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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Abstract

Appena isolate tumore-specifici cellule endoteliali (TEC) possono essere usati per esplorare i meccanismi molecolari di angiogenesi tumorale e servire come un modello in vitro per lo sviluppo di nuovi inibitori dell'angiogenesi per il cancro. Tuttavia, a lungo termine in espansione in vitro di cellule endoteliali murine (EC) è difficile a causa di deriva fenotipica nella cultura (passaggio endoteliale-a-mesenchimale) e la contaminazione con i non-CE. Ciò è particolarmente vero per TEC, che sono prontamente outcompeted da fibroblasti co-purificate o cellule tumorali in coltura. Qui, un metodo di isolamento ad alta fedeltà che sfrutta arricchimento immunomagnetica accoppiato con selezione delle colonie e in espansione in vitro è descritto. Questo approccio genera frazioni pure CE che sono completamente libero di contaminare cellule stromali o tumorali. E 'inoltre dimostrato che lignaggio tracciato Cdh5 cre: / l topi reporter ZsGreen l / s, utilizzati con il protocollo qui descritto, sono un valido strumento per verificare cellularepurezza isolate colonie CE di questi topi mostrano durevole e brillante fluorescenza ZsGreen nella cultura.

Introduzione

Le cellule endoteliali (EC) sono essenziali durante lo sviluppo di tumori solidi. Da inizio dello switch angiogenico nei tumori dormienti per la diffusione e la semina delle metastasi a siti distanti, CE formano i condotti che forniscono sangue, ossigeno e sostanze nutritive per sostenere la crescita del tumore 1. Come recentemente suggerito, CE hanno anche funzioni di perfusione indipendente e formano una nicchia che supporta la crescita delle cellule staminali del cancro e di altre cellule stromali del tumore 2-5. Così, altamente purificato CE (TCE) per la cultura in vitro tumore-specifica permette di studi funzionali di routine che faranno luce sui meccanismi molecolari che mediano l'angiogenesi tumorale e diafonia con le cellule tumorali.

CE sono altamente specializzata a seconda del tessuto di origine 6. A causa della natura eterogenea dei diversi tipi di tumore e il microambiente tumorale, TEC può anche visualizzare le caratteristiche uniche che riflettono un tumore-specifica specializzazione of il sistema vascolare. Ad esempio, vi è la variabilità sorprendente nelle firme di espressione genica nel TEC isolate da diversi tipi o categorie di tumori 7,8. Tuttavia, frequenti co-purificazione di non CE, in particolare fibroblasti associati al tumore e le cellule tumorali, con TEC può confondere le analisi di espressione su scala genomica. Questi tipi di cellule indesiderate sono particolarmente problematico in studi che si basano su a lungo termine in espansione in vitro di culture TEC.

Descritto qui è un metodo ad alta fedeltà che produce costantemente le colture pure CE da tumori e di altri tessuti. A seguito di colonna immunomagnetica arricchimento delle frazioni e la rimozione di co-purificato non CE CE, un passo clonazione anello aggiuntivo per catturare colonie puri CE viene utilizzato 9. Ogni colonia può essere espansa in coltura per più passaggi, senza l'emergere di contaminazione non CE. Questo metodo produce anche più cloni CE da una singola procedura di isolamento, che è ideale per lo studio di endoeterogeneità thelial. Inoltre, è dimostrato che Cdh5 cre: / l topi ZsGreen l / s giornalista sono uno strumento prezioso per la generazione EC "destino-mapped" e indelebilmente marcato che mantengono ZsGreen fluorescenza nella cultura 10. Con piccole modifiche al protocollo, questo metodo dovrebbe essere adattabile a diversi tipi di tumore o tessuti normali.

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Protocollo

Il protocollo che segue è effettuata secondo le linee guida stabilite dal Dipartimento di Medicina di Laboratorio animali presso la University of North Carolina a Chapel Hill.

1. Preparare il seguente materiale e reagenti prima di iniziare

  1. Preparare supporti CE, completandola 400 ml glucosio basso (1 g / l D-glucosio o LG) Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) con 50 ml di siero fetale bovino inattivato al calore, 50 ml di Nu-Siero IV, 5 ml di antibiotico-antimicotico, e la hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, e componenti eparina dal kit commerciale.
  2. Preparare 500 ml FACS tampone (0,5% BSA e 2 mM EDTA in PBS); filtrare attraverso una sterile 0,22 micron coppa del filtro.
  3. Sterilizzare o disinfettare dissezione bordo.
  4. Sterilizzare perni dissezione, forbici chirurgiche e dissettori.

2. Isolamento CE (1 ° giorno, ~ 5 ore)

  1. Euthanize mouse con anidride carbonica o altri metodi di spirito compatibileh la cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) politiche.
    Nota: Più tumori mammari di dimensioni variabili (5 - 15 mm di diametro) possono sviluppare in un singolo mouse geneticamente modificati come C3-Tag, assicurarsi di raccogliere tutti loro per l'isolamento TEC. Se si utilizza tumori che sono ortotopicamente innestato nei topi, piscina due o tre 1 centimetro 3 tumori per un singolo isolamento CE. Qui usiamo tumori mammari come dimostrazione, ma il protocollo può essere modificato per altri tipi di tumori.
  2. Disinfettare topo nebulizzare o passare la parte ventrale mouse con ampie quantità di 75% v / v di etanolo.
  3. Resecare tumori con un paio di forbici e dissettori utilizzando tecniche asettiche in una cappa sterile o in un banco pulito.
    1. Stendi e pin le membra del mouse su una scheda di dissezione. Effettuare una incisione ventrale linea mediana con le forbici senza aprire il peritoneo. Sezionare lateralmente tra la pelle ed il peritoneo verso le ghiandole mammarie in cui si trovano i tumori.Non aprire il peritoneo.
    2. Accise solo tessuto tumorale dalle ghiandole mammarie, lasciando fuori normali margini mammarie. Rifilare con cura off tessuti non tumorali, come la pelle ei muscoli, e il luogo tumori sezionato in una provetta contenente 30 ml di LG-DMEM su ghiaccio.
  4. Portare campioni di tumore alla cappa coltura di tessuti; lavare i tessuti con sterile LG-DMEM 1 - 2 volte.
  5. Trasferire i tumori del tubo conico di una capsula di Petri tessuto-cultura sterili, aggiungere 2 ml di LG-DMEM nel piatto, e tritare con un paio di forbici sterili in pezzi <5 mm.
  6. Aggiungere 5 ml di collagenasi (magazzino = 2 mg / ml in soluzione salina bilanciata di Hank, seguito HBSS), 1 ml di dispasi (magazzino = 2,5 U / ml in HBSS) e 75 ml di deossiribonucleasi (magazzino = 1 mg / ml in PBS ) nella capsula di Petri. Il volume totale è ora ~ 10 ml.
  7. Trasferire il mix collagenasi / tessuto dal capsula di Petri di un tubo di tessuto-dissociatore ed eseguire su un dissociatore tessuto per 60 secondi per due volte (pre-impostato di dissociazione prOgram sul dissociatore: 1.270 giri totali per corsa). Incubare con la luce agitando su un agitatore per 75 min a 37 ° C.
  8. Filtro digerito tessuto attraverso un colino cella 100 micron su una provetta conica da 50 ml. Filtro Sciacquare con 5 ml di tampone FACS per lavare tutte le cellule rimanenti. Spin a 280 xg per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
  9. Diluire 1 ml di brodo RBC tampone di lisi (10x) in 9 ml di acqua sterile. Lisare globuli rossi con 10 ml di tampone di lisi (1x), e subito girare 5 min a 280 x g. Nota: Questo passaggio può essere saltato se po 'di sangue è visibile.
  10. Risospendere in 10 ml di tampone FACS. Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di trypan blu, e contare le cellule vive con un emocitometro.
  11. Risospendere le cellule a ~ 10 7 cellule / 100 ml. Aggiungere 10 ml di FcR blocco per 100 ml di sospensione cellulare e incubare in ghiaccio per 10 min.
  12. Aggiungere anticorpi CD31 ratto anti topo PE coniugato secondo. alla Tabella 1 Incubare in ghiaccio per 10-15 minuti e tubo flick di tanto in tanto.
  13. Aggiungere 10 ml di tampone FACS al tubo e girare a 280 xg per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante, e lavare il pellet cellulare nuovo con 5 ml di tampone FACS. Centrifuga a pellet cellule. Aspirare il surnatante senza pellet inquietante.
  14. Aggiungere FACS tampone e anti-PE microsfere secondo la Tabella 2 Incubare in ghiaccio per 10 -. 15 min. Flick tubo di tanto in tanto.
  15. Aggiungere 10 ml di FACS tampone e di spin campioni a 280 xg per 5 minuti; Risciacquare una volta con 5 ml di tampone FACS e centrifugare nuovamente. Aspirare il surnatante senza disturbare pellet.
  16. Portare il volume a 300 ml in tampone FACS. Spin attraverso 35 micron cellula-filtro ricoperto tubo 5 min a 280 x g. Utilizzare 2 tubi e un volume maggiore, se necessario.
  17. Impostare multistand magnetica e colonne magnetici in cappuccio, collegare una colonna al separatore ed equilibrare la colonna con 2 ml di tampone FACS.
  18. Aspirate il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 - 1 ml di tampone FACS.
  19. Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica equilibrata.
  20. Lavare la colonna tre volte con 2 ml di tampone FACS, e raccogliere flow-through (FT) in un tubo di 15 ml (frazione FT).
  21. Prendere colonna fuori il separatore ed eluire con 2 ml di tampone FACS in un altro tubo 15 ml (frazione di eluato). Utilizzare stantuffo per garantire tutte le cellule sono fuori dalla colonna. Ripetere la eluizione altre due volte con 2 ml di tampone FACS ogni volta.
  22. Spin l'eluato a 280 xg per 5 min.
  23. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di media CE.
  24. Altrettanto dividere la frazione di eluato (~ 6 ml) in 10 piatti cm rivestiti di gelatina. Per tre 1 cm 3 tumori, le cellule piastra eluita in almeno quattro piatti. Cellule alternativa, piatto eluito a diverse concentrazioni in più lastre (ad es., Seminare 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml e 3 ml di eluato in quattro piatti) per garantire che unat almeno una piastra è scarsamente seminato con le cellule eluite. Verificare che la confluenza delle cellule attaccate è ~ 1% il giorno dopo (cioè, circa 1,0 - 2,0 x 10 5 cellule allegate).
    Nota: le cellule devono essere placcato sparso in modo che le colonie CE possono formarsi senza essere contaminato da altri tipi di cellule.
  25. Piastra frazione FT in un piatto 10 centimetri di lasciare le cellule recuperare O / N. Controllare che il piatto è 80-100% confluenti il ​​giorno successivo. Congelare le cellule (-80 ° C) a 250 supporti cellulari congelamento microlitri in un cryotube e conservarli in azoto liquido il giorno successivo. Nota: frazione FT può essere utilizzato per l'isolamento delle cellule tumorali in una fase successiva e / o come controllo negativo per l'analisi di espressione genica CE dei cloni isolati CE.
  26. Modificare i media ogni 2 - 3 giorni. Colonies cominciano a formarsi dopo 7 - 10 giorni. Colonie piccole CE possono essere individuati prima giornata 3. Mark le colonie con un pennarello fine punta sul fondo del piatto.
  27. Raschiare non specifico cells circondano le colonie identificate con una sterile, punta Pippet 200 microlitri.

3. Colony selezione Anelli Usare Clonazione

  1. Modificare i media ogni 2 - 3 giorni. Purezza CE può essere controllato da LDL (DII-Ac-LDL), oltre a circa 5-7 giorni. Aggiungere 50 ml di LDL per 10 ml di mezzo CE e incubare per 3-4 ore prima di controllare le cellule al microscopio a fluorescenza.
    Nota: Multiple LDL + cloni CE possono essere osservati a ~ 7 giorni.
  2. Inizia la raccolta colonie CE quando raggiungono diametri di 3 - 5 mm di dimensione. (Scegliere grandi colonie che sono pieni di piccoli LDL + cellule per ottenere i migliori risultati.)
  3. Prima della raccolta CE con anelli di clonazione, pre-coat alcune 6 pozzetti con 0,5% di gelatina. Aspirare gelatina, aggiungere 2 ml di media CE per ogni bene, e tenere le piastre in un incubatore fino al momento.
  4. Raschiare non CE sui bordi delle colonie per assicurarsi che non altri tipi di cellule saranno intrappolati all'interno dell'anello clonazione.
  5. Utilizzando unmicroscopio a contrasto di fase (4X o 10X obiettivo), contorno con un pennarello fine-tip sul fondo del piatto cultura delle aree contenenti colonie CE.
  6. Lavare la piastra con 10 ml di PBS e lasciare uno strato molto sottile di PBS nella piastra durante l'aspirazione. (Importante: una piccola quantità (~ 0,5 ml) di PBS manterrà cellule vive durante la procedura di clonazione-ring, anche, tessuto adesivo ha bisogno di acqua per legare.)
  7. Scegliere un anello di clonazione di dimensioni adeguate. Utilizzare un paio di dissettore a prendere un anello, e con una punta di pipetta 10 microlitri uniformemente applicare una piccola quantità di tessuto adesivo sull'anello clonazione.
    Nota: utilizzare solo minima quantità (~ 0,2 microlitri per un piccolo anello) di tessuto adesivo su anelli di clonazione, e assicurarsi che il tessuto adesivo è distribuito in modo uniforme intorno alla superficie di fondo per garantire una buona tenuta. Tessuto adesivo eccessivo produce calore e forma film che possono uccidere le cellule.
  8. Posizionare l'anello di clonazione sopra la colonia CE. Premere delicatamente verso il basso l'anello di clonazione per incollare i ring sul piatto. Assicurarsi che le colonie non sono asciugato prima di incollare l'anello.
  9. Immediatamente pipettare 25 ml di soluzione di distacco delle cellule enzimatica sul ring clonazione e incubare ~ 1 min o fino a quando le cellule sono vagamente collegati.
  10. Cellule pipetta sul ring clonazione goccia a goccia in un pozzetto di un 6-pozzetti contenenti supporti CE pre-riscaldato. (Importante: Non agitare la piastra per disperdere le cellule, CE preferiscono crescere in ammassi stretti.) Lavare l'anello di clonazione con 50 - 100 supporti CE microlitri di raccogliere il maggior numero di cellule possibile e trasferire tutti i lavaggi nello stesso 6-bene .
  11. Se alcune colonie nel piatto 10 centimetri sono troppo piccoli per raccogliere, aggiungere 10 ml di mezzi freschi, lasciare che le colonie crescono per qualche giorno in più, e ripetere la procedura di clonazione anello.
  12. Crescere colonie raccolte in 6 pozzetti fino a 80-100% confluenti, e il trasferimento di cellule a 3 pozzetti di una 6-pozzetti, prima di espandersi in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Raschiare le cellule contaminanti. Ripetereun altro giro di procedura anello clonazione (i passaggi 3,5-3,10) se necessario. Mantenere le cellule relativamente confluenti (~ 60 - 70%) durante l'espansione. CE può smettere di crescere se placcato troppo scarsa.
  13. Caratterizzare CE da FACS, la colorazione, la PCR, ecc Si noti che Dil-Ac-LDL è fluorescente e può interferire con PE o altri anticorpi fluorescenti per FACS.

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Risultati

CE rappresentano soltanto una frazione minore della popolazione cellulare totale nella maggior parte dei tessuti adulti 11. È quindi importante digerire completamente il tessuto raccolto in una cella singola sospensione che assicura il rilascio massimo CE da matrice extracellulare (ECM) e dei tessuti connettivi. Nella nostra esperienza, la selezione immunomagnetica CD31-mediata prevede solo arricchite, ma non puri frazioni CE; Pertanto, un altro passo fondamentale è la rimozione fisica di co-purificata non ...

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Discussione

A causa delle difficoltà di ottenere colture TEC primaria pure, molti studi in vitro TCE sostituto con le linee disponibili in commercio CE o primaria CE, come vena ombelicale umano CE (HUVEC) 13. Tuttavia, queste popolazioni CE dai tessuti normali possono servire solo come un proxy per TEC che si differenziano nettamente dalle loro controparti normali. Ad esempio, TEC sono fenotipicamente e funzionalmente anormale in vivo e alcune di queste anomalie può essere trasmissibile in vitro

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-Antimycotic Sigma-AldrichA5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)Gibco11885-084
EGM-2 Bullet Kit LonzaCC4176Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)Thermo ScientificSH30071.03Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IVCorningCB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)Gibco14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-144
FACS buffer 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads Miltenyi Biotech130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%Gibco15260-37
Cell freezing media (Bambanker)Wako Chemicals302-14681
Collagenase type II  Worthington BiochemicalLS004176Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)Worthington BiochemicalLS002004Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDLBiomedical TechnologiesBT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0Cellgro46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)Sigma-AldrichA6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture gradeSigma-AldrichG1393-100MLDilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotech130-092-575
Neutral protease (Dispase)Worthington BiochemicalLS02104Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibodyBD Pharmingen553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)BD Pharmingen555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 % Life Technologies15250-061
10 mm tissue culture dishesCorning
15 ml conical tubes (sterile)Corning
50 ml conical tubes (sterile) Corning
6-well tissue culture platesCorning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) Miltenyi Biotech130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)Miltenyi Biotech130-042-302
Cell strainer 100 μm Corning352360
Cloning rings (assorted sizes)Bel-Art Products378470000
CryotubesThermo Scientific
Dissecting boardSterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use 
Dissecting forceps and scissorsSterilize before use 
Dissecting pins 2"Sterilize before use 
FACS tubes with 35 μm filter capCorning352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)MilliporeSCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
Magnetic MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)3M1469SB
CentrifugeEppendorf5810ROr a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)Miltenyi Biotech130-093-235Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation 
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope

Riferimenti

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