Enriquecimento de Proteínas da Matriz Extracelular a partir de tecidos e digestão em péptidos para Análise de Espectrometria de Massa

Resumo

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Resumo

A matriz extracelular (ECM) é uma malha complexo de proteínas reticuladas que fornece sinais biofísicas e bioquímicas que são importantes reguladores da proliferação celular, sobrevivência, migração, etc. O ECM desempenha papéis importantes no desenvolvimento e em diversas patologias incluindo cardio-vascular e doenças músculo-esqueléticas, fibrose e câncer. Assim, a caracterização da composição de ECMs de tecidos normais e doentes pode levar à identificação de novos marcadores de prognóstico e de diagnóstico e terapêuticas potenciais alvos. No entanto, a própria natureza das proteínas da MEC (grandes em tamanho, com ligações cruzadas e ligados covalentemente, fortemente glicosilada) tornou análises bioquímicas de ECMs desafiador. Para superar este desafio, desenvolvemos um método para enriquecer ECMs a partir de tecidos e tumores frescos ou congelados que tira proveito da insolubilidade das proteínas da MEC. Nós descrevemos aqui em pormenor o procedimento decellularization que consiste em i seqüencialncubations em tampões de diferente pH e concentrações de sal e de detergente e que resulta em 1) a extracção de intracelular (citosólica, nuclear, membrana do citoesqueleto e) proteínas e 2) o enriquecimento de proteínas da MEC. Em seguida, descrevem como deglycosylate e digerir preparações de proteína enriquecido com ECM em peptídeos para posterior análise por espectrometria de massa.

Introdução

A matriz extracelular (ECM) é uma malha complexa de proteínas reticulado e glicosiladas que fornece suporte de arquitetura e de ancoragem para as células e define, em parte, as propriedades biomecânicas de tecidos ^1,2. Proteínas ECM também um sinal para as células, quer directamente através dos seus receptores (por exemplo, integrinas, sindecans, etc.) ou através da modulação do factor de crescimento de sinalização ^3. A ECM fornece, assim, sinais biofísicas e bioquímicas que são importantes reguladores de processos celulares tais como a proliferação, a sobrevivência, a polarização, diferenciação, migração, etc.

O ECM desempenha papel fundamental na fisiologia, desenvolvimento e envelhecimento ^4. Além disso, várias patologias, como doenças cardio-vascular, fibrose, doenças músculo-esqueléticas, cânceres, são causadas por, ou resultar em alterações de ECM. Além disso, o ECM contribui para a manutenção de nichos de células-tronco e a identificação de moléculas de ECM chave thno apoio stemness terá aplicação directa em engenharia de tecidos e medicina regenerativa ^5. No entanto, apesar da sua importância, o ECM manteve-se, até recentemente, pouco explorado ^6.

Em silico análise revelou que o matrisome, definido como o conjunto de ECM e proteínas associadas à ECM, compreende os produtos de várias centenas de genes nos genomas tanto a humanos e de ratinho ^1,7,8. No entanto, a insolubilidade das proteínas da MEC tem dificultado a caracterização sistemática da composição in vivo de matrizes extracelulares de espécimes normais e patológicas. Nós recentemente demonstrado que esta insolubilidade poderia ser transformado em vantagem e ser usado para enriquecer proteínas ECM ^8-10. Nós e outros ainda demonstrado que a espectrometria de massa foi um método de escolha para caracterizar a composição de ECMs ^{8-10, 13.}

NósDescrevemos aqui um procedimento decellularization que consiste em incubações sequenciais em buffers de diferentes pH e concentrações de sal e detergentes. Este procedimento resulta na extracção (ou depleção) de proteínas citosólicas, nucleares, da membrana e do citoesqueleto e o enriquecimento de proteínas da MEC. Em seguida, descrevemos como digerir preparações de proteína enriquecido com ECM em peptídeos para posterior análise por espectrometria de massa.

Utilizando os procedimentos detalhado e ilustrado aqui, temos enriquecido com sucesso e caracteriza-se por espectrometria de massa das matrizes extracelulares de dez diferentes tecidos e tipos de tumores: pulmão normal murino ^8, humanos e de cólon murino ^8,9, fígado humano ^9, tumores colorretais humanos e derivados metástases hepáticas ^9, xenoenxertos de melanoma ^8, xenotransplantes tumorais mamárias ^10, ilhotas pancreáticas murinas e insulinomas murino (Naba et al., não publicado). Comparação das diferentes matrisomES revelou assinaturas ECM para tecidos e específicos de tumores que podem ainda ser utilizados como biomarcadores potenciais de diagnóstico ou de prognóstico.

Acreditamos que este procedimento pode ser aplicado a outros espécimes sem ou relativamente pequenas modificações.

Protocolo

NOTA: O procedimento pode ser realizado com tecidos congelados frescos ou Flash. Recomenda-se perfundir os tecidos altamente vascularizados com PBS no momento da dissecção para eliminar as células vermelhas do sangue e proteínas do plasma. Nós não recomendamos a realização do procedimento em tecidos fixados como fixação (isto é, reticulação química) interfere com decellularization e também pode comprometer significativamente posterior análise por espectrometria de massa. Para todo o procedimento, recomendamos o uso de tubos de baixa retenção e pontas de pipeta para maximizar a recuperação de proteínas e peptídeos.

1. Decelularização de tecidos ou tumores

NOTA: Antes de começar, preparar os reagentes e adicionar inibidores de protease (fornecidos com o estojo de extracção de proteína) do compartimento para o volume desejado de cada tampão. Todos os tampões e as amostras devem ser mantidas em gelo durante a duração da experiência, excepto o tampão de CS que deve ser mantida a temperatura ambiente para evitar a precipitação de SDSitation.
NOTA: O protocolo utiliza uma série de incubação em tampões de pH diferente e contendo diferentes quantidades de sais e detergentes sequencialmente proteínas intracelulares e de extracto para enriquecer proteínas ECM insolúveis (Figura 1, Tabela 1; ver também a discussão de alternativas para a utilização do kit comercial detalhado aqui). Os volumes de reagentes indicados abaixo são para 100 mg de tecidos ou tumores (ver Tabela 1) e ter de ser ajustada de forma apropriada.

1. Homogeneizar 100 mg de tecido em 500 ul de tampão C contendo inibidores da protease usando um homogeneizador de tecidos até que o tecido está completamente interrompido e uma suspensão homogénea.
   NOTA: Adicionar desoxirribonuclease I (concentração final: 200 ng / ml, reconstituído de acordo com as instruções do fabricante) e ribonuclease A (concentração final: 20 ug / ml, reconstituído de acordo com as instruções do fabricante) paraTampão N.
2. Extracção sequencial de proteínas solúveis intracelulares
   1. Extracção de proteínas citosólicas. Incubar o homogenato num rotor tubo durante 20 minutos a 4 ° C. Guardar a uma pequena aliquota (10 uL a 20 ul) do homogenato para subsequente análise de Western blot (ver secção resultados esperados e Figura 2).
   2. Centrifuga-se o homogenato a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante num tubo limpo, este irá constituir a fracção citosólica (C) da análise de mancha ocidental. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C.
   3. Para lavagem, ressuspender o sedimento em 400 ul de tampão W contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 20 minutos a 4 ° C. Centrifuga-se o homogenato a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
   4. Para extrair, proteínas nucleares, ressuspender o sedimento em 150 ul de tampão contendo inibidores de proteases de N, deoxyribonucleaSE I e ribonuclease A e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 30 minutos a 4 ° C.
   5. Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante num tubo limpo. Repetir esta etapa uma vez: após centrifugação da amostra para o segundo tempo, adiciona-se o sobrenadante ao sobrenadante anterior: isto constitui o (N) a fracção de análise Western blot nuclear. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C. Em seguida, execute as lavagens como por etapa 1.2.3.
   6. Para extrair as proteínas de membrana, ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão H contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 30 minutos a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C
   7. Recolhe-se o sobrenadante num tubo limpo: este irá constituir a fracção de membrana (M) da análise de mancha ocidental. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C.
   8. Para extrair proteínas do citoesqueleto, ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão de CS contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num tubo de rotador durante 30 minutos à TA.
      Note-se que o pelete não se dissolvem totalmente. Sugerimos perturbar o pellet pipetando cima e para baixo até que observar perturbação do sedimento.
   9. Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Recolhe-se o sobrenadante num tubo limpo. Nota neste ponto uma redução ainda mais acentuada no tamanho do pelete (ver vídeo).
   10. Ressuspender o sedimento em 150 ul de tampão C contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 20 minutos a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   11. Recolhe-se o sobrenadante e adicionar-se ao sobrenadante anterior: isto irá constituir a fracção do citoesqueleto (CS) da análise de mancha ocidental. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C.
   12. Realizar lavagens adicionais. Ressuspender o sedimento em 500 ul de PBS contendo inibidores de protease deND incubar a amostra num rotor tubo durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 16000 xg durante 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Repita este passo três vezes.
       NOTA: Todos os vestígios de detergentes precisam ser removidos por extensos lavagens antes da digestão das proteínas em peptídeos (ver Secção 3). Neste ponto, o sedimento enriquecido em ECM podem ser congelados rapidamente e manteve-se a -80 ° C. Note-se que o tamanho do grânulo irá depender da quantidade de proteínas insolúveis (ECM) no material de partida e da eficiência da descelularização.

2. Monitorização da Qualidade do Decelularização / Enriquecimento ECM por SDS-PAGE e Western Blot

1. Misturar 10-20 ul alíquota do extracto de tecido total e aliquotas de 50 ul de fracções intermediárias com tampão Laemmli contendo DTT 100 mM. Ressuspender o, fração insolúvel enriquecida com ECM em 3x tampão Laemmli contendo DTT 100 mM.
   Nota: ele concentrações elevadasde DTT e SDS auxiliar na solubilização de proteínas de ECM que são relativamente insolúveis.
2. Separaram-se as proteínas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose.
3. Realizar imuno-manchas utilizando anticorpos para monitorizar proteínas representativa de cada uma das fracções citosólicas, nucleares, de membrana, do citoesqueleto e ECM (ver a secção de resultados representativos, Tabela 2 e Figura 2).

3. Na solução de digestão de proteínas a péptidos para Análise de Espectrometria de Massa

NOTA: O sedimento obtido após o procedimento descelularização e remoção do SDS é altamente enriquecidos em proteínas de ECM insolúvel para posterior análise por espectrometria de massa destas proteínas têm de ser digeridas em péptidos. Note-se que, como consequência da ECM insolubilidade da proteína, não é possível, nesta etapa para medir a concentração de proteína da amostra. Nós fornecemos assim volumes de reagentes para digerir o ECM-enriamostras CHEd em péptidos com base no tamanho (mm) ou o peso seco do sedimento enriquecido em ECM (Tabela 3). As soluções de bicarbonato de amónio, ureia, DTT, iodoacetamida e ácido trifluoroacético todos precisam ser preparados na hora.

1. Ressuspender a amostra enriquecida com ECM através da adição do volume apropriado de 8 M de ureia ao sedimento enriquecido em ECM e adicionar DTT numa concentração final de 10 mM (ver Tabela 3). Incubar, com agitação contínua a 1400 rpm durante 2 horas a 37 ° C.
   NOTA: neste momento as proteínas de ECM não será totalmente dissolvido e os visivelmente grandes partículas de proteínas não deve ser descartada por centrifugação ou filtração. A suspensão irá limpar após desglicosilação e digestão (ver vídeo).
2. Alkylation
   1. Preparar a solução iodoacetamida em água de grau HPLC. Arrefece-se a amostra até à temperatura ambiente e adicionar a iodoacetamida a uma concentração final de 25 mM. Para a alquilação completa, o DTT: iodoacetamida proporção deve ser entre 1: 2.5 e 1: 3.
   2. Incubar no escuro durante 30 min à temperatura ambiente.
3. Desglicosila�o:
   Nota: A desglicosilação é necessária para remover as cadeias laterais de hidratos de carbono que interferem com a identificação de péptidos modificados por glicosilação N -ligada.
   1. Dilui-se a 2 M de ureia com 100 mM de bicarbonato de amónio pH 8,0 e adicionar a quantidade apropriada de PNGaseF (ver Tabela 3). Incubar, com agitação contínua a 1400 rpm durante 2 horas a 37 ° C.
4. Digestão
   1. Adicionar Lys-C e incubar com agitação contínua a 1400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. Adicionar tripsina e incubar com agitação contínua a 1400 rpm O / N a 37 ° C.
      NOTA: a suspensão rica em ECM, que começou nebuloso após a reconstituição inicial em ureia 8 parece claro após a digestão O / N (ver vídeo).
   2. Adicionar uma segunda alíquota de tripsina à amostra e incubar com agitação contínua a 1400 rpm, durante mais 2 horas a 37 ° C.
5. Acidificação
   1. Após a conclusão da digestão, inactivar a tripsina por acidificação da amostra preparada de fresco com ácido trif luoro-acético a 50% (TFA). A amostra deve atingir pH <2. Sugerimos adicionando 1-1,5 uL de TFA a 50% de cada vez e usando 1 ml de solução de péptido para medir o pH da solução utilizando papel de pH (ver vídeo).
   2. Centrifugar a amostra acidificada a 16000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante num tubo de baixa retenção limpo. Neste ponto, a solução de péptido pode ser armazenado a -20 ° C.
6. Dessalinização
   Nota: que esta última etapa é geralmente conduzida a uma instalação de espectrometria de massa de acordo com seus próprios métodos preferenciais.
   1. Antes da análise proteómica, dessalinizar as amostras e péptidos eluidos com recentemente preparada de 60% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético a 0,1%, seguido por concentração num concentrador de vácuo. Ressuspender os péptidos em recém-preparado 3% acetonitrlie, 0,1% de ácido trifluoroacético ^8.
      NOTA: que, após dessalinização, a concentração da solução de péptido pode ser medida por espectrofotometria (ver secção resultados esperados).
   2. Agora, analisar a amostra por espectrometria de massa, mais uma vez de acordo com os procedimentos óptimos de a instalação de espectrometria de massa.
      NOTA: Nós encorajamos os pesquisadores interessados ​​em caracterizar a composição de ECMs utilizando espectrometria de massa para se referir às nossas outras publicações ^8-10 e sites que fornecem explicação mais detalhada, incluindo os parâmetros de LC-MS / MS, pesquisa de dados de espectrometria de massa para identificação de proteínas e análise de dados utilizando o in silico matrisome ferramenta de anotação nós desenvolvemos ^8.

Resultados

O controle de qualidade do processo de descelularização

A eficiência da descelularização pode ser monitorizada por análise do teor em proteína de cada fracção por western blot. A Tabela 2 lista as proteínas de valor de diagnóstico para avaliar a qualidade do processo de descelularização. A Figura 2A mostra a extracção eficiente nas fracções intermédias de citosólica (GAPDH ), (histonas nucleares), a membrana (β1 integrina) e do citoesqueleto () proteínas actina, ao passo que não há proteínas de ECM (colagénio I) é detectada nestas fracções (Figura 2). Por sua vez, o pelete final é enriquecida em proteínas da MEC e largamente empobrecido de proteínas intracelulares (Figura 2A). A Figura 2B apresenta a depleção de proteínas intracelulares satisfatório (nenhum histona é detectado na fracção rica em ECM), embora, a actina pode ainda ser detectado na a fracção e do esgotamento de colágeno monomérica I-ricos ECM- Peso molecular aparente de ~ 110 kDa, presumivelmente correspondentes ao colagénio desmontado I - pode ser observada na fracção CS.

Também rotineiramente monitorar proteínas de ECM adicionais, tais como a fibronectina e laminina, embora, em alguns tecidos, estes componentes podem ser parcialmente solubilizado em fracções anteriores ^8-10. Por exemplo, a fibronectina também ocorre como fibronectina do plasma solúvel que não é incorporado no ECM. A perfusão do tecido antes da extracção reduz a concentração de fibronectina do plasma, mas não sempre eliminá-lo. Em alguns tecidos, lamininas são encontrados em certa medida associada com a superfície da célula ou a ECM e extracto nas fracções intermédias. Se isto acontece ele pode ser abordada por alteração das condições de extracção (ver discussão).

Note-se que o enriquecimento de proteínas da MEC e a depleção concomitante de componentes intracelulares baseia-se na solubilidade relativa de proteínas em diferentes tampões. ºé diferente entre os diferentes tecidos - em alguns casos, as histonas e actina são mais facilmente extraída do que em outros. Note também que, embora histonas são esperados para ser extraída na fracção N (Figura 2B), que muitas vezes observar uma depleção mais completa de histonas no H ou fracção CS (Figura 2A e B).

Indicativa da concentração de péptido esperado

A concentração da solução de péptido obtido após a digestão, a acidificação e dessalinização pode ser medida por espectrofotometria quer por medição da absorvância da solução de péptido usando o comprimento de onda de 280 nm, correspondendo a triptofano, tirosina, ou usando o comprimento de onda de 205 nm, correspondendo a absorvância do peptídeo obrigações.

Medimos a concentração das soluções de péptidos obtidos a partir da descelularização de três amostras de pulmões murinos (82 mg, 100 mg e 100 mg, respectivamente) Prepavermelho em paralelo e obtido a partir de cada um: 424 ng / mL, 450 ng / mL, e 580 ng / uL de péptidos, respectivamente.

Identificação de péptidos por espectrometria de massa de ECM

A análise por espectrometria de massa da composição de amostras de proteína enriquecido com ECM, preparados como descrito aqui, mostraram que> 70% da intensidade de sinal corresponde à ECM e proteínas associadas à ECM ^8-10.

Tabela 1. O volume de reagentes de kit de extração compartimental para decellularize 100 mg (peso húmido) de tecido ou de tumor. Esta tabela lista a composição e o volume de cada tampão usado para realizar a descelularização de 100 mg de tecido ou tumor. Um cocktail de inibidores de protease é fornecida como uma solução 50x e deve ser adicionado a cada tampão ^2.

Reagentes de Kit Compartimento de extração de proteínas	Volume de 100 mg de tecido	Composição (com base na folha de dados Millipore Cat # 2145 1)
Tampão C	500 ul	HEPES (pH 7,9 3), MgCl 2, KCl, EDT 4, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio 5
Tampão W	400 ul	HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio
Tampão N	150 mL x 2	HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, Glicerol, ortovanadato de sódio
Tampão W	400 ul	HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio
M de tampão	100 ul	HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, desoxicolato de sódio (DOC) 6, NP-40 6 , Ortovanadato de sódio
Tampão CS	200 ul	PIPES (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sacarose, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 7, ortovanadato de sódio
Tampão C	150 ul	HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio
1x PBS	500 l / lavagem	-

Notas:
¹ Por motivos de propriedade, não fomos capazes de obter a composição precisa dos buffers do fornecedor do kit, mas nós incluímos aqui algumas notas com base em nossa própria experiência usando buffers caseiros para realizar extrações similares.
² de inibidores da protease: é aconselhável incluir uma variedade de inibidores contra cisteína, serina e treonina peptidases, esterases de serina, metaloproteinases dependente de catiões divalentes, etc.Existem muitos cocktail de inibidor de protease disponíveis comercialmente.
³ o pH acima de 7,0 é um inibidor eficaz de proteases lisossómicas.
⁴ EDTA (geralmente utilizada em 2 mM) é um inibidor eficaz de proteases dependentes de catiões divalentes.
⁵ ortovanadato de sódio é um inibidor de fosfatase. Uma concentração típica eficaz seria 0,5-5 mM.
⁶ NP40 a 0,1% -0,5% é suficiente para solubilizar mais lípidos de membrana. A combinação de NP40 e DOC - muitas vezes utilizado em concentrações iguais (por exemplo, 0,5% de cada) - é frequentemente utilizado como uma extracção mais rigoroso que deixa ainda muitas interacções proteína-proteína intacta.
⁷ SDS é um detergente iónico mais rigorosas (CMC 0,1%). Ele também pode ser usado em combinação com os outros dois detergentes SDS / NP40 / DOC a 0,1 / 0,5 / 0,5% como tampão de restringência intermédia.

Tabela 2. proteínas de diagnóstico paramonitorizar a qualidade do processo de descelularização. Esta tabela lista exemplos de proteínas que são características de cada compartimento subcelular (citosol, núcleo, membrana de plasma, citoesqueleto e ECM) que pode ser utilizado para monitorizar a qualidade do processo de descelularização e a eficiência do ECM-enriquecimento.

Intracelular Compartimento	Proteínas de diagnóstico
Proteínas citosólicas	Desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH)
As proteínas nucleares	Histonas, laminas, Nucleoporin
As proteínas da membrana	As integrinas, Receptor de Transferrina
Proteínas do citoesqueleto	Actina, tubulina, Vimentina
ECM proteínas da membrana basal	Colágeno IV, Nidogens, lamininas
ECM proteínas intersticiais (intersticiais)	Colágeno I, colágeno III, colágeno VI, Fibronectina

Para recomendação sobre anticorpos, consulte nossas publicações ^8-10.

Tabela 3. Volume de reagentes para digerir as amostras enriquecidas com ECM em péptidos. Esta tabela lista os reagentes utilizados para voltar a suspender amostras de proteína enriquecido em ECM e reduzir, alquilato, deglycosylate e digerir amostras de proteínas em peptídeos antes da análise de espectrometria de massa.

Reagentes	Preparação	Concentração / Valor final para pellet um milímetro de espessura (~ 5-10 mg de peso seco)	Volume de pellet 1 milímetro de espessura (~ 5-10 mg de peso seco)
Bicarbonato de amónio (NH 4 HCO 3)	Solução 100 mM em água de grau HPLC	-	-
Uréia	8 M de solução em 100 mM de bicarbonato de amónio	8 M	50 ul
Ditiotreitol	Reconstituir em água de grau HPLC em 500 mM	10 mM	1 ul
Iodoacetamida	Reconstituir em água de grau HPLC em 500 mM	25 mM	2,5 ul
P�tido N -Glycosidase F (PNGaseF)	Solução comercial a 500 U / mL	1000 U	2 ul
A endoproteinase LysC, espectrometria de massa de grau	Reconstituir em água HPLC-grade a 0,5 mg / mL	1 ug	2 ul
Tripsina, espectrometria de massa de grau (1ª rodada)	Solução comercial a 0,5 mg / mL	3 ug	6 ul
Tripsina, espectrometria de massa-grade (Fase 2)	Solução comercial a 0,5 mg / mL	1,5 ug	3 ul
Ácido trifluoro-acético (TFA)	Solução a 50% em água de grau HPLC	-	2-5 ul
Acetonitrilo (eluição)	Solução a 60% com 0,1% de TFA em água de grau HPLC	-	500 ul
Acetonitrilo (reconstituição)	Solução de 3% com 0,1% de TFA em água de grau HPLC	-	100 ul

Figura 1. Esquema do procedimento experimental. Esquemático do fluxo de trabalho Protocol para decellularize tecidos (Seção 1), controlar a qualidade da descelularização e avaliar o enriquecimento ECM (Seção 2) e digerir amostras de proteína enriquecido com ECM em peptídeos antes da análise de espectrometria de massa (Seção 3).

Figura 2. controlo de qualidade do procedimento de descelularização por western blot Western blot foram realizadas no pulmão murino (A) e xenoenxerto de carcinoma da mama humano (B) amostras utilizando os seguintes anticorpos:. De coelho anti-actina (clone 14-1) e anti-coelho -β1 integrina anticorpos produzidos no nosso laboratório; de coelho anti-colagénio I, de ratinho anti-GAPDH e anticorpos de coelho anti-pan-histonas era da Millipore. Após incubação do anticorpo primário, as membranas foram lavadas e incubadas na presença de HRP-conjugado de cabra anti-coelho ou de cabra anti-mouse o anticorpo secundário a partir de Jackson ImmunoResearch Laboratory. Finalmente, as membranas foram lavadas e incubadas em Reagente Ocidental relâmpago ™ quimioluminescência (PerkinElmer LAS). * Indica contaminação histona residual mínima da fracção rica em ECM. ** Indica esgotamento parcial de monomérico (presumivelmente desmontado) colágeno I na fração CS. *** Indica contaminação actina residual da fracção rica em ECM. O esfregaço detectado com o anticorpo anti-colagénio representa diferentes níveis de modificações pós-translacionais (por exemplo, ligação cruzada, glicosilação).

Discussão

Modificações

Apesar de termos utilizado esse procedimento exato para enriquecer o ECM a partir de dez tecidos e tipos de tumores ^8-10, modificações do protocolo devem ser consideradas nos seguintes casos:

1) Detecção de proteínas de ECM nas fracções intermédias.

Matrizes extracelulares a partir de diferentes tecidos ou tipos de tumores podem diferir na sua extractabilidade / insolubilidade, como discutido acima para a fibronectina e lamininas. Por exemplo, pensa-se que a ECM de tecidos fibróticos ou tecidos remodelação vira muito dinamicamente e, portanto, pode-se observar uma maior proporção de proteínas de ECM nos tecidos a ser mais facilmente extraível ^12. Dependendo da fracção no qual são detectadas proteínas da MEC, sugerimos a reduzir o tempo de incubação do passo provocando a extracção de proteínas de ECM ou omitindo este passo.

2) Detection de uma proporção significativa de componentes intracelulares no sedimento enriquecido em ECM. Em alguns tecidos ou tipos de tumor As células de relação: ECM é particularmente elevadas (por exemplo, tumores, do fígado, do baço, não desmoplásicas). Nesse caso, uma contaminação significativa da fracção enriquecida em ECM por proteínas intracelulares (em particular, proteínas do citoesqueleto e / ou histonas) podem ser observadas. Para esgotar as proteínas intracelulares de forma eficiente, sugerimos repetindo duas vezes a incubação em tampão H e / ou tampão CS (ambos contendo detergentes, este geralmente esgota abundantes proteínas intracelulares). Outra alternativa seria a utilização de tampões alternativos com concentrações mais elevadas de detergentes, com a ressalva de que isso pode levar ao esgotamento das proteínas da MEC relativamente mais solúveis, bem como (veja o próximo parágrafo).

3) alternativa à utilização de um kit comercial.

Não foi possível, por razões de propriedade, para se obter a composição precisa dos buffers frosou o fornecedor do kit de extração de proteínas compartimental. No entanto, nós incluímos na Tabela 1 notas com base em nossa própria experiência usando buffers caseiros com detergente definido (NP-40, desoxicolato de sódio e SDS), as concentrações para realizar extrações similares. Um estudo recente também destacou a importância do pH de buffers de decelularização para reter proteínas da MEC ^13.

Limitações da técnica

O método aqui apresentado baseia-se no facto de as proteínas de ECM são intrinsecamente mais insolúvel do que a maioria das proteínas intracelulares. No entanto, o método de descelularização descrito aqui certamente extrai os componentes solúveis presentes dentro da ECM, tais como alguns factores de crescimento ou enzimas-remodelação de ECM. Embora proteínas associadas a ECM firmemente ligados a proteínas da MEC foram detectados por proteómica em amostras preparadas como descrito, este método pode ser muito rigorosa ao perfil totalmente a composição de associados-matrisomeproteínas.

Significância da técnica em relação a outros métodos

A vantagem do método apresentado aqui em relação a outros métodos é que ele pode ser adaptado à natureza do ECM de interesse: passos intermédios podem ser omitidos ou repetidos para evitar a perda de proteínas de ECM ou aumentar a depleção de proteínas contaminantes intracelulares respectivamente. Este método também utiliza apenas quantidades mínimas de detergentes que são enxaguados para evitar a sua interferência com a preparação de péptidos subsequente e espectrometria de massa. Finalmente, o método descrito aqui para digerir preparações de proteína rica em ECM em peptídeos tem também a vantagem de não necessitar de proteínas de ser solúvel e pode ser realizado em fracções enriquecidas com ECM "em bruto".

Métodos alternativos de decelularização utilizando agentes caotrópicos (tais como cloridrato de guanidina) para estudar a composição de ECMs por espectrometria de massa têm been relatado na literatura (revisto em ¹⁴⁾ e têm sido utilizados em combinação com espectrometria de massa para caracterizar a composição ECM de cartilagem ^{15,16, 17} coração, glândula mamária ¹⁸ e vascular ¹⁹ e ²⁰ as membranas basais glomerulares.

Recomendações

Descelularização métodos empregando tripsina para digerir as células não deve ser utilizado se ECMs são enriquecidos para proteómica subsequentes análises, como tripsinização resultará na digestão de ECM parcial e perda de proteínas da MEC e péptidos. Da mesma forma, se a digestão de colagenase foram para ser utilizada para auxiliar rompimento do tecido, ele terá de ser monitorizada cuidadosamente, uma vez que faz com que a digestão e perda de proteínas da MEC e péptidos ECM.

Em solução-vs digestão em gel? Proteínas de ECM são reticulados e altamente insolúveis e, mesmo quando ressuspensas em tampão de Laemmli 3x (contendo 6% de SDS) e 100 mM de DTT, po separadoorly em geles de SDS. Assim, a digestão em gel não é um método preferido.

As aplicações futuras

Vale a pena notar que, enquanto não discutido aqui, a composição de cada uma das fracções de intermediário recolhidos durante a descelularização pode também ser analisados ​​por espectrometria de massa. Isto pode ser particularmente útil quando se estuda amostras muito pequenas (isto é, biópsias humanas) ou quando a informação é desejado em outras fracções celulares.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads	Next Advance	BB24-AU
Compartmental Extraction kit	Millipore	2145
Deoxyribonuclease I	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A	Qiagen	19101
HPLC-grade water	Sigma-Aldrich	34877
Urea	Sigma-Aldrich	U4883
Dithiotreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	9830
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	A3221
Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF)	New England Biolabs	P0704S
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade	Wako	125-05061
Trypsin, mass spectrometry-grade	Promega	V5111
Trifluoro-acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6508
Acetonitrile, mass spectrometry-grade	Thermo Scientific	51101
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge	Waters	186000383