Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumen

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Resumen

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.^1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.^4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Introducción

El propósito general de este procedimiento es la rápida cuantificación de la situación energética de C. elegans in vivo con el fin de utilizar esto como un punto final en el cribado del compuesto. El fundamento se basa en la expresión transgénica de la luciferasa de luciérnaga en el nematodo C. elegans ^{desde 1 hasta 3} a través de la plásmido pSLGCV ⁽¹ https://www.addgene.org/49862). La enzima luciferasa se fusiona con el verde fluorescente GFP proteína y se expresa constitutivamente y de forma ubicua en el citoplasma (se retiró el peroxisoma luciferasa señal de orientación). Esto conduce a la emisión de luz cuando el sustrato luciferina se proporciona de forma exógena. A medida que el tornillo sin fin es transparente, la luz puede medirse en un luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustibles ATP celular la reacción de bioluminiscencia y su disponibilidad determina los niveles de luz producidos. En consecuencia, luminometría ofrece una convenient significa evaluar los niveles relativos de la ATP y por extensión de la función mitocondrial, ya que la producción de ATP se produce principalmente en las mitocondrias. Un enlace entre los niveles de función y de bioluminiscencia mitocondriales ha sido previamente demostrada a través del silenciamiento de genes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales y concomitante salida de luz reducida. ¹

Las cepas de bioluminiscencia generados fueron designados PE254 (feIs4) y PE255 (feIs5) ¹ (véase la lista de materiales) y se puede utilizar indistintamente. ³ Un número de estudios han utilizado estas cepas de sensores para informar sobre los niveles celulares de ATP in vivo tras la exposición a diversos productos químicos xenobióticos tales como azida de sodio ^1, cadmio ^2, las aguas residuales extracto de lodos ^3, 5'-fluoro-2-desoxiuridina ^6, y una nitrosamina específica del ^tabaco-7. Las cepas también han sido útiles para controlar los efectos de la exposición a la radiación ultravioleta C ^{8 y los efectos de la interrupción de la función de la cadena respiratoria mitocondrial. 1,9 Una primera versión del sensor de luminiscencia que expresa el gen de la luciferasa sin una fusión GFP (PE39) también se ha utilizado en la investigación de los efectos de los metales pesados ​​y de un respiratoria . desacoplador 10 cepas PE254 y PE255 llevan la luciferasa: GFP fusión y GFP fluorescencia ha demostrado aumentar proporcionalmente con la masa de nematodos, que ofrece un medio conveniente para la normalización de los valores de luminiscencia 6,9 Los efectos de la cantidad diferencial de los gusanos por así también pueden ser. tenido en cuenta al incluir múltiples repeticiones técnica en el ensayo (un mínimo de 5 pozos por condición). 3}

El protocolo ofrece la posibilidad de monitorización in vivo de los niveles de energía (en comparación con más técnicamente laborioso in vitro determinaciones de ATP) que permite la investigación de compuestos y reposicionamiento en el contexto fisiológico de toda una muorganismo lticellular. El procedimiento se puede extender a una variedad de orígenes genéticos de cruzar el transgén cromosómicamente integrados en cepas mutantes disponibles y / o por silenciar genes mediante ARN de interferencia; por lo tanto, aprovechando al máximo C. elegans como organismo modelo. El método debe ayudar a reducir la pérdida de fase tardía de candidatos a fármacos debido a la toxicidad mitocondrial y hacer una contribución a la reducción de la experimentación con animales superiores.

Protocolo

NOTA: Llevar a cabo todas las medidas en condiciones estériles (gabinete de flujo laminar) y con materiales de pre-esterilizados en autoclave (126 ° C, 11 min). Una placa de LB con rayas cabo E. coli OP50 mantiene a 4 ° C se requiere, raya a cabo en placas de LB fresco y restreak cada mes.

1. bacteriana Alimentos (Escherichia coli OP50) Preparación

1. Día 1. Inocular 2 x 5 ml de LB en dos botellas universales con una sola colonia de E. coli OP50 y colocar en agitación incubadora a 37 ° C (220 rpm) durante 8 horas.
2. Después de 8 horas de incubación, utilice 2 ml de E. coli OP50 LB cultivo para inocular cada uno de 3 x 200 ml LB. Frascos lugar en agitación incubadora (220 rpm) O / N (17 horas) a 37 ° C.
3. Pesar 20 x 50 ml tubos de centrífuga y escribir peso en el tubo.
4. Día 2. Con una pipeta serológica, alícuota de 30 ml de O / N E. cultura coli OP50 en el pre pesaba tubos de centrífuga. Centrifugar a 7.741 xg, 10 ° C, 8 min.
5. Decantar cuidadosamente el sobrenadante, mantenga el tubo invertido con tapa y dejar reposar durante unos minutos. Con una pipeta eliminar cualquier exceso de sobrenadante que haya quedado en la tapa. Pesar el tubo y calcular el peso de la pastilla.
6. Calcular el volumen necesario para proporcionar una suspensión de 30 g / L y marcar este volumen en el tubo. Tubos de fecha, etiqueta y lugar a -20 ° C para su uso dentro de 1-3 meses o al - 80 ° C si va a guardar por más de 3 meses.
7. Preparar suspensión bacteriana para el cultivo de nematodos; permitir sedimento bacteriano para descongelar y añadir volumen requerido de S completa medio ^11,12 a cada tubo y agitar suavemente para resuspender de pellets, los contenidos de la piscina de los diferentes tubos para obtener el volumen requerido. Trabajar en condiciones estériles.

2. Elaboración de Normas de la droga en un formato de placa de 96 pocillos

NOTA: Si utiliza una biblioteca de drogas, placas de drogas se proporcionan en una solaconcentración de compuesto en DMSO. Cribado primario pondrá a prueba los compuestos a una sola concentración. Siga las instrucciones para la preparación de la placa de la droga para la prueba confirmatoria compuesto en un rango de concentraciones entre 0-160 M, seleccionado después de significación estadística a los 10 M. Los pasos siguientes pueden ser adaptados para probar otras concentraciones.

¡CUIDADO! Siga las precauciones necesarias para el manejo de medicamentos (por lo general frente a la máscara, gafas de seguridad, guantes son requeridos).

1. Prepare la placa de drogas con las normas para el cribado de confirmación de trabajo: Pesar la cantidad requerida de compuesto en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml estéril y preparar el compuesto 16 mM en DMSO (es decir, 100x concentró relación a la concentración deseada para la parte superior de la exposición).
2. Diluir en serie de stock 16 mM 1: 2 en DMSO para obtener 8, 4, 2, 1, 0,5 y 0,25 mm (estándares condiciones estériles). Estos son 100x concentrados y se diluyen a concentraciones finales de 0 (sólo vehículo),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 micras (en 1% de DMSO) durante la exposición al fármaco.
3. En una cabina de flujo laminar, coloque el 20-50 l por pocillo de las normas de compuestos dentro de una columna de una placa de 96 pocillos, por ejemplo posición de la placa A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: drogas 0,25 mM y H1: DMSO. Utilice diferentes columnas para la serie de dilución de diferentes drogas.
4. Alícuota de vehículo a los pocillos de la columna 12 en la placa de drogas.
   NOTA: Esto facilitará las pruebas de control del vehículo por columnas, además de la prueba a lo largo de la fila H, asegurándose de que el vehículo se pone a prueba en puestos representativos de toda la placa.
   NOTA: Cada placa de drogas para el cribado de confirmación contiene series de dilución para un máximo de 11 fármacos diferentes para ser probados más el control del vehículo.
5. Etiqueta y placa de sello, cubrir con papel de aluminio y lugar a -20 ° C hasta su utilización.

3. Experimentos de nematodos

NOTA: Llevar a cabo todas las medidas under condiciones estériles, asépticamente y con materiales de pre-esterilizados y reactivos. Mantener C. elegans cepas de forma rutinaria en placas de NGM con E. coli OP50. ¹² horarios propuestos para las diferentes etapas de protocolo se presentan en la Tabla 1.

1. Día 1 de tareas: configurar cultivo líquido de la cepa biosensor para la sincronización posterior.
   1. Recoger nematodos de una placa de NGM 6 cm (con un montón de larvas jóvenes donde la comida acaba agotado) en 2 ml S completa y transferir al frasco con 30 g / L E. coli OP50 en S completa (volumen total de 30 ml en un matraz de vidrio cónica capacidad de 250 ml). Incubar 3 días a 20 ° C, 160 rpm.
2. Día 4 tarea (permita aproximadamente 30 a 35 min): la cultura de lejía para cosechar huevos y sincronizar población de gusanos. Llevar a cabo todas las etapas de centrifugación durante 1 minuto, 600 x g.
   1. Preparar una solución de cloro antes de su uso: para cada 16 ml de 0,156 M de KOH / NaOH añadir 4 ml de lejía.
   2. Vierta 2 x 14 mlcultura gusano en 15 tubos de centrifugación cónicos ml. Permitir que los gusanos se asienten por gravedad (3 min). Retire y deseche líquidos nematodos anteriormente establecidas. Añadir 5 ml de solución de cloro a cada tubo y empezar temporizador. Combinar los volúmenes en un solo tubo.
   3. Invierta tubo suavemente durante 2 minutos, revise debajo estereoscopio para la ruptura de los gusanos y la liberación de huevos en suspensión. Cuando la mayoría de los huevos son puestos en libertad o en un tiempo máximo de 2 minutos en la solución de cloro, centrífuga.
   4. Aspirar el sobrenadante con cuidado. Lavar 1x pellets con 14 ml S completa y centrifugar.
   5. Descartar el sobrenadante, añadir solución de cloro de 10 ml y se inicia el temporizador (esta segunda etapa de blanqueo se asegura de que la mayor parte de los cadáveres de gusanos se desintegran y ya no se ve bajo estereoscopio). Después de un tiempo máximo de solución de cloro de 2 minutos, centrifugar.
   6. Lavar pellet 3x en S completa, decantar con cuidado el sobrenadante y pellet se resuspende en 14 ml S completas después de cada centrifugación. Después de lavado final, pellet huevo resuspender en 14 ml S completa.
   7. Transferir el volumen a un matraz de vidrio cónico. Incubar 18-24 de hora a 20 ° C, 160 rpm.
      NOTA: Cosechado huevos eclosionan O / N y detienen el desarrollo en el primer estadio larval (L1), debido a la falta de alimentos, de ahí van a estar todos en la misma etapa de crecimiento.
3. Día 5 tareas: configurar culturas gusano sincronizados para los ensayos de la droga.
   NOTA: Worms suspendidas en medio de inanición tienden a adherirse a las superficies de plástico hidrófobos tales como puntas de pipeta y tubos. 0,01% de Tween-20 es un agente tensioactivo utilizado aquí para hacer que las superficies de plástico más hidrofílico y permitir una mayor precisión en el conteo (0,01% de Triton-X100 también se puede utilizar). Cuando los nematodos se encuentran en el medio suplementado bacteriana, que no tienden a pegarse al plástico.
   1. Determinar el número de sombreados de L1 en el frasco, mantenga frasco de agitación plataforma (160 rpm).
      1. Tome 3x 100 muestras mu l del frasco (utilizar una punta limpia cada vez) en distintos ml microtubos de 1,7 con 900 l de líquido medio 0,01% de Tween-20.
         NOTA: Aspire 100 l de muestra en la punta limpia sólo una vez. Luego, cuando la dispensación, la pipeta hacia arriba y abajo un par de veces en el medio entre complementado para liberar cualquier gusanos que se adhieren a la punta.
      2. Cuente los nematodos en 4x 10 l gotas de cada tubo de dilución por triplicado. Calcular el valor medio y estimar el número de gusanos presentes en el frasco de vidrio cónico.
   2. Calcular el volumen de tramado suspensión de nematodos necesaria para configurar una cultura 2 x 20 ml con 10 nematodos por 10 l. Aumentar el volumen calculado en un 10% para dar cuenta de cierta pérdida de nematodos posterior durante las etapas de centrifugación.
   3. Decantar el volumen requerido en 2 x 15 ml tubos de centrifugación (pre-pesado). Pesar tubos para obtener volumen real dispensado, vórtice suavemente y ajuste para apuntar volumen eliminando el exceso de volumen con una pipeta de 5 ml (sólo la punta estéril debe entrar en el tubo).
   4. Invente volumen a 14 ml con S frescas completas fueh nematodos. Centrífuga (1 min, 600 g). Retirar y desechar el sobrenadante con cuidado de no alterar el sedimento de los nematodos.
   5. Añadir 5 ml de S completo con 30 g / L E. coli OP50 a los nematodos sedimentadas. La transferencia de los 5 ml en cada tubo a un matraz cónico de vidrio de 15 ml que contiene S completas con 30 g / L E. coli OP50. Nota por nematodos tiempo se proporcionaron primero con los alimentos.
   6. Agitar frasco suavemente (160 rpm), tome 9 x 10 l gotitas sobre portaobjetos microscópicos (utilizan puntas frescas cada vez) para contar los nematodos y confirman promedio de aproximadamente 10 (± 2) por 10 l.
   7. Coloque matraces de agitación de nematodos en incubadora a 20 ° C, 160 rpm durante 42 a 44 hr.
4. Día 7 de tareas: los nematodos de transferencia a placas de 96 pocillos e iniciar la exposición al fármaco.
   1. Combine culturas de nematodos en un solo frasco, mantener remolinos frasco suavemente y colocar 3 x 4 ml de cultivo de nematodos en un 60 ml cubeta estéril. Coloca a través de una plataforma de agitación (160 rpm).
   2. Uso 8 channel pipeta para alícuota de 25 mu l nematodos en suspensión por pocillo de 96 placas de microtitulación y negro con un fondo plano transparente (para la toma de ambas lecturas de luminiscencia y fluorescencia, o placas blancas para luminiscencia solamente). Cubra con una tapa de placa y dejar de lado.
      1. Después de puesta en marcha de cada 2 placas, colocar otros 2 x 2,5 ml nematodos en el canal para reemplazar el volumen perdido (mantener un "volumen muerto" en el canal de aproximadamente 7 ml).
      2. Establecer 13/14 placas con nematodos. Se requerirán 11 placas de nematodos para probar dos placas de drogas 96 pocillos. La placa de nematodo 12 ^TH será cargado exclusivamente con el vehículo como control. La ^TH placa 13 se utiliza para establecer la fluorescencia de fondo en día 8 (véase más adelante). Un plato extra puede ser preparado para su uso deben producirse errores durante la puesta en marcha.
   3. Alícuotas de 74 l de S completos para cada plato bien y colocar en una cámara húmeda (véase la lista de materiales) en una incubadora de agitación (20 ° C, 160 rpm) until listo para los compuestos de ensayo alícuota en el momento del desarrollo preseleccionado (por ejemplo, 45 horas 30 minutos después de la comida incluida). [Volumen por pozo es ahora 99 l].
   4. Descongelar placa (s) de drogas a prueba.
   5. Utilice una pipeta multicanal para crear placas de nematodos con la droga, cambiar las puntas cada vez. Permitir 5 min por placa de 96 pocillos de alícuotas de drogas.
      1. Tome 1 l de 1 columna ^st de la placa de drogas y añadir a las columnas 1-5 de una placa que contiene los nematodos; repetir desde la columna ² da en la placa de la droga en las columnas 8-12 de la placa que contiene los nematodos. Añadir 1 l de vehículo para las columnas 6 y 7 de la placa de nematodos.
         NOTA: El volumen total por pocillo en la placa de nematodo será 100 l que resulta en una dilución 1: 100 de compuesto / vehículo.
      2. Repita el proceso mediante la adición de 1 l de / ^4ª columna de ^la 3ª de la placa de la droga a las columnas 1-5 / 8-12 de la segunda placa de nematodos; añadir vehículo para las columnas 6 y 7 de la placa de nematodos.
      3. Continuar para probar columnas de placas de drogas restantes. Establecer un mínimo de una placa de nematodo con el vehículo en todos los pozos mediante el muestreo de la columna 12 de la placa de drogas. Coloque las placas traseras en cámaras húmedas en agitación incubadora (20 ° C, 160 rpm) durante 20 a 22 horas (ver nota para el día 8).
   6. Part-preparar el tampón de luminiscencia para el día siguiente: añadir DMSO y 10% de Triton-X-100 hasta el volumen requerido de S completa para obtener 1% de DMSO y 0,15% de Triton X-100. Permitir 5 ml por placa de lectura de luminiscencia, además de 1 ml para el cebado del inyector luminómetro.
5. Día 8 de tareas: Leer extremos experimentales - fluorescencia y bioluminiscencia. (Lecturas de la fluorescencia de GFP se recomiendan como un medio para normalizar los datos de bioluminiscencia.)
   NOTA: Apunte a leer los puntos finales por 66 a 67 horas después de los alimentos suministrados a los nematodos con el fin de prevenir la producción de progenie significativa en las condiciones experimentales descritas.
   1. Configure la placa que se utiliza como control de fondo para las lecturas de las buenas prácticas agrarias. Combine así contenidos de ¹³ de la placa en un tubo de 15 ml. Permitir que los nematodos se asienten (2-3 min). Use el sobrenadante para cargar una microplaca (negro con fondo transparente) con 100 suspensión bacteriana l por pocillo.
      1. Observar la placa de control de fondo bajo el microscopio anotando pozos donde los nematodos se pueden ver. Excluir estos de la estimación de fondo utilizado en el análisis posterior de los datos.
   2. Leer la fluorescencia de cada placa de 96 pocillos, incluyendo el control de fondo. (Ajustes: la óptica de fondo de la placa; filtros de excitación 485/20; 528/20 emisión.)
   3. Preparar tampón para las lecturas de luminiscencia: añadir luciferina (20 mM) a la parte preparada tampón (desde el día anterior), para obtener tampón de luminiscencia con 1% de DMSO (1x), 0,15% de Triton-X100 luciferina (3x) y 0,3 mM (3x ). Primer luminómetro 6x inyector con 150 l de tampón de luminiscencia.
      1. Paso anterior supone un 1% DMSO como vehículo durante la exposición al fármaco. Cuando el vehículo es agua, ajustar el concentration de DMSO en tampón de luminiscencia a 3% (es decir, 3x).
   4. Trabajar con una placa a la vez. Dispensar 50 l de tampón de luminiscencia por pocillo. (150 l de volumen final en bien; dilución 3x de tampón luminiscencia: 1% de DMSO, 0,05% Triton-X100 y 0,1 mM concentraciones luciferina finales.) Coloque inmediatamente sobre sacudiendo plataforma y comenzar temporizador.
      1. Después de 3 minutos de agitación plataforma (160 rpm), lee la luminiscencia (1 seg por medición).

Análisis 4. Datos

1. Restar media de fondo GFP lectura de los resultados de fluorescencia. Divida por bioluminiscencia respectiva lectura GFP.
   1. Cuando se detecta un alto valor de GFP para los nematodos expuestos a un compuesto, medir la fluorescencia del compuesto por sí mismo para tener en cuenta cualquier compuesto de fluorescencia. Si superior a la media, utilizar esto como el fondo en su lugar.
2. Bioluminiscencia Express, GFP normalizado bioluminiscencia unND datos de fluorescencia de GFP como un porcentaje del valor medio para el control del vehículo en cada placa.
3. Trazar valores promedio y las barras de error para cada concentración.
4. Prueba de significación estadística utilizando 2-análisis de varianza (ANOVA) con efectos de 'concentración', 'Experiment' y su interacción (cada punto de datos se refiere a un solo pozo), y el uso de la prueba de Dunnett como prueba post-hoc (vs . control del vehículo).
   NOTA: Si el "experimento" o los términos "interacción" son significativos, experimentos adicionales pueden ser necesarias para confirmar la respuesta. Donde no hay variabilidad entre los experimentos se desprende de la observación de los gráficos de datos, un ANOVA de una vía se puede realizar en los datos agrupados de experimentos independientes.
   1. Para el análisis estadístico de la placa (s) con sólo el vehículo, seleccionar todos los pocillos en las columnas 6 -7 y todos los pocillos en la fila H como grupo de control (éstas son las posiciones asignadas de forma rutinaria al vehículo durante las pruebas de compuesto).

Resultados

Los resultados representativos para ilustrar el método se obtuvieron para rotenona (Figura 1), paraquat (Figura 2), el oxalacetato (Figura 3), y 4 compuestos que fueron recogidos como inhibidores de la luciérnaga luciferasa durante el cribado de una biblioteca de medicamentos ¹³ (Figura 4). La exposición al fármaco se inició en la etapa L4 en todos los casos, pero los experimentos de exposición de paraquat se comenzó a las 41 horas después de la comida proporcionada primero a los nematodos en comparación con, 45-46 h para los otros compuestos. El protocolo permite un grado de flexibilidad en la selección de tiempo para el inicio de la exposición al fármaco y la duración de la exposición. Sin embargo, para fines de selección, establecer tiempos deben ser atendidas una vez seleccionado, para la reproducibilidad entre los experimentos. Los puntos finales deben ser medidos por de 66-67 hr tiempo de desarrollo con el fin de prevenir extensa puesta de huevos y eclosión de la progenie en los pozos. Directrices para los tiempos se proporcionan en Tpoder 1.

Rotenona, un complejo I mitocondrial inhibidor, reduce la bioluminiscencia después de que ambos relativamente cortos (2 hr) y más largas exposiciones (24 hr) a un rango de concentraciones (Figura 1). En este caso, no se tomaron medidas de buenas prácticas agrarias, pero el número de repeticiones técnica utilizados (n = 6) es suficiente para igualar las diferencias en los números de gusano entre los pozos ^3. La exposición de 24 horas es una ventana de tiempo durante el cual crecen los nematodos, y el desarrollo más lento como consecuencia de la inhibición del complejo I se espera que contribuyan a la disminución de la bioluminiscencia. Esto fue confirmado por la observación visual bajo estereoscopio con retraso en el desarrollo visto, en particular en concentraciones de 20 mM y superiores; además algunos letalidad se observó a partir de 40 M (observaciones cualitativas no cuantificados). No letalidad se observó después de la exposición de 2 horas, pero se observaron efectos sobre el movimiento de gusano. Una fuerte caída de la bioluminiscencia en relación con los controles ocuRRed a la concentración más baja de rotenona probados 2,5 M, para la que no se detectaron efectos fácilmente por observación visual rápida en 2 h de exposición. Este descenso en la bioluminiscencia es consistente con la reducción de ATP celular. La inhibición máxima se logró con la concentración más baja de la rotenona utilizada (2,5 M) que indica que ningún experimentos posteriores dirigidas específicamente a la rotenona deben llevarse a cabo entre 0 y 5 mM [el intervalo de concentración desde 0 hasta 160 mM fue seleccionado como parte de una comparación con otros fármacos identificado inicialmente como tener efectos significativos en el 10 M (que se publicará en otros lugares)].

El herbicida paraquat afecta a la función mitocondrial a través del aumento de las especies reactivas del oxígeno. Aquí, nos demuestran su efecto sobre la bioluminiscencia de C. elegans cepa PE254 después de la exposición a un rango de concentraciones de 24 horas (Figura 2). Como la cepa lleva una luc :: fusión GFP, GFP fluorescencia fue del also mide como un medio de normalización. ^6,9 Paraquat disminuyó la bioluminiscencia, la fluorescencia de GFP y la bioluminiscencia normalizada de manera significativa. La prueba post-hoc de Dunnet indicó que las concentraciones de paraquat con diferencias significativas en relación con el control del vehículo eran 4 y 8 mM de bioluminiscencia y bioluminiscencia normalizado, así como 2 mM de bioluminiscencia normalizado. La única concentración que reduce significativamente la fluorescencia de GFP fue de 8 mm, una concentración en la que los efectos del crecimiento y el gusano muerto ocasional se observaron (observaciones cualitativas). La disminución de la bioluminiscencia (y bioluminiscencia normalizada) fue mayor que la de la fluorescencia, en consonancia con disminución de la función y los efectos sobre la producción de ATP mitocondrial.

El oxalacetato intermedio ciclo del ácido cítrico probado en C. elegans PE254 cepa a una sola concentración de 8 mM, condujo a un aumento en la bioluminiscencia (Figura 3). No es fluorescente GFPmediciones NCE se obtuvieron u observación visual adicional llevan a cabo; Sin embargo, tales respuesta a una única concentración merecería la exposición adicional confirmatorio para un intervalo de concentraciones, y las observaciones más detalladas de efectos. Una mejora de la bioluminiscencia por este compuesto no es sorprendente, ya que se puede postular a llevar a una mayor actividad del ciclo del ácido cítrico, con última instancia, una mayor producción de ATP (no obstante, sería conveniente para el control de los efectos sobre los niveles de luciferasa mediante la evaluación de la fluorescencia de GFP en experimentos posteriores). Los conjuntos de datos oxaloacetato muestran revelar el grado de variabilidad en la respuesta observada en los experimentos basados ​​en la luciferasa. En nuestra experiencia esta variabilidad es una característica del sistema de prueba en particular para las condiciones de exposición menos perjudiciales.

El compuestos inhibidores luciferasa de luciérnaga DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 y DDD00023047 se pusieron a prueba tanto in vitro examinado los efectos sobre el puenzima rified e in vivo usando el C. elegans luc: GFP expresando cepa. No hubo evidencia de que cualquiera de los compuestos ensayados causado la muerte de nematodos en las condiciones de exposición. Todos los compuestos 4 afectaron a la actividad de luciferasa in vitro a las 2 concentraciones ensayadas 25 y 100 mM (Figura 4A). DDD00001434 mató a la actividad de la luciferasa purificada casi por completo, lo que proporciona una justificación creíble para la gran disminución de la bioluminiscencia in vivo (Figura 4B). Aunque, la in vitro y ensayos in vivo no son directamente comparables, la respuesta a DDD00023047 fue similar en ambos ensayos. DDD0001477 y DDD00000635 causaron una mayor disminución en vivo que en in vitro. Estos compuestos fueron proporcionados a los gusanos vivos 22 h antes de sustrato luciferina, y los resultados pueden reflejar que no fueron desplazados fácilmente desde el sitio activo de la luciferasa cuando se convirtió en luciferina available. Alternativamente, DDD0001477 y DDD00000635 pueden tener un efecto adicional en los niveles celulares de ATP. Esto tendría que ser evaluado por medios que no impliquen la luciferasa de luciérnaga. Destaca el fuerte aumento de la señal de las buenas prácticas agrarias en gusanos vivos expuestos al compuesto DDD00000635. Esto se discutirá a continuación.

Figura 1. El complejo I mitocondrial inhibidor de rotenona disminuyó el estado de energía de C. elegans, medida por bioluminiscencia de PE254 cepa. gusanos etapa sincronizada L4 (, 45-46 hr después de la comida proporcionada a larvas L1) expuestos a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 mM rotenona en 1% de DMSO durante 2 hr (corto) o 24 horas (exposición larga) lecturas previas de la bioluminiscencia, respectivamente, a las 48 y 69 h de desarrollo gusano después de la comida proporcionada. Bioluminiscencia (unidad relativa Unidades de Luz, RLU) se expresó como un porcentaje del vehículo (1% DMSValores O). Las barras de error representan SEM de técnicos repeticiones a cada concentración de rotenona (n = 6). Todas las concentraciones ensayadas resultaron en una diferencia estadísticamente muy significativa en relación con el control del vehículo (p <0,001).

Figura 2. El factor de estrés oxidativo paraquat disminuyó el estado de energía de C. elegans PE254 cepa de una manera dependiente de la concentración (medida por bioluminiscencia). gusanos etapa sincronizada L4 (por conveniencia en este caso en 41 horas después de la comida proporcionada a las larvas L1) fueron expuestos a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 o 8 paraquat mM durante 24 hr. La fluorescencia de GFP (unidad unidades de fluorescencia relativa, RFU) se utilizó para normalizar los datos de bioluminiscencia (unidad RLU), ambos puntos finales obtenidos en el desarrollo 65 hr. Los datos se expresan como porcentaje de los controles (1% de DMSO). Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica(n = 5 para diferentes concentraciones; n = 18 para los controles). ANOVA de un factor: *** p <0.001 en relación con el control del vehículo.

La Figura 3. El ciclo del ácido cítrico oxalacetato intermedio (8 mM) mejoró la bioluminiscencia de C. elegans PE254 cepa. gusanos etapa Sincronizado L4 (45-46 horas después de la comida proporcionada a las larvas L1) fueron expuestos a recién preparada oxaloacetato 8 mM durante 18 h ± 30 min. La bioluminiscencia (unidad RLU) se leyó a un tiempo de desarrollo de 63,5 ± 1 hr hr y se expresó como un porcentaje del control del vehículo (ddH ₂ O). Diferentes columnas representan diferentes conjuntos de datos de 8 repeticiones técnica asignados a diferentes placas de 96 pocillos en el mismo experimento. Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica (n = 8). 2-forma ANOVA con 'set' y 'concentración' como factores: ̵6; Set 'p> 0.05,' 'p concentración <0,001 y término de interacción p> 0,05.

LA

B

Figura 4. Ensayo de las respuestas a 4 compuestos de la biblioteca de Dundee descubrimiento de fármacos compuesto ¹³ (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 y C4: DDD00023047) con conocida actividad inhibidora sobre la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga. (A) Efecto de los compuestos sobre la actividad de la luciferasa de luciérnaga purificado (medido como unidades de luz, RLU), expresada como un porcentaje de control del vehículo. El kit CLSII bioluminiscencia de ATP (Roche, Manheim, Alemania) se utilizó según las instrucciones con la misma cantidad de enzima luciferasa en alícuotas a los pocillos blanco (96-well placas de microtitulación). ATP se proporcionó a una concentración final de 10 mM y 1 l del compuesto (concentración final indicada) o se añadió DMSO (1%). Señal de luminiscencia se integró durante 10 s. Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica (n = 4). Análisis: un modelo lineal; * p <0,05 o *** p <0,001 con respecto al control del vehículo. Las diferencias entre los 25 y los 100 M altamente significativos para C1 (DDD00001434; p <0,001), y significativa para C2 y C3 (respectivamente DDD0001477 y DDD00000635; p <0,05). (B) in vivo mediciones de la bioluminiscencia, la bioluminiscencia normalizaron a la fluorescencia de GFP y GFP fluorescencia de C. elegans PE254 deformación a 67 horas el tiempo de desarrollo tras la exposición a los compuestos de ensayo durante 22 horas. Las barras de error representan SEM de repeticiones técnica (n = 8). El análisis estadístico (Una forma-ANOVA) lleva a cabo sobre los datos agrupados de 3 conjuntos de datos (3 xn = 8). * p <0,05 o *** p <0,001 con respecto al control de vehículo respectivo. Differences entre 25 y 100 mM única estadísticamente significativa (p <0,05) para la bioluminiscencia normalizado tras la exposición a C4 (DDD00023047).

Hora del día	Día 1	Dia 2	Día 3	Día 4	Día 5	Día 6	Día 7	Día 8
9-10								Paso 5
10-11								Paso 5
11-12							Etapa 4	Paso 5
12-13							Etapa 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Paso 1				Paso 3
17-18
18-19				Paso 2

Tabla 1. Descripción general de los pasos del protocolo que se lleva a cabo en cada día de los experimentos de nematodos (Sección 3) y sugirió tiempos.

Discusión

El organismo modelo C. elegans proporciona un potente sistema experimental. Es fácil a la cultura y produce abundante descendencia genéticamente idéntica con un ciclo de vida de 3,5 días de huevo a la reproducción de los adultos (a través de las etapas larvales juveniles L1 hasta L4). Debido a su pequeño tamaño, puede ser convenientemente cultivadas en placas de 96 pocillos, lo que facilita la investigación de compuestos. Se presenta un protocolo de cribado fenotípico basado en cepas de C. elegans que actúan como sensores in vivo de los niveles de energía. ¹⁴ El protocolo es aplicable a cualquier laboratorio, aunque se requiere un luminómetro placa de 96 pocillos y un gabinete estéril. Es importante para prevenir la contaminación en ensayos mediante el uso de una buena técnica de laboratorio. Si se trabaja manualmente, el número máximo de placas de nematodos alcanzable es 13 por experimento permitiendo la prueba de 2x placas de 96 pocillos de drogas y que incluye dos placas de vehículos. Los resultados representativos se presentan para el complejo I mitocondrial inhibidor rotenone, el paraquat generador de superóxido, el oxalacetato intermedio ciclo del ácido cítrico y cuatro compuestos con conocida actividad inhibidora de la luciferasa de luciérnaga. Los dos primeros compuestos condujo a una disminución en la bioluminiscencia como se predijo mientras que oxaloacetato condujo a una mejora, es probable que el resultado de una mayor generación de ATP. Los conjuntos de datos oxaloacetato también demuestran la variabilidad intrínseca en los experimentos sobre la base de la luciferasa de luciérnaga como reportero. Un mínimo de tres experimentos independientes son aconsejables para comprobar la robustez de las respuestas a los compuestos desconocidos.

La inhibición de la actividad de la luciferasa de luciérnaga era identificable con un ensayo in vitro utilizando un kit comercial. ³ Uno de los compuestos resultó en un incremento sustancial de la fluorescencia de GFP en consonancia con el inhibidor de aumentar los niveles de GFP-etiquetados luciferasa de luciérnaga mediante la unión a la de la enzima luciferasa activa sitio, y que lo hacen más estable. ¹⁵ En algunos casos(no en este caso particular) esto puede conducir a un aumento de los niveles de bioluminiscencia cuando el inhibidor se desplaza por el exceso de sustrato. ¹⁵ Es, por lo tanto, importante no interpretar los resultados erróneamente a partir de compuestos que interactúan con la enzima de luciérnaga como la disminución o el aumento de los niveles de ATP / función mitocondrial. Los cambios en la señal de luminiscencia muy a menudo se correlacionan con las mediciones adicionales de la salud tales como el movimiento, el desarrollo y el crecimiento. Como ejemplo, un compuesto es un inhibidor de la luciferasa sospechoso si se detecta una disminución dramática en la señal de bioluminiscencia pero los gusanos son indistinguibles de los controles por observación microscópica. Un aumento en la fluorescencia de GFP, no se explica por el crecimiento o autofluorescencia compuesto, también puede apuntar a un inhibidor. Una serie de inhibidores de luciferasa ¹⁵ son conocidos y se han celebrado PubChem. Por lo tanto, en primer lugar, es una buena práctica para consultar información sobre los inhibidores de la luciferasa en poder de PubChem; seguido por tresante de los efectos de compuestos en ensayos in vitro con la enzima purificada ³ y / o la confirmación de efectos sobre la función mitocondrial por medios adicionales. ^16,17

Las mediciones de fluorescencia de GFP permiten la detección de los niveles de luciferasa de luciérnaga (y la detección potencial de algunos inhibidores de la enzima luciferasa como se discutió anteriormente) hacer un caso fuerte para la medición de este parámetro junto bioluminiscencia cuando sea posible. La normalización de las lecturas de bioluminiscencia a GFP es también un medio de dar cuenta de las variaciones en los números de gusano entre los pozos (aunque esto también puede lograrse mediante la inclusión de múltiples repeticiones técnica). Para mayor sensibilidad, es importante para restar la fluorescencia de fondo de las lecturas. El protocolo evalúa la contribución de la suspensión bacteriana a la fluorescencia de fondo, sin embargo autofluorescencia nematodo no se contabiliza (una limitación del ensayo actual, particularmente crítico para cualquier Stu envejecimientomuere dado que los aumentos de autofluorescencia nematodo con la edad). Autofluorescencia de compuestos de ensayo también debe evaluarse en paralelo. Normalización GFP parece indispensable donde los investigadores desean adaptar protocolo para comparar piscinas celulares de ATP en diferentes mutantes genéticos o después de silenciamiento de genes diferentes, con el fin de controlar por cualquier cepa diferencias en el nivel de expresión del transgén bioluminiscencia.

Los parámetros críticos dentro del protocolo incluyen la etapa de desarrollo en que se inicia la exposición, la duración de la exposición, y la obtención de un número similar de nematodos en diferentes pocillos. La exposición puede comenzar en cualquier etapa del desarrollo de los nematodos, sin embargo fase L3 o es mayor preferible. A partir de este momento en adelante, los nematodos dependen de la fosforilación oxidativa para el desarrollo en la edad adulta, como lo demuestra un incremento muy significativo en el contenido de ADN mitocondrial, el consumo de oxígeno y los niveles de ATP. ^18,19,20 El presente protocolo inicia exposUre en la etapa L4. La razón de alícuotas de nematodos a placas de 96 pocillos solamente en esta etapa (en lugar de cuando se proporcionaron primero con los alimentos en la fase L1), es que, aunque las placas se colocan en cámaras húmedas para minimizar la evaporación, un grado de evaporación todavía ocurre en nuestra incubadora de agitación, visto como gotitas muy pequeñas que se forman en las tapas (esto puede no ser un problema con otras incubadoras temblorosas). Por alícuotas de nematodos a las placas justo antes de la adición de las normas de drogas, la concentración real de drogas no se ve afectada por cualquier pequeña variación en el volumen debido a la evaporación. Cargando una placa nematodo con vehículo solamente es útil para verificar que los nematodos se distribuyeron de manera uniforme entre los pozos. Las diferencias significativas encontradas para el vehículo solamente la placa sería indicativo de una mala técnica en la dispensación de los nematodos a los pozos.

La duración de la exposición es un factor importante a considerar. Si los efectos sobre el estado de la energía independientemente de crecimiento son de interés, el proprotocolo puede ser modificado para dar cabida a exposiciones más cortas (de respuestas casi inmediato a, por ejemplo, 2 h). Por otra parte, la entrada de compuestos en C. tejidos elegans puede tomar algún tiempo. Por ejemplo se requieren 12 a 24 hr para conseguir concentraciones internas máximas de resveratrol y 5-fluoro-2 'desoxiuridina (FUdR). ²¹ Por lo tanto, una exposición más larga (18 a 24 horas) puede ser justificable para maximizar los niveles de exposición. El tiempo de exposición debe limitarse a los tiempos que no permiten niveles significativos de la reproducción que tengan lugar en el pozo. Se recomienda que el tiempo de desarrollo total de nematodos se mantiene en 66 a 67 h. Aunque conveniente, nematodos están grávidas para entonces y han iniciado de postura de. Sin embargo, encontramos lecturas de bioluminiscencia a partir de preparaciones de huevo para ser insignificante (no mostrado). El impulsada expresión transgénica sur 5-promotor se detectó por primera vez sólo dos a dos y media horas después de la fertilización en la etapa de 100 células ^{22 y el} ccáscara de huevo hitinous es probable que limite la entrada de luciferina. Otros han encontrado que los huevos embrionados no contribuyeron significativamente al metabolismo de los adultos grávidas. ²³ Sin embargo, las condiciones que permitan una producción significativa descendencia deben ser evitados. Si se prefiere, la escala de tiempo experimental se puede desplazar hacia atrás: hemos iniciado con anterioridad la exposición a una toxina ambiental en la última etapa de las larvas L3 (36 h) y llevado a cabo mediciones de bioluminiscencia y las buenas prácticas agrarias a 55 hr ^{2 fondos} Alternativamente, genéticos que son condicionalmente estéril. se puede utilizar para prevenir la producción de progenie, como por ejemplo la fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV doble mutante que puede mantenerse a 15 ° C, pero es estéril a 25 ° C. ²⁴ El uso de FUDR para inducir la esterilidad no se recomienda ya que esto en sí mismo puede afectar el metabolismo de los nematodos. ²⁵ El ensayo podría también se puede realizar en las cepas con cutículas más permeables tales como parcial pérdida de función bus-8 mutantes que son-multirresistente sensible debido a aumentar la permeabilidad de las drogas. ²⁶ Esto facilitará exposiciones más cortas y las concentraciones de compuestos inferiores. Las condiciones para la adición de luciferina a estos nematodos también necesite ajustar es decir, 1% de DMSO y 0,05% de Triton-X100 en el búfer de luminiscencia puede no ser necesaria para mejorar la disponibilidad luciferina.

El protocolo utiliza 1% de DMSO como vehículo para la entrega compuesto. Aunque no es mortal, esta concentración de DMSO tiene algunos efectos biológicos como hemos discutido en una publicación anterior. ³ Muchas de las bibliotecas de drogas disponibles se preparan en DMSO al 100%, en concentraciones que sean adecuados para ensayos basados ​​en células después de la dilución del vehículo a 0,1%. Se requieren concentraciones del compuesto más altos para obtener respuestas en C. elegans, en comparación con las células humanas, de modo que a menudo no es posible llevar a cabo ensayos a menor de un 1% de DMSO. Una vez más, el uso de cepas conmás cutículas permeables pueden conducir a pruebas con menores concentraciones de vehículo. No se recomiendan concentraciones de DMSO más alto que 1%.

Un tiempo de incubación set con luciferina antes de las lecturas deben ser atendidas. Como se indica anteriormente, la luminiscencia llega a sus niveles máximos en el segundo minuto después de la adición de luciferina, permaneciendo relativamente estable durante los primeros 5 minutos, seguido de una disminución gradual lenta en la luminiscencia durante el próximo 30 min ^1. Respuestas cinéticas a una sustancia química en particular puede llevar a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos después de la distribución inicial de luciferina.

El protocolo implica una etapa de hambre después de la recogida de los huevos para conseguir la sincronización de la población de nematodos. Recomendamos la sincronización de las poblaciones de nematodos de prueba ya que diferentes etapas de desarrollo difieren en los niveles celulares de ATP y pueden responder de manera diferente a los compuestos de ensayo. Al llevar a cabo el hambre en S completamedio en comparación con M9, los nematodos incubar están provistos de una fuente de carbono (etanol), de modo que las larvas no se desarrollan completamente pero no se mueren de inanición. ^27,28 También se ha demostrado que arrestado L1 de se cebó de respuesta rápida frente a la alimentación y tasa de crecimiento normal de L1 se logra dentro de 3 horas después de la comida se convierte en disponible. ²⁹ Sin embargo, la posibilidad de que la etapa de inanición puede alterar el metabolismo de C. elegans no se puede excluir. ³⁰ Por esta razón la longitud de la inanición no debe exceder de 24 hr (18 hr es suficiente para la sincronización). Ciertos laboratorios pueden tener la posibilidad de utilizar un Biosorter Copas para la sincronización de edad sin pasar por la etapa de inanición por completo. Otros laboratorios pueden tener una preferencia por la expansión de la población de nematodos en medios sólidos (NGM placas con OP50) antes del blanqueo (paso 3.1) y esto va a funcionar bien también. Utilizamos medio S durante la exposición al compuesto como un medio estándar para el cultivo de nematodos, however otros medios de comunicación se pueden seleccionar, por ejemplo medio K o EPA moderadamente agua dura se utilizan a menudo para estudios ecotoxicológicos. ^31,32

El protocolo proporciona un medio para defender y para identificar candidatos para realizar más pruebas en cuanto a los efectos sobre la función mitocondrial. En la etapa de cribado primario es probable que algunos compuestos se han perdido debido a una sola concentración se está probando, por lo tanto, las pantallas de drogas no debe considerarse exhaustiva. Golpea pueden ser validados por el uso de técnicas para la evaluación de diferentes aspectos de la función mitocondrial para el consumo de oxígeno ejemplo, C. elegans cepas con GFP expresar las mitocondrias, las manchas de potencial de membrana mitocondrial y / o mediciones ROS. ^16,33,34 La mayor importancia de la metodología es tener un medio para el cribado de gran número de compuestos y / o las condiciones a nivel del organismo multicelular, y esto es importante ser capaz de tomar ventaja de le tratabilidad genética de C. elegans para investigar mecanismos de acción. La técnica puede ayudar a acelerar y encontrar nuevas vías para el descubrimiento de compuestos y objetivos interesantes. Se prevé que la combinación del sensor con antecedentes genéticos asociados con la enfermedad humana para el cribado de bibliotecas de compuestos en un contexto relevante enfermedad tendrá mucho que ofrecer.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orion II Microplate Luminometer	Berthold Detection Systems		with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
FLx800 fluorimeter	Biotek		with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
Ks 130 basic shaking platform	Ika	#0002980000
Innova 4349	New Brunswick Scientific		Refrigerated incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804R	Eppendorf		with eppendorf rotor A-4-44  (for 50/15 ml tubes)
Stripette, Costar	Corning	#4489	Serological pipette
Cellstar 50 ml tubes	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 ml tubes	Greiner bio-one	#188261
Cellstar 60 mm tissue culture plates	Greiner bio-one	#628160
Superfrost Microscope slides	VWR	#631-0909
Sterile spatula	Corning	#3007; #3004	for weighing out chemicals
0.22 mM Millex GP filters	Millipore	#SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 well assay plate	VWR	#3603	Black plate clear bottom with lid
Nunc 96 well assay plate	Fisher Scientific	#236105	White plate with lid
Reservoir reagent 60 ml	Thermo Scientific Finnpipette	#9510027	used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1
Storage box/damp chamber	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content	Sigma Aldrich	#239305	Store in aliquots at 4 °C,  seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil
D-Luciferin, potassium salt	Biotium Inc	# 10101-2	Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots
[header]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Purity 99.99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	Diltute to 10% in ddH2O
Nystatin	CalBiochem	#475914
C. elegans bioluminescent strains	Author's own laboratory	PE254, PE255	contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.
E. coli OP50	CGC
General chemicals	Sigma Aldrich/Fisher Scientific