Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Zusammenfassung

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Zusammenfassung

Frisch isolierte Tumor-spezifische Endothelzellen (TEC) kann zur molekularen Mechanismen der Tumorangiogenese zu erforschen und dienen als ein in vitro-Modell für die Entwicklung neuer Inhibitoren der Angiogenese bei Krebs ist. Jedoch ist die langfristige in-vitro-Expansion von murinen Endothelzellen (EC) herausfordernde aufgrund phänotypischer Drift in Kultur (endothelial-to-mesenchymale Transition) und Verunreinigungen mit Nicht-EC. Dies gilt insbesondere für die TEC die leicht durch co-gereinigte Fibroblasten oder Tumorzellen in Kultur outcompeted werden. Hier wird ein High-Fidelity-Isolierungsverfahren, die die Vorteile der Anreicherung immun gepaart mit Kolonie-Auswahl und in vitro Expansion dauert beschrieben. Dieser Ansatz erzeugt reine EG Fraktionen, die völlig frei von verunreinigenden Stromazellen oder Tumorzellen sind. Es wird auch gezeigt, dass die linien zurückzuführen CDH5 ^cre: ZsGreen ^{l / s / l} Reportermäusen, mit dem Protokoll, beschrieben, sind ein wertvolles Werkzeug, um Zell verifizierenReinheit der isolierten EG Kolonien aus diesen Mäusen zeigen, langlebige und brillante ZsGreen Fluoreszenz in Kultur.

Einleitung

Endothelzellen (EC) sind bei der Entwicklung von soliden Tumoren essentiell. Von Einleitung der Angiogenese-Schalter in ruhenden Tumoren zu Verbreitung und Aussaat von Metastasen an entfernten Stellen, EG bilden die Leitungen, die Blut, Sauerstoff bereitzustellen und Nährstoffe, um das Tumorwachstum ¹ aufrecht zu erhalten. Wie vor kurzem vorgeschlagen, EC auch Perfusions-unabhängige Funktionen und bilden eine Nische, die das Wachstum von Krebs-Stammzellen und anderen Tumor Stromazellen ^2-5 unterstützt. So hochgereinigte Tumor-spezifischen EG (TEC) für die in-vitro-Kultur ermöglicht Routine funktionelle Studien, die Licht auf neuartigen molekularen Mechanismen der Vermittlung der Tumorangiogenese und Übersprechen mit Tumorzellen zu vergießen wird.

EC sind hochspezialisierte Abhängigkeit von dem Ursprungsgewebe ^6. Aufgrund der Heterogenität der verschiedenen Tumorarten und der Tumor-Mikroumgebung kann TEC auch einzigartige Funktionen, die eine tumorspezifische Spezialisierung o widerspiegeln anzeigenf das Gefäßsystem. Zum Beispiel gibt es auffallende Variabilität der Genexpressions in TEC aus unterschiedlichen Typen oder Qualitäten von Tumoren ^7,8 isoliert. Allerdings können häufige Co-Reinigung von Nicht-EG, insbesondere Tumor-assoziierten Fibroblasten und Tumorzellen, mit TEC verwechseln genomweite Expressionsanalysen. Diese unerwünschten Zelltypen sind besonders problematisch, in Studien, die auf langfristigen in vitro Expansion des TEC Kulturen verlassen.

Hier beschrieben wird ein High-Fidelity-Verfahren, die durchweg reine EG Kulturen von Tumoren und anderen Geweben produziert. Nach immunomagnetische Spalte Bereicherung der EG-Fraktionen und Entfernen von co-gereinigten Nicht-EG, um eine zusätzliche Klonen-Ring Schritt reine EG Kolonien verwendet ⁹ zu erfassen. Jede Kolonie in Kultur für mehrere Passagen, ohne die Entstehung von gefährdend Nicht-EG erweitert werden. Dieses Verfahren ergibt ebenfalls mehrere EC-Klone aus einer einzelnen Isolierungsverfahren, die ideal für die Untersuchung von Endothelial Heterogenität. Darüber hinaus wird gezeigt, dass CDH5 ^cre: ZsGreen ^{l / s / l-Reporter-Mäuse} sind ein wertvolles Werkzeug zur Erzeugung von "Schicksal-mapped" lesbar und dauerhaft markierte EC, die ZsGreen Fluoreszenz in Kultur ¹⁰ aufrecht zu erhalten. Mit geringfügigen Anpassungen des Protokoll sollte dieses Verfahren an verschiedene Tumortypen oder normalen Geweben sein.

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Protokoll

Das folgende Protokoll wird gemäß den Leitlinien, die von der Abteilung für Labortiermedizin an der University of North Carolina in Chapel Hill niedergelassen.

1. Bereiten Sie das folgende Material und Reagenzien vor dem Start

1. Vorbereitung EC Medien durch Hinzu 400 ml niedrigen Glucose (1 g / l D-Glucose oder LG) Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml Antibiotika-Antimykotika, und hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 und Heparin-Komponenten aus dem im Handel erhältlichen Kits.
2. Vorbereitung 500 ml FACS-Puffer (0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS); filtriert durch ein steriles 0,22 um Filtertasse.
3. Zu sterilisieren oder zu desinfizieren Sezieren Bord.
4. Dissektion Stifte, chirurgische Scheren und Dissektoren sterilisieren.

2. EG-Isolation (Tag 1, ~ 5 Stunden)

1. Euthanize Maus mit Kohlendioxid oder einem anderen Verfahren konform with der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Politiken.
   Hinweis: Mehrere Brusttumoren unterschiedlicher Größe (von 5 bis 15 mm Durchmesser) in einem einzigen genetisch veränderten Maus zu entwickeln, wie beispielsweise C3-Tag, sollten Sie alle von ihnen für TEC Isolation zu ernten. Bei Verwendung von Tumoren, die orthotop bei Mäusen eingepflanzt werden, Pool zwei vor drei 1 cm ³ Tumoren für eine einzige EG-Isolation. Hier verwenden wir Brusttumoren als Demonstration, aber das Protokoll kann für andere Tumorarten modifiziert werden.
2. Desinfizieren Maus durch Sprühen oder mit reichlichen Menge von 75% v / v Ethanol Abwischen des Mausbauchseite.
3. Resezieren Tumoren mit einer Schere und Dissektoren unter aseptischen Bedingungen in eine sterile Haube oder an einer Sterilbank.
   1. Ausstrecken und die Glieder der Mäuse Stift auf einem Seziertisch Bord. Machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt mit der Schere ohne Öffnen des Bauchfells. Lateral zerlegen zwischen der Haut und dem Bauchfell zu den Brustdrüsen, wo Tumore befinden.Das Bauchfell nicht öffnen.
   2. Verbrauch nur Tumorgewebe von den Brustdrüsen, Weglassen normalen Brust Margen. Sorgfältig schneiden Sie Nicht-Tumor-Gewebe wie Haut und Muskeln, und legen Sie sezierten Tumoren in einem konischen Röhrchen mit 30 ml DMEM-LG auf Eis.
4. Bringen Tumorproben zur Gewebekultur Kapuze; waschen Gewebe mit sterilem LG-DMEM 1-2 mal.
5. Transfer Tumoren von der konischen Röhrchen in einen sterilen Gewebekulturpetrischale, 2 ml DMEM-LG in der Schale, und Hackfleisch mit einem Paar von sterilen Schere in Stücke <5 mm.
6. 5 ml Collagenase (stock = 2 mg / ml in Hanks Balanced Salt Solution, im Folgenden HBSS), 1 ml Dispase (stock = 2,5 U / ml in HBSS) und 75 & mgr; l Desoxyribonuclease (lieferbar = 1 mg / ml in PBS ) in die Petrischale. Gesamtvolumen ist jetzt ~ 10 ml.
7. Übertragen Sie die Kollagenase / Gewebemischung aus der Petrischale mit einem gewebe Dissociator Rohr und auf einem Gewebe Dissociator für 60 Sekunden laufen zweimal (voreingestellt Dissoziation prOgram auf der Dissociator: 1270 Gesamt Schuss pro Lauf). Inkubieren mit leichten Schütteln auf einem Schüttler für 75 min bei 37 ° C.
8. Filter verdaute Gewebe durch ein 100 & mgr; m Zellsieb über einem 50 ml konischen Röhrchen. Rinse-Filter mit 5 ml FACS-Puffer, um jegliche verbleibenden Zellen zu waschen. Spin bei 280 xg für 5 Minuten und der Überstand vorsichtig abzusaugen, ohne das Zellpellet zu stören.
9. Verdünnen Sie 1 ml der Stamm RBC Lysispuffer (10x) in 9 ml sterilem Wasser. Lyse der roten Blutzellen mit 10 ml Lyse-Puffer (1x) und unmittelbar Spin 5 min bei 280 x g. Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen, wenn wenig Blut sichtbar ist.
10. Resuspendiere in 10 ml FACS-Puffer. Mischen Sie 10 ul der Zellsuspension mit 10 ul Trypanblau, und zählen lebende Zellen mit einer Zählkammer.
11. Die Zellen bei ~ ¹⁰ 7 Zellen / 100 ul. Zugabe von 10 & mgr; l FcR-Block pro 100 ul Zellsuspension, und Inkubieren auf Eis für 10 min.
12. In Ratten-Anti-Maus-PE-konjugierten CD31 Antikörpers nach. Tabelle 1 auf Eis inkubieren 10-15 min und das Röhrchen klopfen, gelegentlich.
13. 10 ml FACS-Puffer auf das Rohr und Schleudern bei 280 × g für 5 min. Den Überstand vorsichtig abnehmen und waschen Sie das Zellpellet erneut mit 5 ml FACS-Puffer. Zentrifuge Zellen zu pelletieren. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Zellpellet.
14. Hinzufügen FACS-Puffer und Anti-PE-Mikrokügelchen gemäß Tabelle 2 auf Eis inkubieren. 10 - 15 min. Flick Rohr gelegentlich.
15. 10 ml FACS-Puffer und Spin-Proben bei 280 × g für 5 min; sofort abwaschen mit 5 ml FACS-Puffer und Zentrifuge wieder. Überstand wird abgesaugt, ohne störende Pellet.
16. Das Volumen auf 300 ul in FACS-Puffer. Spin durch 35 & mgr; m-Sieb Zell Röhrchen mit 5 min bei 280 x g. Benutzen Sie 2 Rohre und ein größeres Volumen, wenn nötig.
17. Einrichten Magnet mehrgerüstigen und magnetischen Spalten in Haube, fügen Sie eine Spalte mit dem Separator und ins Gleichgewicht der Säule mit 2 ml FACS-Puffer.
18. Aspirate des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 0,5 - 1 ml FACS-Puffer.
19. Übergeben Sie die Zellsuspension durch die äquilibriert magnetischen Spalte.
20. Dreimal mit 2 ml FACS-Puffer Die Säule, und sammeln Flow-Through (FT) in einem 15-ml-Tube (FT-Fraktion).
21. Nehmen Sie die Spalte aus dem Separator und Elution mit 2 ml FACS-Puffer in einen anderen 15 ml-Röhrchen (Eluatfraktion). Verwenden Sie Kolben, um sicherzustellen, alle Zellen aus der Säule. Wiederholung der Elution noch zwei Mal mit 2 ml FACS-Puffer jedesmal.
22. Spin des Eluats bei 280 × g für 5 min.
23. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml EC Medien.
24. Ebenso teilen die Eluatfraktion (~ 6 ml) in 10 cm Gelatine beschichteten Schalen. Seit drei 1 cm ³ Tumoren, Platte eluiert Zellen in mindestens vier Platten. Alternativ Platte eluiert Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen in mehrere Platten (z. B. Saatgut, 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml und 3 ml des Eluates in vier Platten), um sicherzustellen, daß einet mindestens eine Platte ist dünn mit eluierten Zellen ausgesät. Prüfen, ob die Konfluenz der anhaftenden Zellen ist bei ~ 1% am nächsten Tag (dh ungefähr 1,0 bis 2,0 x 10 ⁵ anhaftenden Zellen).
    Anmerkung: Die Zellen brauchen spärlich zu plattierenden sodass EC Kolonien können, ohne von anderen Zelltypen kontaminierten bilden.
25. Platte FT-Fraktion in einem 10 cm-Schale zu lassen Zellen zu gewinnen O / N. Überprüfen Sie, ob die Platte 80-100% konfluent am nächsten Tag. Frieren Sie die Zellen nach unten (-80 ° C) in 250 ul zellgefrierenden Medien in einem Kryoröhrchen und speichern sie in flüssigem Stickstoff am nächsten Tag. Anmerkung: FT-Fraktion kann zur Tumorzellisolierung zu einem späteren Zeitpunkt und / oder als Negativkontrolle für EC Genexpressionsanalyse der isolierten EC-Klone verwendet werden.
26. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. Kolonien beginnen, nach 7 bilden - 10 Tage. Kleine EG Kolonien können so früh wie Tag 3. Markieren Sie die Kolonien mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Schale identifiziert werden.
27. Abkratzen unspezifische cEllen rund um die identifizierten Kolonien mit einer sterilen 200 ul Pippet Spitze.

3. Colony Auswahl mit Cloning Ringe

1. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. 7 Tage - EC Reinheit kann durch LDL (Dil-Ac-LDL) zusätzlich bei etwa 5 überprüft werden. In 50 ul LDL pro 10 ml EC-Medium und Inkubation für 3-4 h vor der Überprüfung der Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop.
   Hinweis: Mehrere LDL ⁺ EC-Klone konnten bei ~ Tag 7 beobachtet werden.
2. Beginnen Ernten EC Kolonien, wenn sie Durchmessern von 3 erreichen - 5 mm in der Größe. (Wählen Sie große Kolonien, die mit kleinen LDL ⁺ Zellen, die für beste Ergebnisse gepackt werden.)
3. Vor der Ernte EG mit Clonierungsringen, Vorstrich ein paar 6-Well-Platten mit 0,5% Gelatine. Saugen Sie Gelatine, 2 ml EC Medien in jede Vertiefung, und halten Sie die Platten in einen Inkubator, bis sie benötigt.
4. Abkratzen Nicht-EG an den Rändern der Kolonien, um sicherzustellen, dass keine anderen Zelltypen werden mit dem Klonen Ring eingefangen werden.
5. Mit einemPhasenkontrastmikroskop (4X oder 10X-Objektiv), Exposé mit einer feinen Spitze-Markierung auf dem Boden der Kulturschale die Bereiche mit EC Kolonien.
6. Waschen Sie die Platte mit 10 ml PBS und lassen Sie eine sehr dünne Schicht aus PBS in der Platte beim Ansaugen. (Wichtig: eine kleine Menge (~ 0,5 ml) PBS werden die Zellen während des Klonen-Ring-Verfahren am Leben zu erhalten; auch muss Gewebekleber Wasser zu binden.)
7. Wählen Sie eine Klonierung Ring entsprechender Größe. Verwenden Sie ein Paar Pinzette zu holen ein Ring, und mit einer 10 ul Pipettenspitze eine kleine Menge von Gewebekleber gleichmäßig auftragen auf das Klonen Ring.
   Hinweis: Verwenden Sie nur eine minimale Menge (~ 0,2 & mgr; l für einen kleinen Ring) der Gewebekleber zum Klonen Ringe, und stellen Sie sicher, Gewebekleber wird gleichmäßig über die Bodenfläche verteilt, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Übermäßige Gewebekleber erzeugt Wärme und bildet Filme, die Zellen zu töten kann.
8. Legen Sie das Klonen Ring über die EG-Kolonie. Drücken Sie vorsichtig das Klonen Ring um die ri klebenng auf die Platte. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien werden nicht vor dem Kleben der Ring getrocknet.
9. Unmittelbar Pipettieren von 25 ul der enzymatischen Zellablösung Lösung in den Klonierungsvektor Ring und inkubiere ~ 1 min oder bis die Zellen sind lose befestigt.
10. Pipet-Zellen bei der Klonierung Ring tropfenweise in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit vorgewärmten EG Medien. (Wichtig: die Platte, um Zellen zu dispergieren, nicht schütteln; EG lieber in dichten Trauben wachsen.) Waschen Sie das Klonen Ring mit 50-100 ul EG Medien, um so viele Zellen wie möglich zu sammeln und übertragen alle Waschanlagen in den gleichen 6-Well- .
11. Wenn einige Kolonien in der 10 cm-Schale zu klein, um zu ernten, 10 ml frischem Medium, lassen die Kolonien wachsen für ein paar Tage, und wiederholen Sie den Klonen Ring Prozedur erneut.
12. Wachsen geernteten Kolonien in Platten mit 6 Vertiefungen bis 80 - 100% konfluent waren, und die Übertragungszellen zu 3 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen, zuvor in einer 10 cm-Gewebekulturschale expandierenden ihnen. Abkratzen Verunreinigung Zellen. Wiederholeneine weitere Runde des Klonens Ringverfahren (Schritte von 3,5 bis 3,10), wenn nötig. Halten Zellen relativ konfluent (~ 60-70%) bei der Erweiterung. EG kann aufhören zu wachsen, wenn überzogen zu spärlich.
13. Charakterisieren EG durch FACS, Färbung, PCR usw. Beachten Sie, dass Dil-Ac-LDL ist fluoreszierend und können mit PE oder andere fluoreszierende Antikörper für FACS stören.

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Ergebnisse

EC stellen nur geringfügige einen Bruchteil der gesamten Zellpopulation in den meisten Geweben von Erwachsenen ^11. Es ist daher wichtig, vollständig zu verdauen, die geerntete Gewebe in eine Einzelzellsuspension, die die maximale Freisetzung von EC von extrazellulärer Matrix (ECM) und Bindegewebe gewährleistet. Nach unserer Erfahrung bietet CD31-vermittelte immunomagnetische Auswahl nur angereicherten aber nicht reine EG Fraktionen; Daher ist ein weiterer entscheidender Schritt, die physische Entfernung v...

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Diskussion

Aufgrund der Schwierigkeiten bei der reinen Primär TEC Kulturen, viele in vitro-Studien Ersatz TEC mit handelsüblichen EC Linien oder primäre EC wie humane Nabelvenen-EC (HUVEC) ^13. Jedoch können diese EG-Populationen aus normalen Geweben dienen nur als Proxy für TEC, die sich deutlich von ihren normalen Gegenstücken unterscheiden. Zum Beispiel sind TEC phänotypisch und funktionell abnormalen in vivo und einige dieser Anomalien können tragbare in vitro ^14-18

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)	Gibco	11885-084
EGM-2 Bullet Kit	Lonza	CC4176	Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)	Thermo Scientific	SH30071.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IV	Corning	CB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)	Gibco	14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	14190-144
FACS buffer			0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotech	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%	Gibco	15260-37
Cell freezing media (Bambanker)	Wako Chemicals	302-14681
Collagenase type II	Worthington Biochemical	LS004176	Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)	Worthington Biochemical	LS002004	Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDL	Biomedical Technologies	BT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0	Cellgro	46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture grade	Sigma-Aldrich	G1393-100ML	Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotech	130-092-575
Neutral protease (Dispase)	Worthington Biochemical	LS02104	Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibody	BD Pharmingen	553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)	BD Pharmingen	555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 %	Life Technologies	15250-061
10 mm tissue culture dishes	Corning
15 ml conical tubes (sterile)	Corning
50 ml conical tubes (sterile)	Corning
6-well tissue culture plates	Corning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)	Miltenyi Biotech	130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)	Miltenyi Biotech	130-042-302
Cell strainer 100 μm	Corning	352360
Cloning rings (assorted sizes)	Bel-Art Products	378470000
Cryotubes	Thermo Scientific
Dissecting board			Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use
Dissecting forceps and scissors			Sterilize before use
Dissecting pins 2"			Sterilize before use
FACS tubes with 35 μm filter cap	Corning	352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)	Millipore	SCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
Magnetic Multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)	Miltenyi Biotech	130-093-235	Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope