Les modèles de chirurgie de reflux gastro-œsophagien avec des souris

Résumé

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Résumé

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett’s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

Introduction

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a chronic disorder caused by the prolonged exposure of distal esophagus to gastric or gastroduodenal contents¹. Prolonged exposure to these noxious refluxates impairs the intrinsic defenses within the esophageal epithelium and thus results in esophagitis². Barrett’s esophagus arises in the setting of chronic reflux, and is a premalignant lesion with increased risk of esophageal adenocarcinoma^3,4. Despite the clinical importance, the mechanisms of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have not been well understood.

Animal models are essential for research on etiology, pathology, molecular mechanisms, prevention and treatment of human diseases. Up to date, various animal models of GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma have been developed using model animals^5,6. Mouse esophagus is lined with stratified squamous epithelium which is histologically similar to that in human esophagus. Although a mouse esophagus is different from human esophagus in terms of keratinization and the absence of submucosal glands, the mouse is still an appealing model animal because of its relatively low cost of maintenance and its potential of sophisticated genetic modifications. Two approaches are commonly used to model GERD, Barrett’s esophagus and adenocarcinoma in mice: reflux surgery and genetic modification. Reflux surgery is the best way to induce reflux and genetic modifications mimics molecular alterations^5,7. Reflux surgery can be combined with genetic modifications to further understand disease mechanisms⁸.

Many surgical procedures have been reported by us and others^6,9: (1) gastric reflux: pyloric ligation, pyloric constriction with forestomach ligation, Wendel cardioplasty, and esophagogastric anastomosis; (2) mixed reflux: esophagogastroduodenal anastomosis, esophagoduodenostomy (or esophagojejunostomy); (3) duodenal reflux: esophagogastroduodenal anastomosis plus gastrectomy; (4) reflux of chemical components: bilious reflux, pancreatic reflux, esophageal perfusion; and (5) esophageal transplantation⁵. Recently a microsurgical mouse model was reported to produce jejunal reflux via an esophagojejunostomy with magnets¹⁰. These surgical models have advantages over in vitro cell culture or organotypic culture models. In vitro, esophageal cells cannot tolerate a medium with high acidity or high concentrations of bile acids. Unconjugated bile acids which are commonly used to produce changes in esophageal epithelial cells in vitro are usually not present in the duodenal refluxate in vivo. Thus conclusions drawn from such in vitro studies should be taken with caution.

Surgery on the mouse esophagus remains a technical challenge because of its small size. A low rate of postoperative survival does not allow experiments which require certain sample size to reach statistically sound conclusions. In the past we have successfully developed and characterized surgical models of gastric reflux, mixed reflux, duodenal reflux with mice in long-term experiments^9,11,12. We have also provided consultation to several other groups in their mouse surgery. Herein, we describe three surgical procedures in mice in order to help the community to establish these models in their labs.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle.

1. Préparation de la souris

1. Utilisez la souris sur ~ 20 g de poids corporel ou au-dessus ~ 6 semaines d'âge pour la chirurgie.
2. Avant la chirurgie, les souris donner un chow et de l'eau ad libitum de laboratoire et de maintenir sur un cycle lumière-obscurité de 12:12 h.
3. Rasez la zone chirurgicale avec une tondeuse à cheveux. Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de 80 mg / kg de kétamine et 12 mg / kg de xylazine. Cette dose met souris dans le sommeil en quelques minutes et fournit l'anesthésie suffisants pour les procédures chirurgicales suivantes.
4. Confirmez anesthésie appropriée sur la base de l'absence du réflexe cornéen et des membres de rétraction lorsque le coussinet est pincé. Appliquer pommade ophtalmique lubrifiante sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
5. Stériliser la peau avec une solution de bétadine.

2. reflux gastrique modèle (figure 1B)

1. Faire une supérieureincision médiane de ~ 2 cm à partir de la pointe du sternum pointant vers l'anus.
2. Ouvrez la cavité abdominale à travers la ligne médiane. Retirez la pointe du sternum pour améliorer l'exposition avec une paire de ciseaux.
3. Indépendante et couper les tissus conjonctifs entre le foie et l'estomac. Ligaturer et couper le faisceau de navire entre la rate et le fond afin de libérer complètement le fond.
4. Tourner le fond légèrement vers la gauche et exposer le côté gauche de la jonction gastro-œsophagienne dans le domaine. Faire une incision longitudinale de 5 mm sur le muscle le long de l'oesophage distal en utilisant une paire de ciseaux tranchants pour exposer l'épithélium.
5. Couper l'épithélium ouvrir le long de la même direction (1 incision, figure 1B). Faire trois incisions sur le préestomac (incision 2, 3 et 4, figure 1B) pour couper la plupart du préestomac avec des ciseaux d'exploitation nettes. Si l'estomac est pas vide, retirez soigneusement le contenu gastrique.
6. Placer une sutu 8-0 prolènere (avec une pointe effilée de l'aiguille) par le point A (sur l'œsophage) et le point A '(sur le préestomac) avec la muqueuse précise muqueuses opposition. De même endroit sutures par le point B et le point B ', et d'autres paires de points, respectivement. Ces sutures uniformément l'espace de 3 à 4 mm de l'autre.
7. Laver la cavité abdominale avec du sérum physiologique pour nettoyer le sang et le contenu gastrique. Fermez la paroi abdominale avec des sutures de soie et de la peau avec des pinces métalliques.

3. Modèle mixte Reflux (figure 1C)

1. Suivez les étapes 2.1 à 2.4 pour exposer la jonction gastro-oesophagien.
2. Séparez délicatement la face dorsale de l'œsophage à partir des vaisseaux sanguins derrière l'œsophage. Passer une petite pointe de coton entre l'œsophage et les vaisseaux sanguins.
   Remarque: Coton peut être partiellement retiré de la pointe pour réduire sa taille. Cette astuce de coton sert à deux fins, soulevant l'œsophage et de protéger les vaisseaux sanguins.
3. Assurez inc deux 5 mm longitudinalechaque isions sur la jonction gastro-œsophagienne et l'extrémité proximale du duodénum adjacent au pylore avec des ciseaux tranchants de fonctionnement. Pour l'incision sur le duodénum, ​​éviter les vaisseaux sanguins et les placer sur le bord anti-mésentérique.
4. Anastomoser les incisions avec la muqueuse précise muqueuses opposition interrompues 8-0 sutures Prolene. Habituellement placer des sutures 3-4 sur la face dorsale et 2-3 sutures sur la face avant.
5. Retirer la pointe de coton. Laver la cavité abdominale avec une solution saline normale et fermer la paroi abdominale et la peau.

4. duodénal Reflux modèle (figure 1D)

1. Suivez l'étape 3.1 à 3.4 pour générer reflux mixte.
2. Soulevez délicatement l'estomac pour exposer sa face arrière. Un lobe du foie peut être capturé par les tissus conjonctifs entre le foie et l'arrière de l'estomac. Découpez soigneusement les tissus conjonctifs, bien protéger le foie, et d'exposer les vaisseaux sanguins sur la face dorsale de l'œsophage.
3. Ligaturer etcouper les vaisseaux sanguins. Ligaturer et couper l'œsophage à la jonction gastro-oesophagien.
4. Ligaturer le duodénum au pylore. Ligaturer et couper le mésentère. Retirer l'ensemble estomac.
5. Laver la cavité abdominale avec du sérum physiologique. Fermez la paroi abdominale et la peau.

5. Le traitement post-opératoire

1. Après la chirurgie maintenir la température corporelle d'un coussin chauffant. Seulement après avoir repris décubitus sternal, placez la souris de retour avec d'autres animaux.
2. Donner des antibiotiques et des analgésiques pour prévenir l'infection et de soulager la douleur. Injecter Baytril (10 mg / kg, ip, qd, pendant 3 jours) pour prévenir l'infection, et la buprénorphine chlorhydrate (0,05 mg / kg, sc, offre. Pour deux jours) comme analgésique. Le jeûne est pas nécessaire après la chirurgie.
   Une alimentation liquide ou molle peut être donné.
3. Évaluer l'état de santé général sur basis.If quotidiennes les souris montrent des signes suivants (de la perte dramatique de poids> 15%, le manque d'applicationetite, la vocalisation, décharger de la bouche, le nez ou les yeux, le geste voûté, l'inactivité, l'activité de toilettage anormale), euthanasier les souris.

Résultats

La plupart des souris (> 95%) peuvent survivre à la chirurgie. Au cours de la période périopératoire, les principales causes de décès comprennent surdose d'anesthésiques, des saignements et des raisons inconnues.

Quatre semaines après la chirurgie,> 90% des souris souffrant de reflux gastrique ou de reflux mixte et> 80% des souris avec le reflux duodénal peuvent survivre. Pendant cette période, les souris meurent de sténose de l'œsophage et de l'incapacité d...

Discussion

Différents modèles chirurgicales ont été créés pour imiter gastrique, duodénal et le reflux mixte chez les rongeurs. Ces trois procédures décrites ici sont appropriés pour des expériences à long terme avec des taux raisonnables de survie postopératoire. Un chercheur ayant une expérience chirurgicale devrait être en mesure de saisir la technique après une courte période de pratique.

Le saignement peut résulter de l'injection intraperitoneale d'anesthésiques avant un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5"	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" Smooth	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0	Ethicon US, LLC
Ringer's solution	Henry Schein, Inc.
ketamine	Henry Schein, Inc.
xylazine	Henry Schein, Inc.