgical models of gastric reflux, mixed reflux, duodenal reflux with mice in long-term experiments^9,11,12. We have also provided consultation to several other groups in their mouse surgery. Herein, we describe three surgical procedures in mice in order to help the community to establish these models in their labs.

Protocolo

Todas as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional.

1. Preparação do rato

1. Use camundongos mais ~ 20 g no peso corporal ou superiores a 6 semanas de idade para a cirurgia.
2. Antes da cirurgia, dar camundongos um laboratório de comida e água ad libitum e manter em um ciclo claro-escuro de 00:12 h.
3. Raspar a área cirúrgica com uma máquina de cortar cabelo. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de 80 mg / kg de cetamina e 12 mg / kg de xilazina. Esta dose coloca ratos no sono em poucos minutos e fornece anestesia suficiente para os seguintes procedimentos cirúrgicos.
4. Confirme anesthetization adequada com base na ausência do reflexo corneal e retração membro quando a pata é comprimido. Aplicar lubrificante pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.
5. Esterilizar a pele com solução de betadine.

2. Modelo refluxo gástrico (Figura 1B)

1. Realizar uma superiorincisão na linha média de ~ 2 cm a partir da xifóide apontando para o ânus.
2. Abra-se a cavidade abdominal através da linha média. Remova o xifóide para aumentar a exposição com um par de tesouras.
3. Separa-se e cortar os tecidos conjuntivos entre o fígado e o estômago. Ligadura e cortar o feixe vascular entre o baço e do fundo, a fim de completamente livre até o fundo.
4. Ligue o fundo ligeiramente para a esquerda e expor o lado esquerdo da junção gastro-esofágico no campo. Adicione uma incisão longitudinal de 5 mm no músculo distai ao longo do esófago utilizando um par de tesouras para expor o epitélio.
5. Corte aberto do epitélio ao longo da mesma direcção (incisão 1, Figura 1B). Adicione três incisões na pança de incisão (2, 3 e 4, Figura 1B) para eliminar a maioria da pança com uma tesoura afiada operacionais. Se o estômago não está vazio, remova cuidadosamente o conteúdo gástrico.
6. Coloque um Sutu prolene 8-0re (com um ponto de afunilamento agulha) através de um ponto (no esôfago) e ponto A '(na pança) com uma precisão de mucosa da mucosa oposição. De igual modo lugar suturas através do ponto b e Ponto b ', e outros pares de pontos, respectivamente. Uniformemente espaço estas suturas 3-4 mm uns dos outros.
7. Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal para limpar o sangue e o conteúdo gástrico. Feche a parede abdominal com fio de seda e pele com grampos metálicos.

3. Modelo de Refluxo mistos (Figura 1C)

1. Siga os passos 2.1 a 2.4 para expor a junção gastroesofágico.
2. Suavemente separar o lado dorsal do esófago a partir dos vasos sanguíneos por trás do esófago. Passe uma ponta de algodão pequena entre os vasos sanguíneos e esôfago.
   Nota: O algodão pode ser parcialmente removida a partir da ponta para reduzir o seu tamanho. Esta dica de algodão serve a dois propósitos, levantando o esôfago e proteger os vasos sanguíneos.
3. Faça inc dois cinco milímetros longitudinalisions cada na junção gastro-esofágico e a extremidade proximal do duodeno adjacente ao piloro com uma tesoura afiada operacionais. Para a incisão no duodeno, evitar vasos sanguíneos e coloque na fronteira anti-mesentérica.
4. Anastomosar as incisões com mucosa com precisão de mucosas oposição interrompidas 8-0 suturas de Prolene. Normalmente coloque 3-4 suturas na face dorsal e 2-3 suturas na parte da frente.
5. Retire a ponta de algodão. Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal e fechar a parede abdominal e a pele.

4. Modelo Duodenal refluxo (Figura 1D)

1. Siga o passo 3.1 a 3.4 para gerar misto de refluxo.
2. Com cuidado, levante o estômago para expor a sua parte de trás. Um lobo do fígado podem ser abrangidos pelo tecido conjuntivo entre o fígado e parte de trás do estômago. Corte cuidadosamente os tecidos conjuntivos, corretamente proteger o fígado, e expor os vasos sanguíneos no lado dorsal do esôfago.
3. Ligadura ecortar os vasos sanguíneos. Ligadura e cortado o esófago na junção gastroesofágico.
4. Ligar o duodeno no piloro. Ligadura e cortar o mesentério. Remover todo o estômago.
5. Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal. Fechar a parede abdominal e a pele.

5. O tratamento pós-cirúrgico

1. Após a cirurgia manter a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento. Só depois de recuperar decúbito esternal, coloque os ratos de volta com outros animais.
2. Dar antibióticos e analgésicos para prevenir a infecção e aliviar a dor. Injectar Baytril (10 mg / kg, ip, qd, durante 3 dias) para prevenir a infecção, e cloridrato de buprenorfina (0,05 mg / kg, sc, bid. Dois dias) como analgésico. O jejum não é necessário após a cirurgia.
   A dieta líquida ou mole pode ser dada.
3. Avaliar o estado de saúde geral sobre basis.If diários os ratos mostram os seguintes sinais (dramática perda de peso> 15%, a falta de appetite, vocalização, descarregar a partir da boca, nariz ou olhos, gesto curvado, inatividade, atividade aliciamento anormal), sacrificar os ratos.

Resultados

A maioria dos ratinhos (> 95%) pode sobreviver à cirurgia. Durante o período perioperatório, as principais causas de morte incluem overdose de anestésicos, sangramento e razões desconhecidas.

Quatro semanas após a cirurgia,> 90% de ratinhos com refluxo gástrico ou misto de refluxo e> 80% de ratinhos com refluxo duodenal podem sobreviver. Durante este período, os ratos morrem principalmente de estenose esofágica e incapacidade para comer. Estes ratos mostram sinais de estres...

Discussão

Vários modelos cirúrgicos foram criados para imitar gástrica, duodenal e misto de refluxo em roedores. Estes três procedimentos aqui descritos são adequados para experimentos de longo prazo com taxas razoáveis ​​de sobrevivência pós-operatória. Um pesquisador com experiência cirúrgica deve ser capaz de compreender a técnica, após um curto período de prática.

A hemorragia pode resultar de injecção intraperitoneal de anestésicos antes da cirurgia, laceração do fígado d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5"	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" Smooth	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0	Ethicon US, LLC
Ringer's solution	Henry Schein, Inc.
ketamine	Henry Schein, Inc.
xylazine	Henry Schein, Inc.