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요약

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

초록

갓 절연 종양 특이 내피 세포 (TEC)는 종양 혈관 신생의 분자 메커니즘을 탐구 및 암에 대한 새로운 혈관 신생 억제제를 개발하기위한 시험 관내 모델로서 기능 할 수있다. 그러나 쥐의 내피 세포 (EC)의 체외 확장에 장기적으로 인해 비 EC와 표현형 문화 드리프트 (내피 - 투 - 중간 엽 전환) 및 오염에 도전한다. 이것은 쉽게 문화의 공동 정제 섬유 아 세포 또는 종양 세포에 의해 outcompeted된다 TEC 특히 사실이다. 여기서, 콜로니를 선택하여 시험 관내 확장에 결합 면역 자기 농축 활용 고음질 분리 방법이 설명된다. 이 접근법은 기질 또는 종양 세포를 오염 완전히 무료 EC 순수한 분획을 생성한다. 또한 그 혈통 추적 Cdh5의 CRE 주심 : 프로토콜 사용의 ZsGreen 리터 / S / L 기자 마우스는, 여기에 기술, 세포를 확인하는 유용한 도구입니다이 마우스에서 분리 된 EC의 식민지로 순도는 문화의 내구성과 화려한 ZsGreen이 형광을 보여줍니다.

서문

내피 세포 (EC)는 고형 종양의 개발 과정에서 필수적이다. 보급과 먼 부위에서 전이의 파종에 휴면 종양에서 혈관 신생 스위치의 시작에서, EC는 종양 성장 1을 유지하기 위해 혈액, 산소를 공급 도관과 영양분을 형성한다. 최근에 제안 된 바와 같이, EC는 관류 독립 펑션이 암 줄기 세포 및 다른 종양 간질 세포 2-5의 성장을 지원하는 틈새를 형성한다. 따라서, 높은 종양 특이 체외 문화에 대한 EC (TEC)는 종양 혈관 신생 및 종양 세포와 혼선을 매개하는 새로운 분자 메커니즘을 밝혀됩니다 루틴 기능 연구를 허용 정제.

EC는 기원 6의 조직에 따라 고도의 전문이다. 때문에 다른 종양 유형의 이질적인 성격과 종양 미세 환경에, TEC는 또한 종양 특이 전문화 O를 반영하는 고유의 기능이 표시 될 수 있습니다혈관 F. 예를 들어, 다른 유형의 종양 또는 7,8의 성적으로부터 격리 TEC에서 유전자 발현 서명에 현저한 변화가 존재한다. 그러나, TEC 비-EC,​​ 특히 종양 관련 섬유 아 세포와 종양 세포의 빈번한 공동 정화는 게놈 전체의 발현 분석을 혼동 할 수 있습니다. 이러한 원치 않는 세포 유형은 TEC 배양 시험관 팽창 장기에 의존 연구에서 특히 문제가된다.

여기에 설명이 지속적으로 종양과 다른 조직에서 순수한 EC 문화를 생산하는 고품질의 방법이다. EC의 분수와 공동 정제 비 EC의 제거의 면역 자기 열 농축에 따라, 추가 복제 링 단계 9를 사용하는 순수한 EC 식민지를 촬영합니다. 각 콜로니 비 EC 오염의 발생없이 여러 통로 용 배양에서 확장 될 수있다. 이 방법은 엔도의 연구를위한 이상적인 단일 분리 과정에서 다중 EC 클론을 수득상피 이질성. ZsGreen이 리터 / S / L 기자 마우스 문화 10 ZsGreen이 형광을 유지 "운명 매핑"과 지워지지 표시된 EC를 생성하기위한 유용한 도구입니다 : 또한, Cdh5 CRE는 것을 알 수있다. 프로토콜에 약간의 조정으로,이 방법은 다른 유형의 종양 또는 정상 조직에 적용 할 수 있어야합니다.

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프로토콜

다음 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 실험 동물 의학의 부에 의해 설립 된 지침에 따라 수행된다.

1. 시작하기 전에 다음 재료 및 시약 준비

  1. 400 ml의 낮은 혈당 보충에 의해 EC 미디어를 준비 (1g / L의 D- 글루코스 또는 LG) 둘 베코의 수정 50 ml의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청, 5 ml의 항생제 항진균제 50 ㎖ 뉴 - 세럼 IV, 독수리의 매체 (DMEM) 상업 키트에서 hFGF의, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, 헤파린 구성 요소.
  2. 500㎖의 FACS 완충액 (0.5 % BSA 및 PBS 2 mM의 EDTA)을 제조; 멸균 0.22 μm의 필터 컵을 통해 필터링합니다.
  3. 소독 또는 보드를 해부 소독.
  4. 해부 핀, 외과 가위, 및 dissectors을 소독.

2. EC 절연 (1 일 ~ 5 시간)

  1. 이산화탄소 또는 다른 방법과 호환 재치 마우스를 안락사H 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 정책.
    참고 : 크기가 다양한 여러 유방 종양 (5 - 직경 15 mm의), 같은 C3-태그와 같은 단일 유전자 변형 마우스의 개발 TEC의 격리를 위해 그들 모두를 수확해야 할 수 있습니다. 하나의 EC 격리를위한 세 가지 1cm 3 종양 동소 마우스에 접목되어 종양, 수영장 두를 사용하는 경우. 여기서 우리는 데모로 유방 종양을 사용하지만, 프로토콜은 다른 유형의 종양에 대해 변형 될 수있다.
  2. 분무 또는 75 % V / V 에탄올의 충분한 양의 마우스 복부 측면을 닦아 마우스를 소독.
  3. 멸균 후드 나 클린 벤치에서 무균 기술을 사용하여 가위와 dissectors 일쌍로 종양을 절제.
    1. 스트레칭과 해부 보드에 마우스의 사지를 고정. 복막을 열지 않고 가위로 중간 선 복부 절개를합니다. 피부 종양이있는 유선으로 복막 사이에 옆으로 해부.복막을 열지 마십시오.
    2. 소비세 만 종양 유선에서 조직, 일반 유선 마진을 떠나. 조심스럽게 피부와 근육 등 비 종양 조직을 손질하고, 얼음에 LG-DMEM 30 ml의를 포함하는 원뿔 튜브에 해부 종양을 배치합니다.
  4. 조직 문화 후드에 종양 샘플을 가져와; 2 회 - 멸균 LG-DMEM 1 조직을 씻는다.
  5. 멸균 조직 문화 배양 접시에 원뿔 튜브에서 전송 종양, 접시에 LG-DMEM 2 ㎖를 추가하고, 조각으로 멸균 가위 <5mm 말하다.
  6. PBS에서, 디스 파제 1 ㎖를 (주 ​​= 행크의 균형 소금 솔루션에 2 mg을 / ㎖, HBSS를 이하) 콜라게나 제 5 mL를 추가 (재고 = HBSS에 2.5 U / ㎖) 및 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 75 μL (주 = 1 ㎎ / ㎖ ) 페트리 접시에. 총 부피는 지금 ~ 10 ㎖이다.
  7. (미리 설정된 해리 홍보 조직 dissociator 튜브에 페트리 접시에서 콜라겐 / 조직 믹스를 전송하고 두 번 60 초 동안 조직 dissociator에서 실행dissociator에 ogram : 실행 당 1,270 총 라운드). 빛은 37 ° C에서 75 분 동안 진탕 기에서 진탕 배양한다.
  8. 필터를 50 ㎖ 원뿔형 튜브 위에 100 ㎛ 세포 스트레이너를 통해서 조직을 분해. FACS 버퍼 5 ㎖와 린스 필터가 남아있는 세포를 씻어. 5 분 동안 280 XG에 스핀 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
  9. 멸균 수 9 ml의 스톡 RBC 용해 완충액 (10 배)의 1 mL로 희석. 바로 10 용해 완충액 (1X)의 용액과 함께를 Lyse 적혈구는 280 x g에서 5 분간 스핀. 참고 : 약간의 피가 보이는 경우에는이 단계를 건너 뛸 수 있습니다.
  10. FACS 완충액 10ml에 재현 탁. 트리 판 블루 10 μL와 세포 현탁액의 10 μl를 혼합하고, 혈구를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.
  11. ~ 10 7 세포 / 100 μL에서 세포를 재현 탁. 세포 현탁액 100 ㎕ 당 FcRγ 쇄 블록의 10 μl를 추가하고 10 분 동안 얼음에 품어.
  12. 따라 쥐 방지 마우스 PE - 복합 CD31 항체 추가. 때때로 15 분, 영화 튜브 - 표 1 (10) 얼음에 품어.
  13. 5 분 동안 280 XG에 튜브와 스핀에 외과 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 FACS 버퍼의 5 ㎖로 다시 세포 펠렛을 씻는다. 원심 분리기는 세포 펠렛합니다. 방해 세포 펠렛없이 기음 뜨는.
  14. . 표 2에 따라 외과 버퍼 및 안티 체육 마이크로 비드를 추가 (10) 얼음에 품어 - 15 분. 가끔 톡 관.
  15. 5 분 동안 280 XG에 외과 버퍼와 스핀 샘플의 10 ML을 추가; 다시 FACS 완충액 원심 5 ㎖로 한번 세척 하였다. 방해 펠렛없이 대기음 뜨는.
  16. FACS 버퍼 300 μL에 볼륨을 가져와. G X 280에 35 μm의 셀 스트레이너 덮인 관 5 분을 통해 스핀. 필요한 경우 2 튜브와 더 큰 볼륨을 사용합니다.
  17. , 후드에서 자기 multistand 및 자기 열을 설정 분리기에 열을 연결하고 FACS 버퍼 2 ㎖로 열을 평형.
  18. AspiratFACS 완충액 1 ㎖ - E 상등액 및 0.5에서 세포 펠렛을 재현 탁.
  19. 평형 자기 칼럼을 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
  20. FACS 버퍼 2 ㎖로 열 세 번 세척하고, 15 ML 튜브 (FT 분율)의 흐름을 통해 (FT)를 수집합니다.
  21. 분리 떨어져 열을 가지고 또 다른 15 ML 튜브 (용출액 부분)에 외과 버퍼의 2 ㎖로 용출. 모든 세포는 열 떨어져 있습니다 보장하기 위해 플런저를 사용합니다. 마다 버퍼 외과의 2 mL로 용출을 두 번 더 반복합니다.
  22. 5 분 동안 280 XG에서 용출액 스핀.
  23. 상층 액을 제거하고 EC 미디어 10ml에 펠렛을 재현 탁.
  24. 마찬가지로 용출액 부분을 분할 (~ 6 ㎖) 10cm 젤라틴 코팅 요리에. 세 1cm 3 종양, 플레이트는 적어도 네 개의 플레이트에서 세포를 용출시켰다. 여러 판에 다른 농도 또는 플레이트가 용출 세포 (예. 0.5 ml의 1 ml의 1.5 ml의, 4 판에 용출액을 3 ml의 씨앗)을 보장하기 위하여t 적어도 하나의 플레이트는 띄엄 띄엄 용출 세포 시딩된다. (- 2.0 X 10 5 부착 된 세포 즉, 약 1.0) 첨부 된 세포의 생장이 ~ 1 %에서 다음날 있는지 확인합니다.
    주 : EC 콜로니가 다른 세포 유형에 의해 오염되지 않고 형성 할 수 있도록 세포가 부족한 도금 될 필요가있다.
  25. 한 10cm 접시에 플레이트 FT 분율은 세포가 O / N을 복구 할 수 있습니다. 다음날 컨 플루 언트 100 % - 플레이트 (80)가 있는지 확인합니다. (-80 ° C) 250 μL 세포 동결 cryotube 미디어 및 액체 질소에 보관 다음날 세포를 동결. 주 : FT 분획 나중 단계에서 및 / 또는 절연 EC 클론 EC 유전자 발현 분석을위한 음성 대조구로 종양 세포 분리를 위해 사용될 수있다.
  26. 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 10 일 - 식민지 7 후 형성하기 시작합니다. 작은 EC의 식민지가 빠르면 접시의 바닥에 미세 팁 마커와 식민지 일 3. 표시로 식별 할 수 있습니다.
  27. 비 특정 C를 쳤어요멸균을 200㎕ pippet 팁이 식별 된 콜로니 주변의 ELL.

3. 식민지 선택하여 복제의 반지

  1. 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 7 일 - EC 순도는 약 5에서 LDL (DII-AC-LDL) 또한 확인할 수 있습니다. 10 ml의 EC 매체 당 LDL의 50 μl를 추가하고 3 부화 - 형광 현미경으로 세포를 확인하기 전에 4 시간.
    참고 : 여러 LDL + EC 클론이 7 일 ~에서 관찰 할 수있다.
  2. 크기가 5 ㎜ - 그들은 3의 직경에 도달하면 EC의 식민지를 수확 시작합니다. (최상의 결과를 위해 작은 LDL + 세포로 포장되어 큰 식민지를 선택합니다.)
  3. 복제 반지, 프리 코트 0.5 % 젤라틴으로 몇 6 웰 플레이트와 EC를 수확하기 전에. 대기음 젤라틴, 각 웰에 EC 미디어 2 ㎖를 추가하고, 필요할 때까지 인큐베이터에서 접시를 유지한다.
  4. 다른 세포 유형이 클로닝 링 내에 포획되지 않는다 확인 콜로니의 에지에 비 EC 긁어.
  5. 사용위상차 현미경 (10X 대물 또는 4X)를 배양 접시의 바닥에 미세한 팁 마커의 개요 EC 콜로니를 포함한 영역.
  6. PBS 10 mL로 판을 씻고 흡입 할 때 판에 PBS의 매우 얇은 층을 둡니다. (중요 : 소량 (~ 0.5 ㎖) PBS의 복제 링 절차를 수행하는 동안 살아있는 세포를 유지하는 것입니다 또한, 조직 접착제는 접착 물을 필요로한다.)
  7. 적절한 크기의 복제 링을 선택합니다. 반지를 데리러 해부 포셉 한 쌍을 사용하여 10 μL 피펫 팁으로 균등하게 복제 링에 조직 접착제의 작은 금액을 적용합니다.
    참고 : 복제 반지에 조직 접착제 (작은 반지 ~ 0.2 μl를) 최소한의 양을 사용하고 있는지 조직 접착제가 좋은 밀봉을 보장하기 위해 바닥면 주위에 균일하게 확산되어 있는지 확인합니다. 과도한 조직 접착제는 열을 생성하고 세포를 죽일 수있다 필름을 형성한다.
  8. EC 식민지를 통해 복제 링을 놓습니다. 부드럽게 리 접착제하기 위해 복제 링을 아래로 눌러접시에 겨. 식민지가 반지를 접착하기 전에 건조되지 않도록해야합니다.
  9. 즉시 복제 링에 효소 세포 분리 솔루션의 25 μl를 피펫과 ~ 1 분을 품어 또는 세포를 느슨하게 부착 될 때까지.
  10. 미리 예열 EC 미디어를 포함하는 6 웰 플레이트 잘 하나에 복제 링 드롭 현명한에 피펫 세포. (중요 : 세포를 분산 할 수있는 판 흔들지 마십시오; EC 꽉 클러스터에서 성장하는 것을 선호합니다.) 50 복제 반지를 세척 - 가능한 한 많은 세포를 수집하기 위해 100 μL EC 미디어와 같은 6 자에 모든 세척을 전송 .
  11. 10cm 접시에 일부 식민지 수확하기에 너무 작은 경우, 식민지 더 며칠 동안 성장하자, 10 ml의 신선한 미디어를 추가, 다시 복제 링 절차를 반복합니다.
  12. 10cm 조직 배양 접시에 그들을 확장하기 전에, 6 웰 플레이트의 3 우물에 세포를 100 % 합류 및 전송 - 80까지 6 웰 플레이트에서 수확 식민지를 성장. 오염 물질의 세포를 긁어. 반복필요한 경우 - 복제 링 절차의 또 다른 라운드 (3.10 3.5 단계). 확장 할 때 - (70 % ~ 60) 상대적으로 합류 세포를 유지합니다. EC는 너무 부족한 도금 경우 성장을 중지 할 수 있습니다.
  13. 등 외과, 염색, PCR에 의해 EC의 특징은 DIL-AC-LDL이 형광 및 외과 용 PE 또는 다른 형광 항체를 방해 할 수 있습니다.

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결과

EC는 대부분의 성인 조직 (11)의 전체 세포 인구의 작은 부분을 나타냅니다. 그것은 완전히 세포 외 기질 (ECM) 및 결합 조직에서 EC의 최대 방출을 보장 단일 세포 현탁액으로 수확 된 조직을 소화하는 것이 중요하다. 우리의 경험에 의하면, CD31 매개 면역 자기 선택은 풍부한하지만 순수한 EC의 분수를 제공하며, 따라서, 또 다른 중요한 단계는 클로닝 링 (도 1)를 사용하여 EC 콜로...

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토론

때문에 순수 차 TEC의 문화, 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 13 상업적으로 이용 가능한 EC 라인 또는 기본 EC와 시험관 연구에서 많은 대체 TEC를 얻기에 어려움. 그러나, 정상 조직에서 이러한 EC의 인구는 정상적인 대응에서 크게 차이가 TEC에 대한 프록시 역할을 할 수있다. 예를 들어, TEC는 생체 내에서 표현형 및 기능적 이상이며, 이러한 이상 중 일부는 체외 14-18에서 ?...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-Antimycotic Sigma-AldrichA5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)Gibco11885-084
EGM-2 Bullet Kit LonzaCC4176Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)Thermo ScientificSH30071.03Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IVCorningCB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)Gibco14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-144
FACS buffer 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads Miltenyi Biotech130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%Gibco15260-37
Cell freezing media (Bambanker)Wako Chemicals302-14681
Collagenase type II  Worthington BiochemicalLS004176Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)Worthington BiochemicalLS002004Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDLBiomedical TechnologiesBT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0Cellgro46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)Sigma-AldrichA6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture gradeSigma-AldrichG1393-100MLDilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotech130-092-575
Neutral protease (Dispase)Worthington BiochemicalLS02104Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibodyBD Pharmingen553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)BD Pharmingen555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 % Life Technologies15250-061
10 mm tissue culture dishesCorning
15 ml conical tubes (sterile)Corning
50 ml conical tubes (sterile) Corning
6-well tissue culture platesCorning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) Miltenyi Biotech130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)Miltenyi Biotech130-042-302
Cell strainer 100 μm Corning352360
Cloning rings (assorted sizes)Bel-Art Products378470000
CryotubesThermo Scientific
Dissecting boardSterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use 
Dissecting forceps and scissorsSterilize before use 
Dissecting pins 2"Sterilize before use 
FACS tubes with 35 μm filter capCorning352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)MilliporeSCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
Magnetic MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)3M1469SB
CentrifugeEppendorf5810ROr a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)Miltenyi Biotech130-093-235Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation 
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope

참고문헌

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