Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Resumen

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Resumen

Recién aisladas células endoteliales específicos de tumores (TEC) se pueden usar para explorar los mecanismos moleculares de la angiogénesis tumoral y servir como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos inhibidores de la angiogénesis para el cáncer. Sin embargo, a largo plazo en la expansión in vitro de células endoteliales murinas (CE) es un reto debido a la deriva fenotípica en la cultura (transición-endotelial-mesenquimal) y la contaminación con no comunitario. Esto es especialmente cierto para TEC que se outcompeted fácilmente por co-purificado fibroblastos o células tumorales en cultivo. Aquí, un método de aislamiento de alta fidelidad que se aprovecha de enriquecimiento inmunomagnética junto con la selección de la colonia y la expansión in vitro se describe. Este enfoque genera fracciones CE puros que son totalmente libre de contaminación de las células del estroma o tumorales. También se muestra que el linaje de trazado de Cdh5 ^{cre: / l} reportero ratones ZsGreen ^{l / s,} que se utiliza con el protocolo descrito en este documento, son una valiosa herramienta para verificar celularpureza como las colonias de la CE aislados de estos ratones muestran fluorescencia ZsGreen duradero y brillante en la cultura.

Introducción

Las células endoteliales (CE) son esenciales durante el desarrollo de tumores sólidos. A partir de la iniciación del cambio angiogénico en los tumores latentes a la difusión y la siembra de metástasis en sitios distantes, EC formar los conductos que suministran sangre, oxígeno y nutrientes para sostener el crecimiento del tumor ^1. Como se ha sugerido recientemente, EC también tiene funciones de perfusión independiente y formar un nicho que soporta el crecimiento de células madre de cáncer y otras células del estroma tumoral ^2-5. Por lo tanto, altamente purificado específico de tumor CE (TCE) para el cultivo in vitro permite estudios fun....

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Protocolo

El siguiente protocolo se lleva a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Departamento de Medicina de Laboratorio Animal de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

1. Prepare el siguiente material y reactivos Antes de empezar

1. Preparar los medios de comunicación CE completándola 400 ml bajo nivel de glucosa (1 g / L D-glucosa o LG) de Dulbecco Modificado medio de Eagle (DMEM) con 50 ml de suero bovino fetal inactivado por calor, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml antibiótico-antimicótico, y el hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, y los componentes de heparina desde el kit comercial.
2. Preparar 500 ml de tampón F....

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Resultados

CE representan solamente una fracción pequeña de la población total de células en la mayoría de los tejidos adultos ^11. Por tanto, es importante para digerir completamente el tejido recogido en una suspensión de una sola célula que asegura la liberación máxima de CE de la matriz extracelular (ECM) y los tejidos conectivos. En nuestra experiencia, la selección inmunomagnética CD31 mediada sólo proporciona fracciones enriquecidas de la CE, pero no puros; por lo tanto, un paso crucial es la eliminaci.......

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Discusión

Debido a las dificultades en la obtención de cultivos puros TEC primaria, muchos estudios in vitro TEC sustituto con las líneas de la CE disponibles comercialmente o CE primaria como la vena umbilical humana CE (HUVEC) ^13. Sin embargo, estas poblaciones de la CE de los tejidos normales sólo se pueden servir como sustituto de la TEC que difieren notablemente de sus homólogos normales. Por ejemplo, TEC son fenotípicamente y funcionalmente anormal in vivo y algunas de estas anomalías pued.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)	Gibco	11885-084
EGM-2 Bullet Kit	Lonza	CC4176	Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)	Thermo Scientific	SH30071.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IV	Corning	CB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)	Gibco	14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	14190-144
FACS buffer			0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotech	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%	Gibco	15260-37
Cell freezing media (Bambanker)	Wako Chemicals	302-14681
Collagenase type II	Worthington Biochemical	LS004176	Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)	Worthington Biochemical	LS002004	Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDL	Biomedical Technologies	BT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0	Cellgro	46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture grade	Sigma-Aldrich	G1393-100ML	Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotech	130-092-575
Neutral protease (Dispase)	Worthington Biochemical	LS02104	Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibody	BD Pharmingen	553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)	BD Pharmingen	555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 %	Life Technologies	15250-061
10 mm tissue culture dishes	Corning
15 ml conical tubes (sterile)	Corning
50 ml conical tubes (sterile)	Corning
6-well tissue culture plates	Corning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)	Miltenyi Biotech	130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)	Miltenyi Biotech	130-042-302
Cell strainer 100 μm	Corning	352360
Cloning rings (assorted sizes)	Bel-Art Products	378470000
Cryotubes	Thermo Scientific
Dissecting board			Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use
Dissecting forceps and scissors			Sterilize before use
Dissecting pins 2"			Sterilize before use
FACS tubes with 35 μm filter cap	Corning	352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)	Millipore	SCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
Magnetic Multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)	Miltenyi Biotech	130-093-235	Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope