Enriquecimiento de la Matriz Extracelular Las proteínas de los tejidos y la digestión en péptidos para el análisis de espectrometría de masas

Resumen

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Resumen

La matriz extracelular (ECM) es una compleja malla de proteínas reticuladas que proporciona señales biofísicas y bioquímicas que son importantes reguladores de la proliferación celular, la supervivencia, la migración, etc. El ECM desempeña un papel importante en el desarrollo y en diversas patologías que incluyen cardio-vascular y las enfermedades músculo-esquelético, la fibrosis y cáncer. Por lo tanto, la caracterización de la composición de ECMs de los tejidos normales y enfermos podría conducir a la identificación de nuevos biomarcadores de pronóstico y diagnóstico y nuevas dianas terapéuticas potenciales. Sin embargo, la naturaleza misma de las proteínas ECM (grandes en tamaño, reticulados y unidos covalentemente, fuertemente glicosilada) ha hecho que los análisis bioquímicos de ECMs desafiante. Para superar este desafío, hemos desarrollado un método para enriquecer ECM de los tejidos y tumores frescos o congelados que se aprovecha de la insolubilidad de las proteínas ECM. Se describe aquí en detalle el procedimiento descelularización que consiste en i secuencialncubations en tampones de diferente pH y concentraciones de sal y de detergente y que los resultados en 1) la extracción de intracelular (citosólico, nuclear, membrana y citoesqueleto) proteínas y 2) el enriquecimiento de las proteínas ECM. A continuación, describimos cómo deglycosylate y digerir preparaciones de proteínas ECM enriquecido en péptidos para su posterior análisis por espectrometría de masas.

Introducción

La matriz extracelular (ECM) es una compleja malla de proteínas reticulados y glicosilada que proporciona soporte arquitectónico y anclaje de las células y define, en parte, las propiedades biomecánicas tejidos ^'1,2. Proteínas ECM también señalan a las células ya sea directamente a través de sus receptores (por ejemplo, integrinas, syndecans, etc.) o mediante la modulación de la señalización del factor de crecimiento ^3. Así, el ECM ofrece señales biofísicas y bioquímicas que son importantes reguladores de los procesos celulares como la proliferación, la supervivencia, la polarización, la diferenciación, la migración, etc.

El ECM desempeña un papel clave en la fisiología, el desarrollo y el envejecimiento ^4. Por otra parte, varias patologías, como las enfermedades cardiovasculares, la fibrosis, enfermedades músculo-esquelético, cánceres son causados ​​por o como resultado, las alteraciones de ECM. Además, el ECM contribuye al mantenimiento de nichos de células madre y la identificación de moléculas de ECM clave then atención al stemness tendrán aplicación directa en la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa ^5. Sin embargo, a pesar de su importancia, el ECM ha permanecido, hasta hace poco, poco explorada ^6.

En silico análisis ha revelado que el matrisome, que se define como el conjunto de ECM y proteínas ECM-asociado, comprende los productos de varios cientos de genes, tanto en el humano y el ratón genomas ^1,7,8. Sin embargo, la insolubilidad de las proteínas ECM ha obstaculizado la caracterización sistemática de la composición in vivo de matrices extracelulares de especímenes normales y patológicas. Recientemente hemos demostrado que esta insolubilidad podría convertirse en una ventaja y ser usado para enriquecer las proteínas ECM ^8-10. Nosotros y otros demostraron además que la espectrometría de masas era un método de elección para caracterizar la composición de ECMs ^{de 8 - 10, 13.}

Nosotrosdescribir aquí un procedimiento descelularización que consiste en incubaciones secuenciales en tampones de diferente pH y concentraciones de sal y detergentes. Este procedimiento resulta en la extracción (o agotamiento) de las proteínas citosólicas, nucleares, de membrana y del citoesqueleto y el enriquecimiento de las proteínas de ECM. A continuación, describimos cómo digerir preparaciones de proteínas ECM enriquecido en péptidos para su posterior análisis por espectrometría de masas.

Usando los procedimientos detallados e ilustrado aquí, hemos enriquecido con éxito y que se caracteriza por espectrometría de masas de las matrices extracelulares de diez diferentes tejidos y tipos de tumores: pulmonar normal murino ^8, humanos y de colon murino ^8,9, hígado humano ^9, tumores colorrectales humanos y derivados metástasis hepáticas ^9, xenoinjertos de melanoma ^8, xenoinjertos tumorales mamarias ^10, islotes pancreáticos de murino y insulinomas murinos (Naba et al., sin publicar). Comparación de los diferentes matrisomes revelaron firmas de ECM en tejidos y específicos de tumores que más podrían ser utilizados como potenciales biomarcadores de diagnóstico o pronóstico.

Creemos que este procedimiento puede ser aplicado a otros especímenes con o sin modificaciones relativamente menores.

Protocolo

NOTA: El procedimiento puede llevarse a cabo en los tejidos congelados frescos o flash. Se recomienda perfundir tejidos altamente vascularizados con PBS en el momento de la disección para eliminar los glóbulos rojos y las proteínas plasmáticas. No se recomienda realizar el procedimiento en tejidos fijados como la fijación (es decir, la reticulación química) interfiere con descelularización y también puede comprometer significativamente el análisis de espectrometría de masas subsiguiente. Durante todo el procedimiento, se recomienda el uso de tubos de baja retención y puntas de pipeta para maximizar la recuperación de proteínas y péptidos.

1. Descelularización de tejidos o tumores

NOTA: Antes de empezar, prepare los reactivos y añadir inhibidores de la proteasa (suministradas con el kit de extracción de proteínas Compartimiento) para el volumen deseado de cada búfer. Todos los tampones y las muestras deben mantenerse en hielo durante la duración del experimento excepto el Buffer CS que necesita ser mantenido a RT para evitar la precipitación SDSsanea-.
NOTA: El protocolo usa una serie de incubación en los tampones de diferente pH y que contiene diferentes cantidades de sales y detergentes secuencialmente proteínas intracelulares extraer y enriquecer para las proteínas ECM insolubles (Figura 1, Tabla 1; ver también la discusión de alternativas para el uso de la kit comercial se detalla aquí). Los volúmenes de los reactivos que figuran a continuación son para 100 mg de tejidos o tumores (ver Tabla 1) y necesitan ser ajustados apropiadamente.

1. Homogeneizar 100 mg de tejido en 500 l de tampón C que contienen inhibidores de la proteasa utilizando un homogeneizador de tejidos hasta que el tejido está completamente interrumpido y se obtiene una suspensión homogénea.
   NOTA: Añadir desoxirribonucleasa I (concentración final: 200 g / ml, reconstituido de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y ribonucleasa A (concentración final: 20 mg / ml, reconstituido de acuerdo con las instrucciones del fabricante) aBuffer N.
2. Extracción secuencial de las proteínas solubles intracelulares
   1. La extracción de las proteínas citosólicas. Incubar el homogeneizado en un rotador tubo durante 20 min a 4 ° C. Guardar una pequeña alícuota (10 l 20 l) del homogeneizado por Western blot posterior (véase la sección Resultados esperados y la Figura 2).
   2. Centrifugar el homogeneizado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio, esto constituirá la fracción citosólica (C) del análisis de transferencia Western. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C.
   3. Para lavar, resuspender el precipitado en 400 l de tampón W que contiene inhibidores de la proteasa e incubar la muestra en un rotador tubo durante 20 min a 4 ° C. Centrifugar el homogeneizado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
   4. Para extraer, proteínas nucleares, resuspender el precipitado en 150 l de tampón de N que contienen inhibidores de la proteasa, deoxyribonuclease I y ribonucleasa A e incubar la muestra en un tubo de rotador durante 30 min a 4 ° C.
   5. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo limpio. Repita este paso una vez: después de centrifugar la muestra para el segundo tiempo, añadir el sobrenadante al sobrenadante anterior: esto constituirá la (N) de la fracción nuclear análisis de transferencia Western. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C. A continuación, realice los lavados según el paso 1.2.3.
   6. Para extraer proteínas de la membrana, resuspender el precipitado en 100 l de tampón M que contienen inhibidores de la proteasa e incubar la muestra en un rotador tubo durante 30 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C
   7. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio: esto constituirá la fracción de membrana (M) de la Western blot. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C.
   8. Para extraer las proteínas del citoesqueleto, resuspender el precipitado en 200 l de tampón de CS que contienen inhibidores de la proteasa e incubar la muestra en un rotador tubo durante 30 min a RT.
      Tenga en cuenta que el sedimento no se disolverá completamente. Se aconseja interrumpir el precipitado pipeteando arriba y abajo hasta la observación de la interrupción de la pastilla.
   9. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 30 min a TA. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio. Nota en este punto una marcada disminución adicional en el tamaño de la pastilla (ver video).
   10. Resuspender el precipitado en 150 l de inhibidores de la proteasa que contiene tampón C y se incuba la muestra en un rotador tubo durante 20 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   11. Recoger el sobrenadante y añadir al sobrenadante anterior: esto constituirá la fracción citoesqueleto (CS) de la Western blot. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C.
   12. Realizar lavados adicionales. Resuspender el precipitado en 500 l de PBS que contenía inhibidores de la proteasa unand incubar la muestra en un rotador tubo durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Repita este paso tres veces.
       NOTA: Todos los rastros de detergentes necesita ser eliminado por extensos lavados antes de la digestión de las proteínas en péptidos (véase la sección 3). En este punto, el sedimento ECM-enriquecido puede ser-flash congelado y se mantiene a -80 ° C. Tenga en cuenta que el tamaño de la pastilla dependerá de la cantidad de (ECM) proteínas insolubles en el material de partida y la eficiencia de la descelularización.

2. Control de la Calidad de la Descelularización / ECM Enriquecimiento por SDS-PAGE y Western Blot

1. Mezclar 10-20 l alícuota del extracto total de tejidos y 50 alícuotas de las fracciones intermedias con Laemmli Buffer contenía DTT 100 mM. Resuspender el, fracción insoluble ECM-enriquecido en 3x Laemmli tampón que contenía DTT 100 mM.
   Nota: se eleva la concentraciónde la TDT y SDS ayudar en la solubilización de las proteínas ECM que son relativamente insolubles.
2. Separar las proteínas mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa.
3. Realice inmunes transferencias utilizando anticuerpos para controlar las proteínas representante de cada una de las fracciones citosólicas, nucleares, de membrana, citoesqueleto y ECM (véase la sección Resultados Representante, Tabla 2 y la Figura 2).

3. Dentro de la solución de digestión de las proteínas a péptidos para el Análisis de espectrometría de masas

NOTA: El sedimento obtenido después del procedimiento descelularización y la eliminación de SDS es altamente enriquecido en proteínas ECM insolubles para su posterior análisis por espectrometría de masas estas proteínas deben ser digerido en péptidos. Tenga en cuenta que, como consecuencia de ECM proteína insolubilidad, no es posible en este paso para medir la concentración de proteína de la muestra. Por lo tanto ofrecemos volúmenes de reactivos para digerir el ECM-enrimuestras CHED en péptidos basados ​​en el tamaño (mm) o el peso seco de la pastilla ECM-enriquecido (Tabla 3). Las soluciones de bicarbonato de amonio, urea, DTT, yodoacetamida y ácido trifluoroacético todos necesitan ser recién preparado.

1. Resuspender la muestra ECM-enriquecido añadiendo el volumen apropiado de 8 M urea al sedimento ECM-enriquecido y añadir TDT a una concentración final de 10 mM (véase la Tabla 3). Incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas a 37 ° C.
   NOTA: en este punto las proteínas ECM no serán totalmente disueltos y las visiblemente grandes partículas de proteína no deben ser eliminados por centrifugación o filtración. La suspensión se borrará al desglucosilación y la digestión (ver video).
2. Alquilación
   1. Prepare la solución de yodoacetamida en agua grado HPLC. Enfriar la muestra a temperatura ambiente y añadir el yodoacetamida a una concentración final de 25 mM. Para la alquilación completa, la TDT: relación de yodoacetamida debe estar entre 1: 2.5 y 1: 3.
   2. Incubar en la oscuridad durante 30 min a TA.
3. Desglicosilación:
   Se necesita desglicosilación para eliminar las cadenas laterales de hidratos de carbono que interfieren con la identificación de péptidos modificados por glicosilación N = Conectado: Nota.
   1. Diluir con 2 M de urea con bicarbonato de amonio 100 mM pH 8,0 y agregue la cantidad apropiada de PNGasaF (ver Tabla 3). Incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas a 37 ° C.
4. Digestión
   1. Añadir Lys-C e incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. Añadir la tripsina y se incuba con agitación continua a 1.400 rpm O / N a 37 ° C.
      NOTA: la suspensión ECM-rica que comenzó nublado después de la reconstitución inicial en 8M urea parece claro después de O / N digestión (ver video).
   2. Añadir una segunda alícuota de tripsina a la muestra e incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas más a 37 ° C.
5. Acidificación
   1. Una vez completada la digestión, inactivar la tripsina mediante la acidificación de la muestra recién preparada con 50% ácido trifluoroacético (TFA). La muestra debe llegar a pH <2. Se aconseja la adición de 1-1,5 l de 50% de TFA en un momento y usando 1 l de la solución de péptido para medir el pH de la solución con papel de pH (ver video).
   2. Centrifugar la muestra acidificada a 16.000 xg durante 5 min a TA. Recoger el sobrenadante en un tubo de baja retención limpio. En este punto, la solución de péptido se puede almacenar a -20 ° C.
6. Desalación
   Nota: que este último paso se realiza normalmente en una instalación de la espectrometría de masas en función de sus propios métodos preferidos.
   1. Antes del análisis de proteómica, desalar las muestras y los péptidos eluidos con recién preparada acetonitrilo 60%, ácido trifluoroacético al 0,1%, seguido de concentración en un concentrador de vacío. Resuspender los péptidos en recién preparada 3% acetonitrIle, 0,1% de ácido trifluoroacético ^8.
      NOTA: que después de la desalación, la concentración de la solución de péptido puede ser medido por espectrofotometría (ver sección resultados esperados).
   2. Ahora analizar la muestra por espectrometría de masas, de nuevo de acuerdo con los procedimientos óptimos de las instalaciones de espectrometría de masas.
      NOTA: Animamos a los investigadores interesados ​​en la caracterización de la composición de ECM utilizando la espectrometría de masas para referirse a las otras publicaciones ^8-10 y sitios Web que proporcionan una explicación más detallada, incluyendo parámetros de LC-MS / MS, búsqueda de datos de espectrometría de masas para el análisis de la identificación de proteínas y datos utilizando el silico matrisome herramienta de anotación en hemos desarrollado ^8.

Resultados

Control de calidad del procedimiento descelularización

La eficiencia de la descelularización puede ser monitorizado mediante el análisis del contenido de proteína de cada fracción por Western blot. Tabla 2 enumera las proteínas de valor diagnóstico para evaluar la calidad del procedimiento de descelularización. La Figura 2A muestra la extracción eficiente en las fracciones intermedias de citosólica (GAPDH ), nucleares (histonas), la membrana (integrina β1) y del citoesqueleto (actina) las proteínas, mientras que no hay proteínas ECM (colágeno I) se detectaron en estas fracciones (Figura 2). A su vez, el sedimento final se enriquece para proteínas ECM y en gran medida agotado de proteínas intracelulares (Figura 2A). Figura 2B presenta el agotamiento de proteína intracelular satisfactoria (no se detecta ninguna de las histonas en la fracción rica en ECM), aunque, actina todavía se puede detectar en la fracción ECM-rico y el agotamiento de colágeno I monomérico- Peso molecular aparente ~ 110 kDa, presuntamente correspondiente al colágeno sin montar I - se puede observar en la fracción CS.

También supervisamos rutinariamente proteínas ECM adicionales, tales como fibronectina y laminina, aunque, en algunos tejidos estos componentes pueden ser parcialmente solubilizados en fracciones ^8-10 anteriores. Por ejemplo, la fibronectina también se produce como fibronectina plasmática soluble que no está incorporado en el ECM. La perfusión del tejido antes de la extracción reduce la concentración de fibronectina plasmática, pero no siempre elimina. En algunos tejidos, lamininas se encuentran débilmente asociadas con la superficie celular o la ECM y el extracto en fracciones intermedias. Si esto ocurre, puede abordarse mediante la alteración de las condiciones de extracción (véase la discusión).

Tenga en cuenta que el enriquecimiento de las proteínas ECM y el agotamiento concomitante de componentes intracelulares se basa en la solubilidad relativa de las proteínas en los diferentes tampones. Thes difiere entre diferentes tejidos - en algunos casos, las histonas y la actina se extraen más fácilmente que en otros. También observamos que, aunque se espera que las histonas que ser extraído de la fracción N (Figura 2B), que a menudo se observa un agotamiento más completo de las histonas en la M o fracción CS (Figura 2 A y B).

Concentración de péptido indicativo esperado

La concentración de la solución de péptido obtenida después de la digestión, la acidificación y la desalación se puede medir por espectrofotometría midiendo la absorbancia de la solución de péptido utilizando la longitud de onda de 280 nm correspondiente al triptófano, tirosina, o el uso de la longitud de onda de 205 nm correspondiente a la absorbancia del péptido bonos.

Se midió la concentración de las soluciones de péptidos obtenidos a partir de la descelularización de tres muestras de pulmones murinos (82 mg, 100 mg y 100 mg, respectivamente) preparoja en paralelo y obtuvo de cada uno: 424 ng / l, 450 ng / l, y 580 ng / l de péptidos respectivamente.

Identificación de péptidos ECM por espectrometría de masas

Análisis de espectrometría de masa de la composición de las muestras de proteínas ECM enriquecido, preparado como se describe aquí, mostró que> 70% de la intensidad de la señal corresponde a ECM y proteínas ECM asociada a ^8-10.

Tabla 1. Volumen de reactivos de kit de extracción para compartimental decellularize 100 mg (peso húmedo) de tejido o tumor. Esta tabla muestra la composición y el volumen de cada tampón utilizado para llevar a cabo la descelularización de 100 mg de tejido o tumor. Un cóctel de inhibidores de la proteasa se ​​proporciona como una solución 50x y necesita ser agregado a cada búfer ^2.

Reactivos de Kit Compartimiento proteína Extracción	El volumen de 100 mg de tejido	Composición (basado en Millipore ficha técnica gato # 2145 1)
Buffer C	500 l	HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, EDT 4, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio 5
Buffer W	400 l	HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio
Buffer N	150 l x 2	HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, glicerol, ortovanadato de sodio
Buffer W	400 l	HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio
Buffer M	100 l	HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, desoxicolato de sodio (DOC) 6, NP-40 6 , Ortovanadato de sodio
Buffer CS	200 l	TUBOS (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sacarosa, dodecil sulfato de sodio (SDS) 7, ortovanadato de sodio
Buffer C	150 l	HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio
1x PBS	500 l / lavado	-

Notas:
¹ Por razones de propiedad, que no pudieron obtener la composición exacta de los buffers del fabricante del kit, pero incluimos aquí algunas notas basadas en nuestra propia experiencia utilizando tampones caseras para llevar a cabo extracciones similares.
² inhibidor de la proteasa: es aconsejable incluir una variedad de inhibidores contra la cisteína, serina y treonina peptidasas, esterasas de serina, metaloproteinasas de cationes divalentes dependiente etc.Existen muchos cócteles inhibidores de proteasa disponibles comercialmente.
³ pH por encima de 7,0 es un inhibidor eficaz de las proteasas lisosómicas.
⁴ EDTA (generalmente utilizado en 2 mM) es un inhibidor eficaz de proteasas dependiente de cationes divalentes.
⁵ ortovanadato de sodio es un inhibidor de la fosfatasa. Una concentración típica eficaz sería 0,5-5 mM.
⁶ NP40 al 0,1% -0,5% es suficiente para solubilizar los lípidos de membrana más. La combinación de NP40 y DOC - utiliza a menudo en concentraciones iguales (por ejemplo, 0,5% de cada uno) - se utiliza a menudo como una extracción más estrictas que aún deja muchas interacciones proteína-proteína intacta.
⁷ SDS es un detergente iónico más riguroso (CMC 0,1%). También se puede utilizar en combinación con los otros dos detergentes SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% como tampón rigurosidad intermedia.

Tabla 2. proteínas de diagnóstico asupervisar la calidad del procedimiento de descelularización. Esta tabla enumera ejemplos de proteínas que son características de cada compartimento subcelular (citosol, núcleo, membrana plasmática, citoesqueleto y ECM) que se puede utilizar para controlar la calidad del procedimiento de descelularización y la eficiencia de la ECM-enriquecimiento.

Compartimiento intracelular	Las proteínas de diagnóstico
Proteínas citosólicas	Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
Proteínas nucleares	Las histonas, laminas, nucleoporin
Las proteínas de membrana	Las integrinas, receptor de transferrina
Proteínas del citoesqueleto	Actina, tubulina, vimentina
Proteínas ECM membrana basal	El colágeno IV, nidogens, lamininas
Proteínas ECM intersticiales (intersticiales)	El colágeno I, colágeno III, colágeno VI, fibronectina

Por recomendación sobre anticuerpos, vea nuestras publicaciones ^8-10.

Tabla 3. Volumen de reactivos para digerir muestras ECM enriquecido en péptidos. Esta tabla muestra los reactivos utilizados para volver a suspender las muestras de proteínas ECM enriquecido y reducir, alquilato, deglycosylate y digerir las proteínas en péptidos muestras antes del análisis de espectrometría de masas.

Reactivos	Preparación	Final de Concentración / Monto de pellets de 1 mm de espesor (~ 5-10 mg de peso seco)	El volumen de pellets de 1 mm de espesor (~ 5-10 mg de peso seco)
Bicarbonato de amonio (NH 4 HCO 3)	Solución 100 mM en agua grado HPLC	-	-
Urea	Solución 8 M en bicarbonato de amonio 100 mM	8 M	50 l
Ditiotreitol	Reconstituir con agua grado HPLC a 500 mM	10 mM	1 l
Yodoacetamida	Reconstituir con agua grado HPLC a 500 mM	25 mM	2,5 l
Péptido N -Glycosidase F (PNGasaF)	Solución comercial a 500 U / l	1000 U	2 l
Endoproteinasa LysC, grado espectrometría de masas	Reconstituir con agua grado HPLC a 0,5 mg / l	1 g	2 l
Tripsina, la masa de grado espectrometría (ronda 1)	Solución comercial a 0,5 mg / l	3 g	6 l
Tripsina, la masa de grado espectrometría (ronda 2)	Solución comercial a 0,5 mg / l	1,5 g	3 l
Ácido trifluoro-acético (TFA)	Solución al 50% en agua de grado HPLC	-	2.5 l
El acetonitrilo (elución)	Solución al 60% con 0,1% de TFA en agua de grado HPLC	-	500 l
Acetonitrilo (reconstitución)	Solución de 3% con 0,1% de TFA en agua de grado HPLC	-	100 l

Figura 1. Esquema del procedimiento experimental. Esquema de flujo de trabajo de la protocol a decellularize tejidos (Sección 1), el control de la calidad de la descelularización y evaluar el enriquecimiento de ECM (Sección 2) y digerir muestras de proteínas ECM enriquecido en péptidos antes de análisis de espectrometría de masas (Sección 3).

Figura 2. Control de calidad del procedimiento de descelularización por Western blot Western blots se realizaron en pulmón murino (A) y de xenoinjerto de carcinoma mamario humano (B) muestras utilizando los siguientes anticuerpos:. Conejo anti-actina (clon 14-1) y anti conejo -β1 integrina anticuerpos producidos en el laboratorio; conejo anti-colágeno I, ratón anti-GAPDH y anticuerpos de conejo anti-pan-histonas eran de Millipore. Después de la incubación del anticuerpo primario, las membranas se lavaron y se incubaron en presencia de HRP-conjugado de cabra anti-conejo o de cabra anti-mouSE anticuerpo secundario de Jackson ImmunoResearch Laboratory. Finalmente, las membranas se lavaron y se incubaron en Western relámpago ™ Reactivo de Quimioluminiscencia (PerkinElmer LAS). * Indica contaminación histona residual mínima de la fracción ECM-ricos. ** Indica el agotamiento parcial de monómero (presuntamente sin montar) colágeno I en la fracción de CS. *** Indica contaminación actina residual de la fracción ECM-rico. El frotis detectado con el anticuerpo anti-colágeno representa diferentes niveles de modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, reticulación, glicosilación).

Discusión

Modificaciones

Aunque hemos empleado este procedimiento exacto para enriquecer el ECM de diez tejidos y tipos de tumores ^8-10, modificaciones del protocolo debe ser considerada en los siguientes casos:

1) Detección de proteínas ECM en las fracciones intermedias.

Matrices extracelulares de diferentes tejidos o tipos de tumores pueden diferir en su capacidad de extracción / insolubilidad, como se discutió anteriormente para fibronectina y laminina. Por ejemplo, se piensa que la ECM de los tejidos fibróticos o tejidos de remodelación da la vuelta muy dinámicamente y por lo tanto se podría observar una mayor proporción de proteínas ECM en aquellos tejidos a ser más fácilmente extractable ^12. Dependiendo de la fracción en la que se detectan las proteínas ECM, se sugiere reducir el tiempo de incubación de la etapa de provocar la extracción de proteínas ECM u omitir ese paso.

2) Detección de una proporción significativa de los componentes intracelulares en el sedimento ECM-enriquecido. En algunos tejidos o tipos de tumores de las células de relación: ECM es (tumores por ejemplo, hígado, bazo, no desmoplásicos) particularmente altas. En ese caso, una contaminación significativa de la fracción de ECM-enriquecido con proteínas intracelulares (proteínas del citoesqueleto en particular y / o histonas) se puede observar. Para agotar las proteínas intracelulares de manera eficiente, le sugerimos que se repiten dos veces la incubación en Tampón M y / o Buffer CS (ambos detergentes que contienen, esto generalmente agota abundantes proteínas intracelulares). Otra alternativa sería utilizar tampones alternativos con concentraciones de detergente mayores, con la salvedad de que esto puede conducir al agotamiento de las proteínas ECM relativamente más solubles también (véase el párrafo siguiente).

3) alternativa al uso de un kit comercial.

No hemos podido, por razones de propiedad, para obtener la composición precisa de los buffers from el proveedor del kit de extracción de proteínas compartimental. Sin embargo, hemos incluido en el Cuadro 1 notas basadas en nuestra propia experiencia utilizando tampones caseros con detergente definido (NP-40, desoxicolato de sodio y SDS) concentraciones de realizar extracciones similares. Un estudio reciente también destacó la importancia de que el pH de los tampones Descelularización retener proteínas ECM ^13.

Limitaciones de la técnica

El método que aquí se presenta se basa en el hecho de que las proteínas ECM son intrínsecamente más insoluble que la mayoría de las proteínas intracelulares. Sin embargo, el método descrito aquí sin duda descelularización extrae los componentes solubles presentes dentro de la ECM, tales como algunos factores de crecimiento o enzimas ECM-remodelación. Aunque las proteínas ECM-asociado fuertemente unidos a las proteínas ECM fueron detectados por la proteómica en las muestras preparadas como se describe, este método puede ser demasiado estrictas al perfil completamente la composición de matrisome asociadaproteínas.

Importancia de la técnica con respecto a otros métodos

La ventaja del método presentado aquí sobre otros métodos es que puede ser adaptado a la naturaleza de la ECM de interés: pasos intermedios se puede omitir o repetir para evitar la pérdida de proteínas ECM o aumentar el agotamiento de las proteínas contaminantes intracelulares respectivamente. Este método también sólo utiliza cantidades mínimas de detergentes que se enjuaga para evitar su interferencia con la preparación de péptidos posterior y espectrometría de masas. Finalmente, el método descrito aquí para digerir preparaciones de proteínas ECM-rico en péptidos tiene también la ventaja de no requerir proteínas sean solubles y pueden llevarse a cabo en fracciones de ECM enriquecida "en bruto".

Descelularización métodos alternativos que utilizan agentes caotrópicos (tales como hidrocloruro de guanidina) para estudiar la composición del ECM por espectrometría de masas han been reportado en la literatura (revisado en ¹⁴⁾ y se han utilizado en combinación con espectrometría de masas para caracterizar la composición ECM del cartílago ^15,16, corazón ^17, glándula mamaria ¹⁸ y vascular ¹⁹ y ²⁰ membranas basales glomerulares.

Recomendaciones

Métodos que emplean descelularización tripsina para digerir a las células no deben utilizarse si ECMs se enriquecen para la proteómica posteriores análisis, como tripsinización se traducirá en la digestión parcial ECM y la pérdida de proteínas ECM y péptidos. Del mismo modo, si la digestión con colagenasa se fuera a usar para ayudar a la interrupción del tejido, que tendría que ser supervisados ​​cuidadosamente, ya que causa la digestión ECM y la pérdida de proteínas ECM y péptidos.

Dentro de la solución frente a la digestión en gel? Proteínas ECM son reticulado y altamente insoluble y, incluso cuando se resuspendieron en tampón de 3x Laemmli (que contiene 6% de SDS) y 100 mM de DTT, po separadoorly en geles de SDS. Así, en la digestión-gel no es un método preferido.

Las futuras aplicaciones

Vale la pena señalar que, si bien no se discute aquí, la composición de cada una de las fracciones intermedias recogidos durante la descelularización podría también ser analizado por espectrometría de masas. Esto puede ser particularmente valioso en el estudio de muestras muy pequeñas (es decir, biopsias humanas) o cuando se desea información sobre otras fracciones celulares.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads	Next Advance	BB24-AU
Compartmental Extraction kit	Millipore	2145
Deoxyribonuclease I	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A	Qiagen	19101
HPLC-grade water	Sigma-Aldrich	34877
Urea	Sigma-Aldrich	U4883
Dithiotreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	9830
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	A3221
Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF)	New England Biolabs	P0704S
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade	Wako	125-05061
Trypsin, mass spectrometry-grade	Promega	V5111
Trifluoro-acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6508
Acetonitrile, mass spectrometry-grade	Thermo Scientific	51101
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge	Waters	186000383