JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Özet

Taze izole edilmiş tümör spesifik endotel hücreleri (TEC), tümör anjiyogenez moleküler mekanizmaları araştırmak ve kanseri için yeni anjiyojenez inhibitörleri geliştirmek için bir in vitro model olarak hizmet etmek için de kullanılabilir. Ancak, fare endotel hücreleri (EC) in vitro genişleme uzun vadeli sebebiyle dışı AT ile fenotipik kültüründe sürüklenme (endotel-to-mezenkimal geçiş) ve kontaminasyona zordur. Bu hali hazırda kültür eş saflaştınldı fibroblast veya tümör hücreleri tarafından outcompeted edilir TEC için de geçerlidir. Burada, koloni seçimi ve in vitro genişleme birleştiğinde immünomanyetik zenginleşme yararlanır yüksek sadakat izolasyon yöntemi tarif edilmektedir. Bu yaklaşım stromal veya tümör hücrelerini kontamine tamamen ücretsizdir saf AK kesirler oluşturur. Aynı zamanda, bu soy takip Cdh5 CRE gösterilmiştir: protokolü ile birlikte kullanıldığında ZsGreen l / s / l raportör fareler, burada tarif edilen, hücrenin kontrol etmek için bir değerli bir araçtırBu farelerden izole AK koloniler olarak saflık kültüründe dayanıklı ve parlak ZsGreen floresan göstermektedir.

Giriş

Endotel hücreleri (EC), katı tümörlerin gelişimi sırasında gereklidir. Yaygınlaştırılması ve uzak bölgelerde metastaz tohumlama uykuda tümörlerde anjiyojenik anahtarın başlangıcından itibaren, AK tümör büyümesini 1. sürdürmek için kan, oksijen sağlayan kanallar ve besin oluştururlar. Son zamanlarda önerildiği gibi, AK perfüzyon bağımsız fonksiyonlara sahip ve kanser kök hücreleri ve diğer tümör stromal hücrelerinin 2-5 gelişimini destekler bir niş oluşturmaktadır. Böylece, son derece tümör spesifik in vitro kültür EC (TEC) tümör anjiyogenez ve tümör hücreleri ile çapraz konuşma aracılık eden yeni moleküler mekanizmaları ışık tutacak rutin fonksiyonel çalışmalar için izin verir saflaştırılmış.

AK kökenli 6 dokuya bağlı olarak son derece uzmanlaşmış. Farklı olması nedeniyle tümör tiplerinin heterojen ve tümör mikro ortama, TEC, aynı zamanda, bir tümör spesifik uzmanlık o yansıtan benzersiz özellikler gösterebilirdamarsal f. Örneğin, farklı tip veya tümörlerin 7,8 sınıflarda izole TEC gen ifade imzaları çarpıcı farklılıklar bulunmaktadır. Bununla birlikte, TEC olmayan EC, özellikle de tümör bağlantılı fibroblastlar ve tümör hücreleri, sık sık birlikte saflaştırma genom çapında sentezleme analiz karıştırabilir. Bu istenmeyen hücre tipleri TEC kültürlerinin in vitro genişlemesi uzun vadeli dayanan çalışmalarında, özellikle sorunludur.

Burada anlatılan sürekli tümörler ve diğer dokulardan saf AK kültürleri üreten bir yüksek sadakat yöntemidir. AK kesirler ve ko-saflaştırılmış non-EC çıkarılması immünomanyetik kolon zenginleştirme ardından, ilave bir klonlama halka adımı 9 kullanılan saf AK koloniler yakalamak için. Her koloni olmayan EC kirlenmesine neden ortaya çıkması olmadan birden geçişleri için kültürde genişletilebilir. Bu yöntem aynı zamanda endo çalışmaları için ideal olan tek bir izolasyon prosedürü, birden fazla AK klonlar verirendotel heterojenlik. ZsGreen l / s / l muhabiri fareler kültür 10 ZsGreen floresan korumak "kader-eşleştirilmiş" ve silinmez işaretli AK üretmek için değerli bir araçtır: Ayrıca, Cdh5 CRE gösterilmiştir. Protokol küçük ayarlamalar ile, bu yöntem, farklı tümör tiplerinin veya normal dokulara uyarlanabilir olmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Aşağıdaki protokol Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Laboratuar Hayvanları Tıp Bölümü tarafından kurulan yönergelere göre yürütülür.

1. Başlamadan Önce Aşağıdaki Malzeme ve Reaktifler hazırlayın

  1. 400 mi, düşük glukoz ilave tarafından AT ortamı hazırlanması (1 g / L D-glikoz veya LG) Dulbecco'nun Modifiye 50 ml ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu, 5 mi antibiyotik antimikotik 50 mi Nu-serum IV ile Eagle ortamı (DMEM), ve ticari kiti hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 ve heparin bileşenleri.
  2. 500 ml FACS tamponu (% 0.5 BSA ve PBS içinde 2 mM EDTA) hazırlanması; steril 0.22 mikron filtre fincan süzülür.
  3. Sterilize veya dezenfekte kurulu diseksiyon.
  4. Diseksiyon pimleri, cerrahi makas ve dissektörleri sterilize edin.

2. AK İzolasyon (Gün 1 ~ 5 saat)

  1. Karbon dioksit ya da diğer yöntemlerle uyumlu wit ile fare Euthanizeh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) politikaları.
    Not: boyutu değişen Çoklu meme tümörleri (5 - 15 mm çapında), örneğin C3-etiketi olarak tek bir genetiği değiştirilmiş fare geliştirmek TEC izolasyonu için hepsini hasat emin olabilir. Tek bir AK izolasyonu için üç 1 cm 3 tümörlere orthotopically farelerde aşılanan tümörler, havuz, iki kullanıyorsanız. Burada bir göstergesi olarak meme tümörleri kullanımı, ancak protokol tümör tipleri için modifiye edilebilir.
  2. Püskürtme veya% 75 h / h etanol içinde bol miktarda fare ventral yan silerek fare dezenfekte.
  3. Bir steril bir muhafaza içinde ya da temiz bir tezgah aseptik teknikler kullanılarak makas ve dissektörleri bir çift tümörlerin rezeke.
    1. Uzatın ve diseksiyon gemide farelerin uzuvlarını pin. Periton açmadan makas ile orta hat ventral kesi yapmak. Deri ve tümörler yer alır meme bezleri doğru periton arasında yana doğru parçalara ayır.Periton açmayın.
    2. Vergi sadece tümörün meme bezlerinin doku, normal meme marjları dışarıda bırakarak. Dikkatlice örneğin, deri ve kaslar gibi non-tümör dokuları keserek ve buz üzerinde LG-DMEM 30 ml ihtiva eden bir konik bir tüp içinde parçalara tümörleri yerleştirin.
  4. Doku kültürü kaputu tümör örnekleri getirin; 2 kez - Steril LG-DMEM 1 ile dokuları yıkayın.
  5. Steril doku kültürü petri konik tüp aktarın tümörleri, çanak LG-DMEM 2 ml ekleyin ve parçalar halinde steril bir makas <5 mm kıyma.
  6. PBS içinde dispase 1 ml (stok = Hank Dengelenmiş Tuz Çözeltisi içinde 2 mg / ml, HBSS anılacaktır) kolajenaz 5 ml (stok = HBSS 2.5 U / ml) ve deoksiribonükleaz 75 ul (stok = 1 mg / ml ) petri içine. Toplam hacmi şimdi ~ 10 ml'dir.
  7. (Önceden ayarlanmış ayrışma pr bir doku ayıracı tüp petri kollajenaz / doku karışımı aktarın ve iki kez 60 saniye boyunca bir doku dissociator çalıştırmakdissociator üzerinde Ogram: kaçak başına 1,270 toplam mermi). Işık 37 ° C 'de 75 dakika süre ile bir çalkalama çalkalayarak kuluçkalayın.
  8. Filtre 50 ml konik tüp üzerinde 100 mikron hücre süzgecinden doku sindirmek. FACS tamponu, 5 ml ile durulayın filtre kalan hücrelerin yıkayın. 5 dakika boyunca 280 xg'de Spin ve dikkatli hücre pelletini bozmadan süpernatant aspire.
  9. Steril su 9 ml stok RBC parçalama tamponu (10x) 1 ml seyreltilir. Hemen 10 liziz tamponu (1x) ml ile Lyse kırmızı kan hücreleri 280 x g'de 5 dakika dönerler. Not: az kan görünür ise, bu adım atlanabilir.
  10. FACS tampon, 10 ml içinde süspanse. Tripan mavisi 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve bir hemositometre kullanılarak canlı hücreleri sayın.
  11. ~ 10 7 hücre / 100 ul hücreleri tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonunun 100 ul başına FcR bloğunun 10 ul ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  12. Göre sıçan-anti-fare PE-konjuge CD31 antikoru ekle. Bazen 15 dakika ve fiske tüp - Tablo 1-10 buz üzerinde inkübe edin.
  13. 5 dakika boyunca 280 x g'de tüp ve spin FACS tampon 10 ml ekleyin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve FACS tamponu, 5 ml ile tekrar hücre pelletini yıkayın. Santrifüj pelet hücreleri. Rahatsız edici hücre pelet olmadan Süpernatant aspire.
  14. . Tablo 2'ye göre FACS tamponu ve anti-PE mikroboncukları ekleme 10 boyunca buz üzerinde inkübe - 15 dakika. Bazen Flick tüpü.
  15. 5 dakika boyunca 280 xg'de FACS tampon maddesi ve santrifüj örnekleri 10 ml ilave edilir; Yine FACS tamponu ve santrifüj 5 ml ile bir kez yıkanır. Rahatsız pelet olmadan Süpernatant aspire.
  16. FACS tampon 300 ul hacim kazandırın. G x 280 35 mikron hücre-süzgeç başlıklı tüp 5 dakika boyunca Spin. Gerekirse 2 tüpleri ve daha geniş bir hacim kullanın.
  17. Kaput manyetik multistand ve manyetik sütun ayarlama ayırıcı bir sütun takın ve FACS tamponu 2 ml sütun dengeye.
  18. AspiratFACS tampon 1 ml e - süpernatan ve 0,5 hücre pelletini.
  19. Dengelenmiş bir manyetik sütun üzerinden bir hücre süspansiyonu geçirin.
  20. FACS tamponu 2 ml sütun üç kez yıkayın ve 15 ml'lik bir tüp (FT fraksiyonu) akış-through (FT) toplar.
  21. Ayırıcı rahatsız sütun almak ve başka bir 15 ml tüp (Elüat fraksiyonu) içine FACS tampon, 2 ml ile elüte. Tüm hücreleri sütunda kapalı olduğundan emin olmak için piston kullanın. Her FACS tamponu 2 ml elüsyon iki kez daha tekrarlayın.
  22. 5 dakika boyunca 280 xg'de eluatın Spin.
  23. Süpernatantı ve AT medya 10 ml pelletini.
  24. Aynı şekilde Elüat kısmını bölmek (~ 6 mi) 10 cm jelatin kaplı tabaklara. Üç 1 cm3 tümörlerde levhası, en az dört plaka hücreler yıkandı. Çok plakalı farklı konsantrasyonlarda Alternatif olarak, plak elüte hücreler (örn.,, 0.5 ml, 1 mi, 1.5 mi, dört plakalar halinde, ayrılmış malzeme içinde 3 ml tohum) bir sağlamak içint az bir levha seyrek taşınan hücreleri ile tohumlanır. (- 2.0 x 10 5 ekli hücreler, yani yaklaşık 1.0) bağlı hücrelerin confluency ~% 1 ertesi gün olduğunu kontrol edin.
    Not: EC koloniler, diğer hücre tipleri ile kirlenmiş olmadan meydana böylece hücreler, seyrek kaplama gerekir.
  25. Bir adet 10 cm'lik çanak Plaka FT kesir hücreleri O / N kurtarmak izin. Ertesi gün birleştirilebilmeli% 100 - plaka 80 olup olmadığını kontrol edin. (-80 ° C) 250 ul hücre dondurma bir cryotube medya ve sıvı azot içinde saklayın ertesi gün hücreleri aşağı dondurun. Not: FT fraksiyon daha sonraki bir aşamada ve / veya izole AT klonlarının AT gen ekspresyon analizi için bir negatif kontrol olarak, tümör hücre izolasyonu için de kullanılabilir.
  26. 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. 10 gün - Koloniler 7 sonra oluşturmaya başlar. Küçük AK kolonileri gibi erken çanak altındaki ince uçlu işaretleyici ile koloniler gün 3. Mark olarak tespit edilebilir.
  27. Non-spesifik c kazıyaraksteril 200 ul pippet ucu ile tanımlanan kolonileri çevreleyen arşın.

3. Colony Seçimi kullanma Klonlama Yüzükler

  1. 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. 7 gün - EC saflığı yaklaşık en az 5, LDL (DII-Ac-LDL) eklenerek kontrol edilebilir. 10 ml AK ortamı başına LDL'nin 50 ul ekleyin ve 3 inkübe - floresan mikroskop altında hücrelerin kontrol etmeden 4 saat.
    Not: Birden fazla LDL + AT klonları günde 7 ~ gözlenen olabilir.
  2. Boyutu 5 mm - bunlar 3 çapları ulaştığında AT koloniler hasat başlayın. (En iyi sonuçlar için küçük LDL + hücreler ile paketlenir büyük koloniler seçin.)
  3. Klonlama halkaları, önceden-kaplama% 0.5 jelatin ile bir kaç 6 oyuklu plakalar ile AK hasat önce. Aspire jelatin, her iyi AT medya 2 ml ekleyin, ve gerektiği kadar bir kuluçka tabak tutun.
  4. Başka hiçbir hücre tipleri klonlama halkası içinde sıkışıp emin olmak için kolonilerin kenarlarında olmayan EC kazımak.
  5. Kullanmafaz-kontrast mikroskobu (10X 4X ya da objektif), kültür çanak altındaki ince uçlu işaretleyici ile anahat AK koloni içeren alanlar.
  6. 10 ml PBS ile plaka yıkanır ve aspire plaka PBS çok ince bir tabaka bırakmak. (Önemli: küçük bir miktar (~ 0.5 ml) PBS klonlama halka işlemi sırasında canlı hücreleri tutacak, aynı zamanda, doku yapıştırıcı yapıştırmak için suya ihtiyaç duyar.)
  7. Uygun boyutta bir klonlama halka seçin. Bir yüzük almak için diseksiyon forseps bir çift kullanın ve bir 10 ul pipet ucu ile eşit klonlama halkası üzerine doku yapıştırıcı küçük bir miktar uygulayın.
    Not: klonlama halkalar üzerinde doku yapıştırıcı (küçük halka için ~ 0,2 ul) Sadece az miktarda kullanın ve emin doku yapıştırıcısı iyi sızdırmazlık sağlamak için alt yüzeyi etrafında eşit olarak yayılır olun. Aşırı doku yapıştırıcı ısı üretir ve hücreleri öldürebilir filmler oluşturur.
  8. AK kolonisi üzerinde klonlama halkasını yerleştirin. Yavaşça ri tutkal klonlama halkasını bastırınplaka üzerine ng. Koloniler halka yapıştırma önce kurumuş olmadığından emin olun.
  9. Hemen klonlama halka içine enzimatik hücre dekolmanı çözeltisinin 25 ul pipetlemeyin ve ~ 1 dk inkübe veya hücreleri gevşek bağlanmış kadar.
  10. Önceden ısıtılmış EC ortamı ihtiva eden bir 6-yuvalı plakanın bir kuyuya klonlama halkası damla damla pipeti hücreleri. (Önemli: hücrelerini dağıtmak için plaka sallamayın; AK sıkı kümeler halinde büyümek için tercih ediyor.) 50 ile klonlama halkasını yıkayın - mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri toplamak için 100 ul AK medya ve aynı 6-kuyuya tüm yıkar transferi .
  11. 10 cm çanak bazı koloniler hasat için çok küçük ise, koloniler daha birkaç gün büyümesine izin, 10 ml taze medya ekleyin ve tekrar klonlama halka prosedürü tekrarlayın.
  12. 10 cm'lik bir doku kültürü tabağına genişletmeden önce, bir 6-yuvalı plaka 3 çukurlara hücreler% 100 birleşmiş, ve transfer - 80 kadar 6-yuvalı plakalar içinde hasat koloniler büyütün. Kirletici hücreleri kazımak. TekrarlamaGerekirse - klonlama halka prosedürünün bir tur (3.10 3.5 Adımları). Genişletirken - (% 70 ~ 60) nispeten konfluent hücreleri tutun. AK Çok seyrek kaplama varsa büyüyen vermeyebilir.
  13. Vb FACS, boyanması, PCR tarafından EC karakterize Dil-Ac-LDL floresan ve FACS için PE veya diğer floresan antikorlarla engel olabilir unutmayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

AT en yetişkin dokularda 11 toplam hücre popülasyonunun sadece küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Tam hücre dışı matrisin (ECM) ile bağ dokulardan EC maksimal salınmasını sağlayan tek bir hücre süspansiyonu içine hasat doku sindirimi önemlidir. Bizim tecrübelerimize göre, CD31 aracılı immünomanyetik seçim yalnızca zenginleştirilmiş değil saf AK kesirler sağlar; Bu nedenle, başka önemli bir adım klonlama halkaları (Şekil 1) kullanılarak AT kolonilerin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Nedeniyle olarak saf birincil TEC kültürleri, insan göbek damar EC (HUVEC), 13 gibi ticari olarak temin AT hatları veya primer EC ile in vitro çalışmalar, birçok ikame TEC elde zorluklar. Ancak, normal dokulardan bu AK popülasyonları sadece normal benzerlerinden belirgin farklılık TEC için bir vekil olarak hizmet edebilir. Örneğin, TEC in vivo fenotipik ve fonksiyonel anormal ve bu anormalliklerin bazıları, in vitro 14-18 yılında iletilebilir o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-Antimycotic Sigma-AldrichA5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)Gibco11885-084
EGM-2 Bullet Kit LonzaCC4176Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)Thermo ScientificSH30071.03Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IVCorningCB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)Gibco14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-144
FACS buffer 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads Miltenyi Biotech130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%Gibco15260-37
Cell freezing media (Bambanker)Wako Chemicals302-14681
Collagenase type II  Worthington BiochemicalLS004176Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)Worthington BiochemicalLS002004Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDLBiomedical TechnologiesBT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0Cellgro46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)Sigma-AldrichA6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture gradeSigma-AldrichG1393-100MLDilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotech130-092-575
Neutral protease (Dispase)Worthington BiochemicalLS02104Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibodyBD Pharmingen553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)BD Pharmingen555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 % Life Technologies15250-061
10 mm tissue culture dishesCorning
15 ml conical tubes (sterile)Corning
50 ml conical tubes (sterile) Corning
6-well tissue culture platesCorning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) Miltenyi Biotech130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)Miltenyi Biotech130-042-302
Cell strainer 100 μm Corning352360
Cloning rings (assorted sizes)Bel-Art Products378470000
CryotubesThermo Scientific
Dissecting boardSterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use 
Dissecting forceps and scissorsSterilize before use 
Dissecting pins 2"Sterilize before use 
FACS tubes with 35 μm filter capCorning352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)MilliporeSCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
Magnetic MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)3M1469SB
CentrifugeEppendorf5810ROr a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)Miltenyi Biotech130-093-235Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation 
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope

Referanslar

  1. Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
  2. Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
  3. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5(2011).
  4. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
  5. Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
  6. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429(2012).
  7. Dudley, A. C. Tumor endothelial cells. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).
  8. Aird, W. C. Molecular heterogeneity of tumor endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).
  9. Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
  10. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  11. Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  12. Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
  13. Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
  14. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  15. Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
  16. Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
  17. Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
  18. Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
  19. Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
  20. Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200(2014).
  21. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  22. Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
  23. Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
  24. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
  25. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
  26. Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
  27. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
  28. Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
  29. Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
  30. Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
  31. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  32. Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
  33. Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
  34. Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
  35. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  36. Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
  37. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  38. Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
  39. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
  40. Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pendotel to mezenkimal Say 104T m r anjiyogenezendotelyal h cret m r mikroendotelyal h cre izolasyonuge i

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır